郭金碩 ， 侯 磊 ， 全 榮 ， 王 菁 ， 韋 莉 ， 劉 爵

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 北京 昌平 102206 ； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽傳染病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 海淀 100097)

2016年，國際病毒分類學(xué)委員會(huì)將塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)正式更名為A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A,SVA)[1]，該病毒與豬水皰病(SVA-VD)和流行性暫時(shí)性新生仔豬死亡(Epidemic transient neonatal mortality,ETNL)相關(guān)[2]。2002年A型塞內(nèi)卡病毒首次被發(fā)現(xiàn)[3]，早期研究認(rèn)為該病毒是非致病性的，感染后的豬沒有明顯的臨床癥狀[4]。然而，2015年巴西等多國相繼發(fā)生塞內(nèi)卡病毒感染豬的疫情[5-7]，感染豬口鼻部和蹄冠部出現(xiàn)原發(fā)性水皰和新生仔豬死亡率升高等現(xiàn)象[8]，同年我國廣東省發(fā)現(xiàn)第1例SVA感染[3,9]，之后在福建[10]、河南[11]、湖北[12]等地相繼檢測出SVA，對生豬產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重危害。

A型塞內(nèi)卡病毒是無囊膜、單股、正鏈RNA病毒，是微RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的唯一成員[13]，基因組大小為7.2 kb，具有單一的開放閱讀框(ORF)，能夠編碼2 181個(gè)氨基酸的多肽，經(jīng)過水解和切割后其包括前導(dǎo)蛋白(L)、結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[3]。VP1蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，具有免疫優(yōu)勢，且在SVA不同毒株中相對保守[2]，因此，VP1蛋白是塞內(nèi)卡病毒免疫學(xué)診斷的重要靶標(biāo)之一，并且在塞內(nèi)卡病毒致病機(jī)制的研究中具有重要意義[14-15]。本研究利用SVAVP1(528 bp)片段制備出能夠穩(wěn)定分泌抗SVA VP1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并利用SVA(CHhb17)對雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的抗體進(jìn)行Western blotting和間接免疫熒光鑒定，該單克隆抗體的制備為A型塞內(nèi)卡病毒診斷方法的建立與致病機(jī)制的研究提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物、質(zhì)粒和病毒 BHK-21細(xì)胞，購自美國細(xì)胞菌種庫(ATCC CRL-1650)。SP2/0骨髓雜交瘤細(xì)胞、表達(dá)載體pET30a-GST由本實(shí)驗(yàn)室保存。6周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。A型塞內(nèi)卡病毒毒株CHhb17由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑BamH I、XhoI，均購自寶生物工程(大連)有限公司。DNA Ligation Kit Ver 2.0,購自TaKaRa公司。NBCS新生胎牛血清、FBS胎牛血清、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG，均購自Thermo-Fisher Scientific公司。IPTG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、單抗亞型鑒定試劑盒、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、HAT選擇性培養(yǎng)基，均購自Sigma公司。RNeasy?Mini Kit、DNA片段膠回收試劑盒，均購自QIAGEN公司。TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Ni2+親和層析柱，購自GE公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)、合成 參考A型塞內(nèi)卡病毒毒株CHhb17的VP1基因序列(GenBank登錄號：MG983756.1)，設(shè)計(jì)特異性引物，委托中美泰和有限公司合成，在構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒的過程中選取BamH I和XhoI為限制性核酸內(nèi)切酶，引物設(shè)計(jì)如下：VP1-F(528 bp)：CTCTGGATCCTCCACCGACAACGCCGAG(下劃線處為BamH I);VP1-R(528 bp)：GGTGCTCGAGTCCACCCTTGCTGGTGAA(下劃線處為XhoI)。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 提取A型塞內(nèi)卡病毒毒株CHhb17 RNA，并測定RNA濃度，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增SVAVP1(528 bp)基因，反應(yīng)體系20 μL：1 μL模板、2 μL dNTPs、10 μL Buffer、1 μLVP1-F、1 μLVP1-R、0.5 μL聚合酶、4.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用膠回收試劑盒純化目的片段。SVAVP1(528 bp)基因片段與原核表達(dá)載體pET30a-GST分別用BamH I、XhoI雙酶切，純化回收目的基因片段，將1 μL載體(pET30a-GST)，5 μL酶切回收產(chǎn)物，4 μL連接酶混合物混勻，室溫反應(yīng)30 min以上。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，選擇氨芐青霉素抗性的LB涂板，晾干，倒置37 ℃培養(yǎng)箱過夜，挑取菌落用VP1-F、VP1-R引物進(jìn)行PCR檢測，陽性菌進(jìn)行基因測序。

