緱仲軒 和鳳 李紫萱 鮑葉寧 張慶 程曦

摘要：阿維菌素是阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主結(jié)構(gòu)與米爾貝霉素相似，用于農(nóng)業(yè)害蟲防治和動物的殺蟲殺螨，還具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、消炎和醒酒等功效。它通過抑制RNA復(fù)制酶，阻止病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核以及封閉剌突蛋白等方式，阻止病毒的復(fù)制感染和傳播。已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的分枝桿菌和金黃色葡球菌也能被阿維菌素抑制。阿維菌素世界上年需求量為5000噸左右，基本由中國企業(yè)生產(chǎn)。本文回顧了阿維菌素在菌種技術(shù)、發(fā)酵技術(shù)、提取技術(shù)、制劑技術(shù)發(fā)展和組合生物學(xué)手段在本產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用，建議通過菌種篩選技術(shù)、胞壁通透性調(diào)整、途徑工程指導(dǎo)的基因改造、發(fā)酵過程的代謝流控制、氣升式發(fā)酵罐應(yīng)用及細(xì)胞融合育種來提高發(fā)酵水平，將阿維鏈霉菌與米貝霉素鏈霉菌細(xì)胞融合育種。

關(guān)鍵詞：阿維菌素；生物活性；產(chǎn)業(yè)；綜述

中圖分類號：R978.1+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research advances and the industry of avermectin

Gou Zhong-xuan1，2， He Feng1， Li Zi-xuan1， Bao Ye-ning1， Zhang Qing2， and Cheng Xi3

（1 Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College， Huaian， 223003; 2 Hebei Veyong Biochemical Co.， Ltd， Shijiazhuang? 050011;

3 Hebei Xingbai Pharmaceutical Group Co. Ltd， Shijiazhuang 051530）

Abstract Avermectin is a kind of 16-member macrolide antibiotics produced by Streptomyces avermectin fermentation， and is widely used in agricultural pest control， animal insecticidal， and acaricidal. Structurally， it is glycosylated milbemycin，and their genes of PKS （polyketide synthase） are highly homologous. Recent studies have found that avermectin also has anti-virus， anti-tumor， antibacterial， anti-inflammatory， sobriety， and other effects. Ivermectin （IVM） is effective against both Mycobacterium and Staphylococcus aureus strains. By means of inhibiting RNA helicase， preventing virus protein from entering nucleus， blocking virus spike protein， it can be used to deal with many kinds of viruses such as HIV， DENV， NDV， and so on. China is a major producer and exporter of avermectin， and the annual output is about 5000 tons. This paper reviews the development and technical progress of avermectin in China， discusses the toxicology， pharmacology， application， and industrial development of avermectin， summarizes the mechanism， application， and progress of various efficacy of avermectin， investigates the present situation of industry， and prospects the future development. It is suggested that improving the fermentation level by the method of strain screening technology， adjustment of cell wall permeability， genetic modification guided by pathway engineering， metabolic flow control in fermentation process， and application of airlift fermenter and so on. The protoplast fusion breeding of Streptomyces avermitilis and Streptomyces milbemycin strains may improve the strain level and produce new antibiotics.

Key words Avermectin; Biological activity; Industry; Review

阿維菌素（avermectin）是一類由阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。1974 年日本北里研究所大村智從土壤樣品中分離得到一株放線菌，其發(fā)酵提取液具有殺滅線蟲作用。在Merk公司的努力下，1981年實現(xiàn)了阿維菌素的產(chǎn)業(yè)化。因為阿維菌素的發(fā)現(xiàn)，日本大村智與威廉·坎貝爾分享了2015年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎獎金的1/2（中國科學(xué)家屠呦呦教授因發(fā)現(xiàn)抗瘧藥青蒿素而獲得獎金的另1/2）。1984年上海市農(nóng)藥研究所分離出產(chǎn)阿維菌素的菌株，并在海門制藥廠產(chǎn)業(yè)化。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)1986 年開始研究阿維菌素的研究，后與齊魯制藥廠合作實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化?，F(xiàn)在全球阿維菌素年需求量大約5000T，全部由中國企業(yè)生產(chǎn)。筆者自 2006 年起專注于阿維菌素研究，并綜述了當(dāng)時阿維菌素產(chǎn)業(yè)概況[1]。十余年來，阿維菌素技術(shù)發(fā)展迅速，許多新的生物活性也不斷地被發(fā)現(xiàn)。筆者在多年的研究的基礎(chǔ)上通過業(yè)內(nèi)調(diào)查與文獻(xiàn)調(diào)研，對阿維菌素的研究及產(chǎn)業(yè)進(jìn)行綜述。

1 阿維菌素家族

1.1 阿維菌素與殺蟲抗螨類化合物

阿維菌素并不是最早發(fā)現(xiàn)的天然殺蟲抗生素。1958年發(fā)現(xiàn)吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopius）產(chǎn)生的潮霉素B和1967年發(fā)現(xiàn)的米爾貝霉素（milbemycin）都具有殺蟲與殺螨作用，阿維菌素閃亮登場之后，很快成為殺蟲殺螨的主角。值得注意的是，米爾貝霉素結(jié)構(gòu)與阿維菌素高度相似（圖 1），阿維菌素可以說是糖基化的米爾貝霉素[2]。近年來兩者的姻親關(guān)系受到關(guān)注，通過組合生物學(xué)，重組兩種菌的相關(guān)基因，可直接發(fā)酵生產(chǎn)依維菌素[3]。

