向 益 ， 豆朋朋 ， 王 利 ， 魏 勇 ，俄木曲者 ， 苗 斌 ， 陳 勇

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 ， 四川 成都 610041 ； 2. 四川省畜牧科學(xué)研究院 ， 四川 成都 610066 ; 3. 四川省巴中市南江黃羊科學(xué)研究所 ， 四川 南江 635600)

羊傳染性膿皰病(Contagious ecthyma，CE)，又稱羊口瘡，是由痘病毒科、副痘病毒屬中的羊傳染性膿皰病毒(Contagious ecthyma virus，CEV)引發(fā)的可感染人和反芻動物的一種接觸性、嗜上皮性和增生性疾病[1-2]。CE在世界各地均廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成嚴重影響。CEV可通過受損的皮膚進入宿主細胞，在表皮角質(zhì)細胞中復(fù)制[3-4]，造成上皮組織損傷。該病的診斷除流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀外，通常用PCR檢測確診病原。CEVF1L基因編碼病毒的囊膜蛋白，該蛋白是CEV的保護性抗原，可以刺激機體產(chǎn)生抗體反應(yīng)，因此CEVF1L基因常用于病毒的鑒定和遺傳進化分析[5]。目前，對CEV的研究大多集中在對病毒株的分離鑒定以及遺傳進化分析上[6-7]，而對于CEV引起病羊的病理組織學(xué)變化，僅在杜泊羊、絨山羊和小尾寒羊上有少量報道[8-10]。金堂黑山羊為四川省成都市金堂縣特產(chǎn)，是全國農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志，具有體型大、生長快、繁殖率高、適應(yīng)性強和抗病力強等特點。2020年1月，四川成都某黑山羊場羔羊疑似感染CEV，本試驗對病羊病料進行了病理組織學(xué)觀察和病毒分子檢測，從而為四川地區(qū)羊傳染性膿皰病的診斷和致病機理研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源 四川省成都某黑山羊場羔羊突發(fā)熱性傳染病，全場3～6月齡羊發(fā)病率高達75%。患病羊大多出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕，口腔和舌部出現(xiàn)丘疹和膿皰，唇部出現(xiàn)典型的“菜花樣”贅生物等癥狀。本實驗室對該羊場送檢的8只病羊進行剖檢，采集病羊的唇、舌、心臟、肝臟、脾臟、肺臟制做病理切片，病羊的口、唇病料做病毒檢測。

1.2 主要試劑 無水乙醇、PBS緩沖液，均為成都海興化工試劑廠產(chǎn)品；二甲苯，天津福晨化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；蘇木素、伊紅染液，均為武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；多聚甲醛，成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品；病毒基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；1.1×T3 Super PCR Mix，北京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 PCR儀(SimpliAmpTMThermal Cycler)和凝膠成像儀(iBright CL1000)，均為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-6B)，北京市六一儀器廠公司產(chǎn)品；石蠟切片機(RM2235)，德國Leica公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 病羊剖檢及病料處理 按常規(guī)病理剖檢技術(shù)對送檢的8只金堂黑山羊進行剖檢，觀察病羊各臟器剖檢變化。無菌采集病羊舌部、唇部痂皮封存于液氮罐中，另從心臟、肝臟、脾臟、肺臟、唇、舌切下小塊組織保存于4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH=7.4)備用。

1.4.2 病理組織切片制作及觀察 取出經(jīng)多聚甲醛固定24 h以上的病變組織，經(jīng)流水緩慢沖洗24 h后，依次放入95%、90%、80%、70%乙醇中脫水，二甲苯中透明，石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ中浸蠟1 h，將浸蠟完成的組織包埋于包埋框中，最后切片、貼片、烤片，經(jīng)H.E.染色[11]、封片，風(fēng)干后于Leica顯微鏡下觀察各組織病變特征并記錄結(jié)果。

1.4.3 細菌分離培養(yǎng) 無菌采集8只病羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟等組織接種于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察有無菌落生長。