1.2 阿維菌素系列產(chǎn)品

以阿維菌素為母體進(jìn)行修飾與改造，得了許多高效、低毒的產(chǎn)品。已經(jīng)商品化的產(chǎn)品有依普菌素（Eprinomectin，EPM）、?，斁兀‥mamectin，EMM）、道拉菌素（Doramectin，DRM）、依維菌素（Ivermectin，IVM）和 塞拉菌素（selamectin，SLM）等（圖2）。阿維菌素分子中齊墩果糖C4''位的改造產(chǎn)生了埃瑪菌素和依普菌素。?，斁貙匮獎游锏亩拘愿?，水溶性更好，對鱗翅目害蟲特效。C4''引入乙酰氨基，即為依普菌素，乙酰氨基引入后，改變了藥物在牛乳和血清中的分配比例，使得牛乳中的殘留更低，更安全。阿維菌素C22與23位雙鍵加氫即為依維菌素，依維菌素急性口服毒性更低、藥效期更長、生物利用度更高、穩(wěn)定性更好、活性更強。道拉菌素是利用基因突變生物合成的，它在阿維菌素C25位連接了環(huán)己烷基，具有更廣的驅(qū)蟲譜，對多種家畜寄生線蟲有很高的防效，遠(yuǎn)優(yōu)于依維菌素。2014年，海正藥業(yè)對阿維菌素產(chǎn)生菌和米爾貝霉素生產(chǎn)菌基因改造，得到一株可發(fā)酵生產(chǎn)天維菌素（Tenvermectin）的新菌株。天維菌素對朱砂葉螨、小菜蛾、粘蟲和松材線蟲等的殺滅性更優(yōu)。以上的衍生物主要以阿維菌素B1a為出發(fā)化合物進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造，近年來發(fā)現(xiàn)阿維菌素B2a的殺蟲活性優(yōu)于B1a，且對溫血動物的毒性低于B1a，因而進(jìn)行了農(nóng)藥登記[4]。

2 阿維菌素的生物活性研究

2.1 阿維菌素的殺蟲抗螨活性

阿維菌素最初是以殺蟲劑的形式商業(yè)化的，因產(chǎn)品由B1a（占80%）和B1b（占20%）構(gòu)成，故英文名稱為abamectin。與傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，abamectin殺蟲活力強，易于分解，農(nóng)藥殘留低，對環(huán)境的危害小。 阿維菌素家族中的依維菌素對服用者的急性口服毒性低、藥效期更長，因而成為廣譜獸用殺蟲劑與人用抗寄生蟲藥。瘧疾是由蚊子攜帶的瘧原蟲傳播的一種疾病，瘧原蟲生活周期復(fù)雜，常常產(chǎn)生抗藥性。依維菌素可殺滅按蚊，阻止了瘧疾傳播[5]，它還能阻止寄生蟲侵入肝臟，降低血液的瘧原蟲濃度，用于瘧疾治療[6]，動物實驗表明，依維菌素治療中會有輕微的神經(jīng)毒性反應(yīng)[7]。

2.2 阿維菌素的抗菌活性

過去認(rèn)為阿維菌素不過是一種殺蟲劑，對微生物不起作用。2013年人們發(fā)現(xiàn)，阿維菌素居然對已產(chǎn)生抗藥性的兩種分枝桿菌有抑制作用[8]，其殺菌機(jī)理是通過分枝桿菌特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)而起作用。阿維菌素的殺菌性能受到甘油的影響，有甘油存在的情況下，塞拉菌素、莫西菌素（moxidectin）和道拉菌素對分枝桿菌的活性大大地降低，而依維菌素受甘油的影響比較小[9]。菌膜的形成能夠增強金黃色葡萄球菌的耐藥性，對金黃色葡萄球菌引起的疾病治療帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)，而依維菌素對金黃色葡萄球菌菌膜有良好的殺滅作用[10]。青霉素是最古老的一種抗生素，由于長期的使用，青霉素耐藥菌成為一個棘手的問題，而依維菌素能抑制對甲氧基青霉素已有抗藥性的金黃色葡萄球菌[11]。這些發(fā)現(xiàn)有可能開拓阿維菌素的臨床應(yīng)用，為新型抗菌藥開發(fā)提供參考。

2.3 皮膚消炎活性

阿維菌素消炎活性研究最多的是依維菌素，它的消炎活性使得阿維菌素可能被開發(fā)成為一種皮膚消炎藥。T細(xì)胞引起的皮膚發(fā)炎中，由于肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放化學(xué)物質(zhì)，作用于附近的毛細(xì)血管，導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增大，局部組織血流量增多，致使傷口周圍出現(xiàn)紅腫熱的現(xiàn)象，即炎癥反應(yīng)，而依維菌素能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的免疫活性，消除炎癥反應(yīng)[12]。小鼠動物實驗表明，外用依維菌素可以延緩皮膚粉塵螨導(dǎo)致的過敏炎癥的發(fā)生[13]。

2.4 抗病毒活性

阿維菌素的抗病毒機(jī)理（圖3）所示。阿維菌素能夠抑制RNA解旋酶，阻止了RNA病毒的復(fù)制，因而能夠用于治療許多RNA病毒相關(guān)的疾病。以黃熱病毒為例，它會引起登革熱、黃熱病和蜱型腦炎等疾病。為了篩選出對抗黃熱病毒的藥物，人們從Kunjing病毒NS3 helicase中發(fā)現(xiàn)了一個新的解旋蛋白位點，而依維菌素恰恰能與這個位點結(jié)合，從而阻止了病毒 RNA 的復(fù)制[14]。病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核是其感染復(fù)制的重要一環(huán)，依維菌素 能夠阻止病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，因而抑制病毒的傳播。以HIV-1和登革熱病毒為例，依維菌素能夠抑制運輸?shù)鞍爪?β介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致病毒蛋白滯留在細(xì)胞膜與核之間，從而抑制了HIV-1和登革熱病毒的復(fù)制[15]。新城雞瘟病毒（NDV）的防治中發(fā)現(xiàn)，50 μg/mL 的依維菌素就具有細(xì)胞毒性，而對病毒最有效的抑制濃度是100 μg/mL以上[16]，這意味著要用于NDV臨床，依維菌素還需要進(jìn)行某些改進(jìn)。對于登革熱病毒，依維菌素可以在任何一道傳播途徑上阻止蚊子來傳播病毒[17]，這使得依維菌素有可能成為一種有效預(yù)防與治療登革熱病的藥物。 SARS-CoV-2病毒能引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（SARS），依維菌素有可能成為一種治療藥物[18]。2020年3月6日，法國一名66歲女士因疥瘡住院。醫(yī)院順理成章地使用了依維菌素（400和200 μg/kg的劑量）進(jìn)行治療。該患者3月25日SARS-CoV-2基因檢測為陽性，4月7日就轉(zhuǎn)陰。SARS-CoV-2傳染性強，且60歲以上的老人為高危高死亡率人群，但該患者不僅自己很快地轉(zhuǎn)為陰性，且其密切接觸者均為陰性，這可能與她恰好使用依維菌素有關(guān)[19]。依維菌素具有廣譜抗病毒活性，可抑制SARS-CoV-2感染，把病毒的感染率降低5000倍[20]。依維菌素氣霧劑可能是一種治療與預(yù)防新冠病毒的新方法[21]。依維菌素抑制SARS-CoV-2的機(jī)理尚不明確，一種推測是依維菌素能阻止病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。大多數(shù)的RNA 病毒在感染時依賴于核質(zhì)運輸載體IMPα/β，而依維菌素能阻止其進(jìn)入細(xì)胞核并啟動抗病毒響應(yīng)。另一種機(jī)制是通過轉(zhuǎn)膜受體CD147起作用。CD147和ACE-2 是 SARS-CoV-2剌突蛋白結(jié)合位點。當(dāng)SARS-CoV-刺突蛋白結(jié)合到CD147與ACE-2靶點時依維菌素可以封閉住病毒的刺突蛋白，從而阻斷了病毒的感染[22]。

2.5 阿維菌素的抗腫瘤活性

抗腫瘤活性使得阿維菌素有可能重新定位為一種抗腫瘤藥[23]。實驗表明，依維菌素對白血病、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)腸癌等均有效果。阿維菌素的抗腫瘤機(jī)理是多樣的（表1）。 Didier等[24]發(fā)現(xiàn)依維菌素可以抑制MDR，從而幫助抗腫瘤藥物更好地發(fā)揮功效。另外，依維菌素在極低濃度下就可以誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞的死亡，抑制了小鼠腫瘤的生長。依維菌素的作用靶點是線蟲的氯離子通道，因而Sharmeen等[22]研究了依維菌素對白血病細(xì)胞氯離子流的影響，發(fā)現(xiàn)依維菌素提高了胞間氯離子濃度，導(dǎo)致細(xì)胞膜的超極化，細(xì)胞變大。依維菌素能抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和HBMEC細(xì)胞Akt、mTOR 和核糖體S6的磷酸化， 說明其在Akt/mTOR pathway 的失活過程中具有抑制作用。

2.6 解酒作用

阿維菌素家族中的塞拉菌素、阿維菌素B1a、依維菌素和莫西菌素均具有解酒作用[34]。它一是降低了酒精的吸收，二是降低了大腦中的酒精濃度。實驗發(fā)現(xiàn)，依維菌素在1.25～10 mg/kg的劑量可以減少酒精的吸收[35]。酒精濫用（alcohol use disorders， AUDs）在美國的致病率與致死率排名榜上排名第三，影響著180萬人的健康，每年有10萬人死于AUD，阿維菌素為這些癮君子帶來了健康的希望。

2.7 阿維菌素的毒性與副作用

與大多數(shù)藥物一樣，阿維菌素也存在副作用。研究依維菌素對肝巨噬細(xì)胞影響時發(fā)現(xiàn)，伊維菌素對肝巨噬細(xì)胞的吞噬功能無影響，但阻斷了LPS誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子、NO和前列腺素E2的分泌，增加了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[36]。過量攝入阿維菌素會引起呼吸衰竭、血壓升高與昏迷，處理不及時則會引起死亡[37]。阿維菌素藥性發(fā)作時首先表現(xiàn)為過度興奮，肌肉與身體不受控制地抖動，然后機(jī)能失調(diào)、昏迷。動物的P-糖蛋白受損會增強AVM的毒性。阿維菌素中依維菌素的副作用最小，且持續(xù)時間短。慢性毒性試驗研究表明阿維菌素B1a最小作用量為0.25 mg/kg，致畸率的最小作用劑量為0.4 mg/kg·d。依維菌素的神經(jīng)毒性在小鼠身上表現(xiàn)為代謝失調(diào)、行動遲緩、眼瞼下垂，表現(xiàn)在狗身上是多涎、失調(diào)、失明、昏迷、呼吸受損、震顫、瞳孔散大、厭食和死亡。幼鼠對依維菌素的毒性更敏感，一是因為幼鼠的腦血屏障弱，二是因為幼鼠缺少P-糖蛋白。對狗而言，MDR1基因變異的狗對依維菌素的神經(jīng)毒性更敏感，因為該基因的變異導(dǎo)致P-糖蛋白合成受到影響。

3 阿維菌素的生產(chǎn)技術(shù)