1.4.4 病毒基因組DNA提取 取病變口唇皮膚樣品1 g，用無菌生理鹽水漂洗2次剪碎后，加入5 mL PBS研磨成1∶5(W/V，g/mL)的懸液，5 000 r/min離心35 min，按照20%的比例在上清液中加入青鏈霉素混合液，4 ℃作用過夜，無菌檢驗陰性后分裝，于-20 ℃保存待用，將處理過的樣品進行研磨，離心后取上清液，然后按照病毒基因組DNA提取試劑盒的操作說明書提取病毒DNA，其濃度及質(zhì)量于紫外分光光度計檢測合格(D260 nm/D280 nm=1.8～2.0)后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5F1L基因的PCR擴增、同源性分析及進化樹構(gòu)建 參考GenBank中羊傳染性膿皰病毒F1L基因序列(FJ808075.1)，用Primer 5.0設(shè)計F1L基因引物(F：5′-GACCCCGAGCTCATGGT-3′，R：5′-GCCGCGTCTTCACCTGTA-3′)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的病毒DNA為模板，PCR擴增F1L基因。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，57.5 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶并測序，結(jié)果用BLAST比對分析，利用MegAlign對該基因與14個GenBank中登錄的F1L基因序列進行核苷酸和氨基酸同源性比較，再利用Mega 6.0 軟件構(gòu)建該基因的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 金堂黑山羊的臨床癥狀及剖檢觀察 8只金堂黑山羊出現(xiàn)體溫升高、消瘦、被毛粗亂、精神萎靡、食欲減退或廢絕等癥狀，其口腔、鼻腔黏稠分泌物增多；眼角分泌物增加；口、唇、舌、上顎等出現(xiàn)大小不等丘疹、潰瘍、膿皰。病理剖檢發(fā)現(xiàn)，金堂黑山羊胸腔積有少量淡黃色液體；心包積大量淡黃色液體，心臟質(zhì)地變軟、色澤變淡，表面有數(shù)量不等的出血點；肝臟腫大、淤血，表面有數(shù)量不等的出血點；脾臟腫大、淤血，質(zhì)地變軟；肺臟有大量出血點、腫大；腎臟表面有大量出血點，淤血、腫大；腸道內(nèi)有橙紅色較稀的內(nèi)容物，腸黏膜有程度不等的出血點，表面附著黏稠分泌物；頸部喉氣管內(nèi)側(cè)有少量黏稠液體，喉頭部未見膿皰，但在靠近喉頭的上顎和舌根部可見膿皰；舌部可見淡黃色黏稠分泌物、丘疹、潰瘍和膿皰。

2.2 金堂黑山羊的病理組織學(xué)變化 在顯微鏡下觀察金堂黑山羊各病理組織切片，結(jié)果顯示，患病羊唇部皮膚表皮棘細胞層增厚，棘細胞發(fā)生嚴重的網(wǎng)狀變性，甚至發(fā)生氣球樣變，一些發(fā)生壞死的棘細胞的胞核濃縮、崩解，胞漿內(nèi)可見粉紅色、圓形的嗜酸性病毒包涵體(圖1A)；舌部皮膚表皮棘細胞層增厚，細胞腫脹，部分棘細胞空泡變性嚴重，甚至發(fā)生氣球樣變性，毛細血管擴張、充血，部分棘細胞核淡染(圖1B)；心臟橫紋肌細胞(心肌細胞)排列紊亂，橫紋斷裂、消失，成纖維細胞增多，心肌纖維腫脹，胞漿均質(zhì)紅染(圖1C)；肝細胞水腫，胞漿空泡變性、體積增大，界限模糊，肝竇擴張、充血，肝細胞索排列紊亂(圖1D)；脾周圍淋巴鞘增厚，毛細血管充血，脾血竇擴張、充血，脾索紊亂(圖1E)；肺泡擴張、破裂，肺泡壁變薄，肺泡和間質(zhì)可見紅細胞(圖1F)。

2.3 細菌分離培養(yǎng) 將患羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟等組織接種于LB固體培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后平板上并無細菌生長。

2.4 PCR檢測及分析 以8只患病金堂黑山羊的口唇痂皮提取的病毒DNA為模板，PCR擴增CEV的F1L基因。結(jié)果顯示，檢測的樣品均擴增出大小為230 bp的目的片段(圖2)，檢出率為100%。將本試驗擴增的F1L基因的測序結(jié)果提交到NCBI，選取GenBank登錄的國內(nèi)外CEV分離株F1L基因序列與本試驗的基因序列進行核苷酸和氨基酸序列同源性比較分析。結(jié)果顯示，本試驗擴增的F1L基因與其他14個分離株的核苷酸同源性為95.8%～99.5%，氨基酸序列同源性為96.3%～99.6%。F1L基因系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，本試驗中擴增的F1L基因序列與GenBank的KJ610840株(湖北分離株)親緣關(guān)系較近(圖3)。