3.1 阿維菌素生物合成途徑

阿維菌素的生物合成機(jī)理已經(jīng)比較清晰，國內(nèi)文獻(xiàn)也有很好的綜述[38]。簡而言之，這是一個多步驟的酶促合成反應(yīng)，前體物質(zhì)是Val和Ile。其PKS的合成途徑與紅霉素、米爾貝霉素的合成過程非常相似，即首先在PKS酶催化下，乙酸鹽、丙酸鹽和支鏈脂肪酸起始單元依次聚合形成聚酮鏈，聚酮鏈內(nèi)酯鍵環(huán)化形成起始糖苷配基。再經(jīng)過一系列修飾轉(zhuǎn)化為阿維菌素糖苷配基。最后再經(jīng)糖基化修飾完成阿維菌素的生物合成。如圖4所示，阿維菌素生物合成基因簇全長82 kb，共有18個開放讀碼框，米爾貝霉素的合成基因短一些，排列方向也與阿維菌素不同。這些基因的基本功能已經(jīng)明確。aveA1-4 編碼 PKS酶，aveB1-8編碼糖基化相關(guān)的酶。米爾貝霉素沒有糖基化，因而也沒有B基因。阿維菌素起始?；D(zhuǎn)移酶（AveAT0）能夠以2-甲基丁酰-輔酶A和異丁酰-CoA作為起始單元分別合成“a”系列或“b”系列的阿維菌素。不同的起始?；D(zhuǎn)移酶識別不同的底物，通過這些?；D(zhuǎn)移酶序列比對，找到了AveAT0底物結(jié)合重要的氨基酸，為改造阿維菌素聚酮合酶?；D(zhuǎn)移酶提供了依據(jù)[39]。

3.2 菌種技術(shù)

利用自然育種與誘變育種推動阿維菌素菌種進(jìn)步的工作一直都在進(jìn)行，誘變方法有NTG、紫外線、太空誘變[40]、重離子束、Co60-γ射線[41]等。邢新會教授研發(fā)的常壓常溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)也在阿維菌素育種中進(jìn)行了應(yīng)用[42]。江南大學(xué)集成 Qpix420微生物篩選系統(tǒng)、自動化移液工作站和酶標(biāo)儀多孔板檢測等技術(shù)，建立了高通量篩選方法[43]，值得關(guān)注。高弘等[44]用96孔板代替搖瓶進(jìn)行菌株的快速篩選與發(fā)酵，提高了篩選效率。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)鏈霉菌時，抗生素開始大量合成發(fā)生在從基質(zhì)菌絲向氣生菌絲生長階段；而在液體培養(yǎng)中抗生素合成則發(fā)生在從指數(shù)生長期過渡到穩(wěn)定生長期階段。程曦通過HPLC測定了平板上的菌落效價與搖瓶效價，發(fā)現(xiàn)二者高度相關(guān)，并建立了快速篩選方法[45]。鏈霉菌次級代謝產(chǎn)生抗生素的過程，受到了一系列外界營養(yǎng)環(huán)境信號和生理信號的復(fù)雜調(diào)控。阿維菌素的合成基因受aveR的調(diào)控，而aveR則被σhrdB識別與激活，將hrdB基因進(jìn)行反向生物工程，成功地提高了阿維菌素產(chǎn)量[46]。

依維菌素傳統(tǒng)工藝是將阿維菌素B1a精品在反應(yīng)釜中催化加氫而產(chǎn)生的，現(xiàn)在通過組合生物合成技術(shù)學(xué)，可直接由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生依維菌素。2003年Gaisser等[47]最早報道了工程設(shè)計PKS的重組菌株具有直接合成依維菌素的能力，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)用不同的技術(shù)路線也構(gòu)建了直接合成依維菌素的菌株[3]。米爾貝霉素是與阿維菌素結(jié)構(gòu)類似的殺蟲藥物，用來自冰城鏈霉菌米爾貝霉素PKS模塊2的DH-ER-KR替換aveDH2-KR2的新菌株可直接發(fā)酵生產(chǎn)依維菌素，其效價可達(dá)3450 μg/mL[2]。

3.3 發(fā)酵技術(shù)

阿維菌素的發(fā)酵進(jìn)展主要體現(xiàn)在發(fā)酵品種增加、

發(fā)酵效價提高，發(fā)酵罐容積擴(kuò)大，其核心是提高產(chǎn)能，降低成本。阿維菌素剛剛投入生產(chǎn)時，發(fā)酵后提取的也是阿維菌素8種成份的混和物，當(dāng)時也是用總效價來衡量發(fā)酵水平。20多年來，發(fā)酵罐容積從70 t發(fā)展到500 t，發(fā)酵單位從200單位到6000單位，發(fā)酵時間從當(dāng)初的50 h發(fā)展到360 h。阿維菌素發(fā)酵使用的是機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐，LIGHGTINA315 和CD-6的組合攪拌裝置最有利于菌體形成致密的菌絲團(tuán)，利于阿維菌素的發(fā)酵[48]。阿維鏈霉菌的生長溫度與產(chǎn)素溫度并不完全相同，趙樂等[49]采用變溫控制來改善發(fā)酵效率，結(jié)果發(fā)酵液平均效價提高18.7%。阿維菌素發(fā)酵過程存在著泡沫問題，影響裝液量，并可能造成染菌。企業(yè)常用的消泡方法是化學(xué)法（豆油或泡敵等）和物理法（耙式消泡槳）。一種基于泡沫旋風(fēng)分離與發(fā)酵尾氣再回收相結(jié)合原理的新型阻沫回收分離器的應(yīng)用，使得裝料體積增加22.47%[50]。程曦等[51]研究了生產(chǎn)線上發(fā)酵罐的最佳液位，發(fā)現(xiàn)液位控制在96%，并控制好合適的風(fēng)量，發(fā)酵效價最高可達(dá)6758 μg/g。通過補料技術(shù)控制pH與糖濃度可以提高發(fā)酵的水平，李永亮[52]優(yōu)化了補料技術(shù)，使產(chǎn)能提高了28%以上。阿維菌素發(fā)酵過程中還常常采用帶放工藝，它提高了設(shè)備產(chǎn)能，增加阿維菌素發(fā)酵放罐體積[34]。筆者曾在某企業(yè)偶遇發(fā)酵罐軸故障。該罐僅靠無菌空氣來維持傳質(zhì)，但其發(fā)酵單位并不低于其它正常攪拌的發(fā)酵罐，因而氣升式發(fā)酵罐可能更適合于阿維菌素的發(fā)酵。

3.4 提取純化技術(shù)

阿維菌素發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過升溫滅活、過濾、閃蒸、浸提、濃縮、高溫水洗殘?zhí)?、活性碳脫色、結(jié)晶等步驟，最后得到阿維菌素B1a的粗品（圖5）。阿維菌素菌絲體提取過程中也有用超聲波來提高浸提效率的研究，超聲波循環(huán)提取設(shè)備的一次提取率可高達(dá)96％以上[54]。也有改進(jìn)溶劑用超聲波輔助直接從濕菌絲體浸提阿維菌素的新工藝[55]，但未見投入應(yīng)用。粗品二次溶解后，再結(jié)晶得到阿維菌素的精品。二次晶的質(zhì)量直接決定著最終產(chǎn)品的質(zhì)量，企業(yè)對于這一步工藝實行嚴(yán)格的保密措施，因而重結(jié)晶技術(shù)的公開報道并不多見。中科院過程所分離科學(xué)與工程實驗室曾公開報道了阿維菌素重結(jié)晶技術(shù)研究成果，值得借鑒與參考[56]。

4 阿維菌素的應(yīng)用

4.1 農(nóng)藥的應(yīng)用

阿維菌素是高毒農(nóng)藥，無致畸、致癌、致突變作用，內(nèi)吸性不佳，觸殺毒性一般。好在它對葉片具有很強的滲透性，噴灑到植物上后，作物會吸收藥劑，使藥液遍布整株作物。這樣害蟲吃后會中毒死亡，同時它還能抑制新生的幼蟲潛入葉內(nèi)?，F(xiàn)主要用于蔬菜、水稻、棉花、茶樹、果樹以及園林花卉的殺蟲、殺螨。隨著阿維菌素的應(yīng)用，害蟲的抗藥性隨之產(chǎn)生，因而建議聯(lián)合用藥。制劑技術(shù)可以提高阿維菌素的藥效，制劑的發(fā)展方向是水基化、超微化、無粉塵、控制釋放。

阿維菌素對哺乳動物的繁殖能力具有毒性作用，中毒后沒有特效解毒藥物，只能采取吸氧、洗胃、補液、利尿等措施。因而，國際上對阿維菌素的 MRL（maximum residue limit）要求非常嚴(yán)格。阿維菌素對光敏感，C8-C9和C10-C11位的雙鍵會吸收紫外線能量而分解破壞。阿維菌素還易于被土壤吸附，不易被雨水沖刷和下滲，因而對水質(zhì)影響不大。

4.2 獸藥的應(yīng)用

1981年美國Merk公司把阿維菌素作為獸藥投入市場，用做家畜驅(qū)蟲劑與寵物用藥，治療多種家畜體內(nèi)外寄生蟲病。阿維菌素是脂溶性藥物，無論是口服、皮下注射、還是腸道給藥，均吸收良好，并分布至全身各組織，能充分地發(fā)揮其驅(qū)蟲殺蟲效果。單就吸收速率而言，口服效果明顯比皮下注射快。但皮下注射在體內(nèi)持效時間長，所以生物利用度比口服高。常用的有依維菌素、道拉菌素和乙酰氨基阿維菌素等[57]。由于阿維菌素的脂溶性，在動物體內(nèi)存留時間長，使用阿維菌素產(chǎn)品的肉食飼養(yǎng)動物屠宰前的休藥期更長。

4.3 人用藥的應(yīng)用

阿維菌素的殺蟲殺螨功能在人用藥方面已有應(yīng)用。依維菌素在1988年首先成功地用于治療盤尾蟲病和淋巴絲蟲病[58]，后來還用于治療線蟲感染、蛔蟲和皮膚寄生蟲病。對登革熱、瘧疾疫區(qū)而言，阿維菌素是一種有效的藥物[59]。因為它的抗腫瘤、消炎、抗病毒作用，未來有可能以阿維菌素為先導(dǎo)化合物，開發(fā)出更多的抗腫瘤藥物、皮膚過敏消炎藥物、抗病毒藥物等，可能會推動基于阿維菌素的SARS-CoV-2的抑制藥物的研發(fā)。由于阿維菌素對HIV的抑制作用，也可能應(yīng)用于艾滋病雞尾酒療法中。

5 阿維菌素的產(chǎn)業(yè)展望

5.1 生產(chǎn)企業(yè)與產(chǎn)能

阿維菌素主要產(chǎn)自中國。中國現(xiàn)在有10余家企業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素，產(chǎn)能充足。2010 年4月，中國13家阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)成立了阿維菌素產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟，希望通過產(chǎn)能控制與技術(shù)協(xié)作來保護(hù)阿維菌素產(chǎn)業(yè)，相約輪流做東每年召開一次年會，遺憾的是該年會只持續(xù)了兩屆。阿維菌素產(chǎn)品協(xié)作組是由中國農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會組織的，一直在運轉(zhuǎn)與協(xié)作交流。主要的阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)如表2所示，阿維菌素原藥主要來自于表2中的前五家。2018年12月，河北省批準(zhǔn)成立了河北省阿維菌素生物技術(shù)重點實驗室，依托單位是河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司，相信在科技的支持下，阿維菌素產(chǎn)業(yè)會不斷地茁壯成長。