圖3 F1L基因遺傳進化樹分析

3 討論

羊傳染性膿皰病的臨床癥狀主要以口、鼻等出現(xiàn)丘疹、膿皰、增生性痂皮為主，這與羊痘病、潰瘍性皮炎以及藍舌病等相似，為確診病原，常進行分子診斷。F1L基因是CEV的主要保護性抗原基因，且十分保守，已被廣泛用于CEV分子檢測、分子特征和進化分析[12-13]。尚辰等以分離毒株的DNA為模板，擴增得到1 005 bp的F1L基因，證實了從陜西地區(qū)分離的毒株為CEV，并且與新疆、甘肅等地流行的CEV親緣關(guān)系近[14]。陳曉等提取了毒株的總DNA，并擴增得到1 023 bp的F1L基因，證實上海地區(qū)的分離株為CEV，并且與中國南方地區(qū)流行的CEV毒株親緣關(guān)系近[15]。四朗玉珍等提取毒株的DNA，擴增得到1 062 bp的F1L基因，證實西藏地區(qū)的毒株為CEV，并且與吉林、廣東地區(qū)流行的CEV株親緣關(guān)系近[16]。本試驗從金堂黑山羊病料中擴增出的F1L基因，與印度、湖北流行的CEV株親緣關(guān)系近，這與上述結(jié)果不一致，可能與F1L基因測序位置或分離來源不同有關(guān)。

CEV感染羊只引起口唇病變最為常見，患羊首先在口角、上唇或鼻鏡上出現(xiàn)散在的紅斑，然后變?yōu)榍鹫詈托〗Y(jié)節(jié)，繼而發(fā)展為水皰或膿皰，最后形成增生性痂皮，影響其采食[17]。哈利等發(fā)現(xiàn)絨山羊感染CEV后，其右心衰竭、肺臟淤血、脾臟腫大、網(wǎng)胃和瓣胃黏膜出現(xiàn)丘疹病灶[9]。范春玲等發(fā)現(xiàn)小尾寒羊感染CEV后，其唇部周圍痂皮下肉芽組織增生，口腔潰瘍和糜爛，頜下淋巴結(jié)腫大[10]。尚辰等發(fā)現(xiàn)波爾山羊感染CEV后，羊口腔黏膜、齒齦、嘴唇、鼻孔等皮膚出現(xiàn)紅斑點，而后發(fā)展為膿皰，破潰后形成疣狀痂皮，剖檢發(fā)現(xiàn)病羊心包積液、間質(zhì)肺炎、頜下淋巴結(jié)腫大等病變[14]。本試驗中，患病金堂黑山羊的口腔、唇、鼻腔出現(xiàn)嚴重潰瘍、膿皰，并且有增生性痂皮形成，同時剖檢可見，病羊肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等臟器均有不同程度的腫大、出血。這一結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，說明金堂黑山羊感染CEV后，除造成口、唇部皮膚丘疹、膿皰等病變外，對機體實質(zhì)臟器也可造成一定損傷。

CEV導(dǎo)致波爾山羊的組織病變主要以表皮棘細胞層為主，表現(xiàn)為表皮角質(zhì)化、腫脹，棘層肥大和囊泡狀氣球樣變性[17]，感染部位有大量嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞浸潤，隨著粒細胞向表皮移動并聚集在表皮的水泡內(nèi)，水皰逐漸變?yōu)槟摨?，部分受感染細胞的胞漿出現(xiàn)嗜酸性包涵體[18]。本試驗中，CEV感染金堂黑山羊引起的舌部、唇部、心肌、脾臟和肺臟的組織病變與上述報道基本一致。武鑫等除了在波爾山羊的口、舌部位發(fā)現(xiàn)包涵體存在外，在肺臟、肝臟等部位也發(fā)現(xiàn)了病毒包涵體[19]，但本試驗僅在金堂黑山羊的唇、舌部發(fā)現(xiàn)了嗜酸性病毒包涵體，這可能與病毒的復(fù)制、侵襲力有關(guān)，也可能由于地區(qū)的差異導(dǎo)致了病毒毒株的變異，毒力增強。

綜上所述，本試驗從病理組織學(xué)和病原學(xué)角度證明了引起此次金堂黑山羊患病的病原是CEV，為四川地區(qū)CEV的診斷和致病機理研究積累了資料。