5.2 市場需求與價格

阿維菌素B1a原料一部分用于依維菌素、甲維鹽的合成，一部分用于農(nóng)藥制劑的配制。其價格受市場與病蟲害的影響很大，阿維菌素B1a精品一般在500～1200 元/kg之間，最低價500元基本是企業(yè)的保本線。國內(nèi)阿維菌素產(chǎn)品的第一出口國是美國，占出口量的30%以上。阿維菌素的需要量受自然因素影響比較大，即使在避光的情況下，阿維菌素原料藥長期貯存過程中也會緩慢分解，影響產(chǎn)品質(zhì)量。因而，阿維菌素企業(yè)不可能通過大量地生產(chǎn)與貯存阿維菌素來對抗市場風(fēng)險，現(xiàn)行的做法是生產(chǎn)其它的發(fā)酵品種來抵御市場風(fēng)險。

5.3 展望與研究建議

放線菌所產(chǎn)抗生素的90%由鏈霉菌產(chǎn)生，鏈霉菌中研究最為透徹的菌株是天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和阿維鏈霉菌，這3株菌的全基因組測序已經(jīng)完成，為后續(xù)的基因改造鋪平了道路。預(yù)計未來阿維鏈霉菌可作為一個宿主菌來生產(chǎn)越來越多的抗生素。例如端粒酶抑素是一種抗腫瘤物質(zhì)，本由 Streptomyces annulatusv發(fā)酵生產(chǎn)，2017年通過轉(zhuǎn)基因改造后，由Streptomyces avermitilis生產(chǎn)[60]。

對于阿維菌素發(fā)酵技術(shù)的提升給出以下建議： ①改變細(xì)胞通透性來提高阿維菌素物發(fā)酵水平。阿維菌素是一種胞內(nèi)產(chǎn)物，大量積累會反饋影響發(fā)酵水平。通過特殊控制方法來改變細(xì)胞通透性，使阿維菌素部分分泌到細(xì)胞外，消除反饋抑制，很有可能提高阿維菌素的產(chǎn)量。②在菌種的篩選過程中，向固體培養(yǎng)基中加入阿維菌素，篩選耐受高濃度阿維菌素的菌株。加入阿維菌素發(fā)酵液，篩選對阿維菌素代謝產(chǎn)物有耐受性的菌株。通過加入阿維菌素前體來推理育種，篩選高產(chǎn)菌株。③借鑒天藍(lán)色鏈霉菌的次級代謝調(diào)控研究成果[61]，對阿維鏈霉菌進(jìn)行基因改造。鏈霉菌次級代謝具有一定的復(fù)雜性，簡單的代謝途徑基因改造往往不能奏效。以天藍(lán)色鏈霉菌為對象的次級代謝調(diào)控取得了很多的進(jìn)展，借鑒這些調(diào)控機(jī)制來改造阿維鏈霉菌基因可能會事半而功倍。④利用多參數(shù)在線傳感器監(jiān)控代謝過程的代謝流的變化，通過營養(yǎng)成份與理化指標(biāo)的控制來調(diào)整代謝流，提升阿維菌素的產(chǎn)量。⑤在發(fā)酵設(shè)備上，建議研究氣升式發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行阿維菌素的生產(chǎn)。阿維鏈霉菌對剪切力敏感，機(jī)械攪拌對菌絲球破壞較大，而氣升式發(fā)酵罐剪切力小，可能更適合阿維鏈霉菌發(fā)酵。⑥化學(xué)結(jié)構(gòu)上米爾貝霉素與阿維菌素高度相似，也都是鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的。因此建議把阿維鏈霉菌與Streptomyces milbemycinicus進(jìn)行細(xì)胞融合育種，這樣有可能提高阿維菌素或米爾貝霉素的產(chǎn)量，也有可能篩選出新的抗生素品種。

阿維菌素的替代品種是多殺菌素，由美國陶氏益農(nóng)公司生產(chǎn)，與阿維菌素相比，多殺菌素是低毒的生物殺蟲劑，適合無公害蔬菜、水果生產(chǎn)應(yīng)用，目前還不能完全取代阿維菌素。而阿維菌素在抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性的發(fā)現(xiàn)必然促使阿維菌素的重新定位，相信未來的阿維菌素產(chǎn)品會更豐富，應(yīng)用會更廣泛。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]緱仲軒. 阿維菌素產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與展望[J]. 農(nóng)化新世紀(jì)， 2007， 12： 20-1.

[2]Zhang J， Yan Y J， An J， et al. Designed biosynthesis of 25-methyl and 25-ethyl ivermectin with enhanced insecticidal activity by domain swap of avermectin polyketide synthase[J]. Microb Cell Fact， 2015， 14（1）： 152.

[3]Li M， Chen Z， Lin X， et al. Engineering of avermectin biosynthetic genes to improve production of ivermectin in Streptomyces avermitilis[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2008， 18（20）： 5359-5363.

[4]Fangfang H， Huan L， Jiao L， et al. Synthesis， bioactivities and 3D-QSAR of novel avermectin B2a aglycon derivatives[J]. Chinese Chemical Letters， 2020， 31（1）： 141-144.

[5]Dhiman S. Correction to： Are malaria elimination efforts on right track？ An analysis of gains achieved and challenges ahead[J]. Infect Dis Poverty， 2019， 8（1）： 19.

[6]Slater H C， Foy B D， Kobylinskik K， et al. Ivermectin as a novel complementary malaria control tool to reduce incidence and prevalence： A modelling study[J]. Lancet Infect Dis， 2020， 20（4）： 498-508.

[7]Chaccour C， Rabinovich N R. Ivermectin to reduce malaria transmission III. Considerations regarding regulatory and policy pathways[J]. Malar J， 2017， 16（1）： 162.

[8]Lim L E， Vilcheze C， NG C， et al. Anthelmintic avermectins kill Mycobacterium tuberculosis， including multidrug-resistant clinical strains[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2013， 57（2）： 1040-1046.

[9]Miro-Canturri A， Ayebre-Algaba R， Smani Y. Drug repurposing for the treatment of bacterial and fungal infections[J]. Front Microbiol， 2019， 10（1）： 41.

[10]Torrens N S， Abercrombie J J， Srinivasan A， et al. Screening a commercial library of pharmacologically active small molecules against Staphylococcus aureus biofilms[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2016， 60（10）： 5663-5672.

[11]Ashraf S， Chaudhry U， Raza A， et al. In vitro activity of ivermectin against Staphylococcus aureus clinical isolates[J]. Antimicrob Resist Infect Control， 2018， 27（7）： 1-6.

[12]Norenberg W， Sobottka H， Henpel C， et al. Positive allosteric modulation by ivermectin of human but not murine P2X7 receptors[J]. Br J Pharmacol， 2012， 167（1）： 48-66

[13]Ventre E， Rozieres A， Lenief V， et al. Topical ivermectin improves allergic skin inflammation[J]. Allergy， 2017， 72（8）： 1212-1221.

[14]Eloise M， Margherita P， Tine D B， et al. Ivermectin is a potent inhibitor of flavivirus replication specifically targeting NS3 helicase activity： New prospects for an old drug[J]. J Antimicrob Chemother， 2012， 67（8）： 1884-1894.

[15]M W K， Haran S， M H S， et al. Ivermectin is a specific inhibitor of importin α/β-mediated nuclear import able to inhibit replication of HIV-1 and dengue virus[J]. The Biochemical journal， 2012， 443（3）： 851-856.

[16]Sidra A， Muhammad A， Adil R M， et al. Evaluation of cytotoxicity and antiviral activity of ivermectin against Newcastle disease virus[J]. Pak J Pharm Sci， 2015， 28（2）： 597-602.

[17]Xu T-L， Han Y， Liu W， et al. Antivirus effectiveness of ivermectin on dengue virus type 2 in Aedes albopictus[J]. PLOS Neglect Trop Dis， 2018， 12（11）： 1-14.

[18]Anastasiou I A， Eleftheriadou I， Tentoloutris A， et al. In vitro data of current therapies for SARS-CoV-2[J]. Curr Med Chem， 2020， 27（27）： 4542-4548.

[19]Bernigaud C， Guillemot D， Ahmed -Beiklacea A， et al. Oral ivermectin for a scabies outbreak in a long-termcare facility： Potential value in preventing COVID-19 and associated mortality？[J]. Br J Dermatol， 2021， 1（1）： 1-14.

[20]Caly L， Druce J D， Catton M G， et al. The FDA-approved drug ivermectin inhibits the replication of SARSCoV-2 in vitro[J]. Antiviral Res， 2020， 178（6）： 104787.

[21]Mittal N， Mittal R. Inhaled route and anti-inflammatory action of ivermectin： Do they hold promise in fighting against COVID-19[J]？ Med Hypotheses， 2021， 146（1）： 110364.

[22]Kaur H， Shekhar N， Sharma S， et al. Ivermectin as a potential drug for treatment of COVID-19： An in-sync review with clinical and computational attributes[J]. Pharmacol Rep， 2021， 1（1）： 1-14.

[23]Juarez M， Schcolnik-Cabrera A， Duenas-Gonzalez A. The multitargeted drug ivermectin： From an antiparasitic agent to a repositioned cancer drug[J]. Am J Cancer Res， 2018， 8（2）： 317-331.

[24]Didier A， Loor F. The abamectin derivative ivermectin is a potent P-glycoprotein inhibitor[J]. Anticancer Drugs， 1996， 7（7）： 745-751

[25]Sharmeen S， Skrtic M， Sukhai M A， et al. The antiparasitic agent ivermectin induces chloride-dependent membrane hyperpolarization and cell death in leukemia cells[J]. Blood， 2010， 116（18）： 3593-3603.

[26]Liu Y， Fang S， Sun Q， et al. Anthelmintic drug ivermectin inhibits angiogenesis， growth and survival of glioblastoma through inducing mitochondrial dysfunction and oxidative stress[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2016， 480（3）： 415-421.

[27]Draganov D， Gopalakrishna-Pillai S， Chen Y R， et al. Modulation of P2X4/P2X7/Pannexin-1 sensitivity to extracellular ATP via Ivermectin induces a non-apoptotic and inflammatory form of cancer cell death[J]. Sci Rep， 2015， 5： 16222.

[28]Dou Q， Chen H N， Wang K， et al. Ivermectin induces cytostatic autophagy by blocking the PAK1/Akt axis in breast cancer[J]. Cancer Res， 2016， 76（15）： 4457-4469.

[29]Takahashi K， Suzuki K. Membrane transport of WAVE2 and lamellipodia formation require Pak1 that mediates phosphorylation and recruitment of stathmin/Op18 to Pak1-WAVE2-kinesin complex[J]. Cell Signal， 2009， 21（5）：? 695-703

[30]Melotti A， Mas C， Kuciak M， et al. The river blindness drug Ivermectin and related macrocyclic lactones inhibit WNT-TCF pathway responses in human cancer[J]. EMBO Mol Med， 2014， 6（10）： 1263-1278.

[31]Kwon Y J， Petrie K， Leibovitch B A， et al. Selective inhibition of SIN3 corepressor with avermectins as a novel therapeutic strategy in triple-negative breast cancer[J]. Mol Cancer Ther， 2015， 14（8）： 1824-1836.

[32]Yin J. DEAD-box RNA helicase DDX23 modulates glioma malignancy via elevating miR-21 biogenesis[J]. Brain， 2015， 138（Pt 9）： 2553-2570.

[33]Juarez M， Díaz-Chávez J， Gonzalez-Fierro A， et al. Ivermectin as an inhibitor of cancer stemlike cells[J]. Mol Med Rep， 2018， 17（2）： 3397-3403.

[34]Jakowec M W， Warnecke A M P， Huynh N， et al. Preclinical evaluation of avermectins as novel therapeutic agents for alcohol use disorders[J]. Psychopharmacology， 2018， 235（6）： 1697-709.

[35]Asatryan L， Yardley M M， Khoja S， et al. Avermectins differentially affect ethanol intake and receptor function： Implications for developing new therapeutics for alcohol use disorders[J]. Int J Neuropsychopharmacol， 2014， 17（6）： 907-916.

[36]Viktorov A V， Yurkiv V A. Effect of ivermectin on function of liver macrophages[J]. Bull Exp Biol Med， 2003， 136（6）： 569-571.

[37]Yang C C. Acute human toxicity of macrocyclic lactones[J]. Curr Pharm Biotechnol， 2012， 13（6）： 999-1003.

[38]文瑩， 張立新. 阿維菌素的中國“智”造[J]. 遺傳， 2018， 40（10）： 888-899.

[39]李海偉， 張法， 鄭艦艇. 阿維菌素起始?；D(zhuǎn)移酶的底物特異性[J]. 微生物學(xué)通報， 2020， 47（1）： 190-199.

[40]蘇維， 呂志堂， 王洪濱， 等. 飛船搭載菌株的阿維菌素B1a組分分析[J]. 河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2006， 26（1）： 54-57.

[41]徐麗， 張怡軒， 王勇， 等. Co60γ射線照射技術(shù)在阿維菌素產(chǎn)生菌誘變育種中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 35（13）： 3797-3739.

[42]田萍萍， 曹鵬， 常傳友， 等. 阿維菌素生產(chǎn)菌的常壓室溫等離子體誘變育種及培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報， 2017， 44（1）： 150-160.

[43]Cao X， Luo Z， Zeng W， et al. Enhanced avermectin production by Streptomyces avermitilis ATCC 31267 using high-throughput screening aided by fluorescence-activated cell sorting[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2018， 102（2）： 703-712.

[44]Gao H， Liu M， Zhou X， et al. Identification of avermectin-high-producing strains by high-throughput screening methods[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2010， 85（4）： 1219-1225.

[45]程曦， 劉麗虹， 劉進(jìn)峰， 等. 單菌落效價測定在阿維菌素菌種篩選中的應(yīng)用研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2020， 12： 129-130.

[46]Zhuo Y， Zhang W， Chen D， et al. Reverse biological engineering of hrdB to enhance the production of avermectins in an industrial strain of Streptomyces avermitilis[J]. PNAS， 2010， 107（25）： 11250-11254.

[47]Gaisser S， Kellenberger L， Kaja A L， et al. Direct production of ivermectin-like drugs after domain exchange in the avermectin polyketide synthase of Streptomyces avermitilis ATCC31272[J]. Org Biomol Chem， 2003， 1（16）： 2840-2847.

[48]陳萬河， 王普， 劉亮， 等. 不同攪拌器型式對阿維菌素發(fā)酵的影響[J]. 浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2009， 37（3）： 52-56.

[49]趙樂， 郝艷陽， 馬志斌， 等. 變溫控制工藝在阿維菌素發(fā)酵中的應(yīng)用[J]. 科技資訊， 2011， 10）： 209-210.

[50]武威， 楊勵， 郭美錦. 阻沫回收分離器在阿維菌素發(fā)酵中的應(yīng)用[J]. 中國抗生素雜志， 2011， 36（3）： 187-190.

[51]程曦， 劉進(jìn)峰， 劉麗虹， 等. 液位控制對阿維菌素發(fā)酵效價的影響研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)， 2019， 13（30）： 121-122.

[52]李永亮， 楊玉淮， 鄒球龍， 等. 阿維菌素發(fā)酵補料工藝的研究[J]. 中國抗生素雜志， 2011， 36（7）： 515-518.

[53]程曦， 劉麗虹， 劉進(jìn)峰， 等. 半連續(xù)發(fā)酵對提高阿維菌素放罐體積的影響[J]. 化學(xué)與生物工程， 2021， 38（1）： 60-64.

[54]王斕， 周麗莉， 禮彤， 等. 超聲波提取阿維菌素 B1a 的工藝[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報， 2007， 24（3）： 182-185.

[55]郭鴻雁. 使用“M 溶劑”提取阿維菌素技術(shù)的研究[J]. 石油化工應(yīng)用， 2016， 35（1）： 122-124.

[56]Liu J， Chang Z， Sun X， et al. Impurity effects on the crystallization of avermectin B1a[J]. J Crystal Growth， 2006， 291（2）： 448-454.

[57]蔡進(jìn)忠， 李春花， 雷萌桐， 等. 牦牛主要寄生蟲病高效低殘留防治技術(shù)試驗示范[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志， 2020， 50（1）： 16-21.

[58]Fox L M. Ivermectin： uses and impact 20 years on[J]. Curr Opin Infect Dis， 2006， 19（6）： 588-593.

[59]Xu T L， Han Y， Liu W， et al. Antivirus effectiveness of ivermectin on dengue virus type 2 in Aedes albopictus[J]. PLoS Negl Trop Dis， 2018， 12（11）： e0006934.

[60]Amagai K， Ikeda H， Hashimoto J， et al. Identification of a gene cluster for telomestatin biosynthesis and heterologous expression using a specific promoter in a clean host[J]. Sci Rep， 2017， 7（1）： 3382.

[61]陳允亮， 楊云鵬， 李國權(quán)， 等. 天藍(lán)色鏈霉菌中抗生素合成相關(guān)雙組分調(diào)控系統(tǒng) AfsQ1/Q2 上游信號傳導(dǎo)機(jī)制的研究[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2021，48（4）： 450-464.