1.5 VP1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將測序正確的pET30a-GST-VP1(528 bp)菌株，接種到1 L氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)。待菌液培養(yǎng)至OD=0.6～0.8，加入濃度為0.5 mmol/L的IPTG中，37 ℃誘導(dǎo)4 h。誘導(dǎo)后離心收菌，超聲破碎，再次離心后分別取上清和沉淀，通過12% SDS-PAGE電泳，確定重組蛋白的表達(dá)形式。使用Ni2+親和層析法對重組蛋白進(jìn)行純化，為了確定最佳洗脫濃度，采用15、60 mmol/L和500 mmol/L濃度的咪唑進(jìn)行洗脫，收集流穿液與洗脫液。將制備的樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳鑒定，然后將純化的蛋白作為抗原免疫小鼠，剩余的置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 小鼠免疫與細(xì)胞融合 純化后的重組蛋白按照1∶1的比例與弗氏完全佐劑充分乳化，初次免疫4只 6周齡雌性 BALB/c小鼠，背部皮下多點(diǎn)注射，每只免疫30 μg，二免和三免使用弗氏不完全佐劑與重組蛋白以1∶1的比例充分乳化，采用相同的免疫方法，免疫間隔為3周，三免14 d后采血，進(jìn)行免疫效價(jià)檢測，小鼠編號為1、2、3、4，將純化的重組蛋白進(jìn)行ELISA檢測，當(dāng)小鼠血清OD450 nm/陰性對照OD450 nm>2.1，判定為陽性，采用聚乙二醇(PEG)法對血清效價(jià)較高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，融合細(xì)胞用半固體培養(yǎng)基(含HAT)進(jìn)行篩選培養(yǎng)，通過間接ELISA的方法篩選出陽性細(xì)胞孔，按照有限稀釋法進(jìn)行連續(xù)3次亞克隆純化，直至雜交瘤細(xì)胞陽性率達(dá)到100%且為單個(gè)克隆，從而獲得能夠穩(wěn)定分泌抗SVA VP1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，最后通過單抗亞型鑒定試劑盒進(jìn)行亞型鑒定。

1.7 腹水制備與純化 以0.5 mL/只石蠟油腹腔注射6周齡雌性BALB/c小鼠，10 d以后用同樣的方法腹腔注射陽性雜交瘤細(xì)胞，7～10 d后采集小鼠腹水，離心后取上清，經(jīng)過辛酸-硫酸銨法和Protein G柱對抗體進(jìn)行純化，純化后的單抗樣品用12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.8 單克隆抗體的特異性鑒定 Western blotting檢測:使用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在6孔板中培養(yǎng)單層BHK-21細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，SVA感染細(xì)胞1 h，換用含有2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，陰性對照為含有2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基培養(yǎng)的單層BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，裂解細(xì)胞制備蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳與轉(zhuǎn)膜，最后進(jìn)行顯影以及圖像采集。

1.9 間接免疫熒光檢測 在24孔板中使用10% FBS的DMEM培養(yǎng)單層的BHK-21細(xì)胞，待長至90%以上，棄去培養(yǎng)基，SVA感染細(xì)胞1 h，棄掉培養(yǎng)基，使用含有2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，陰性對照為含有2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基培養(yǎng)的單層BHK-21細(xì)胞。病毒感染24 h后無水乙醇固定30 min，PBST洗3次，5 min/次，加入抗SVA VP1單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，PBST洗3次，5 min/次，然后加入抗小鼠IgG-FITC標(biāo)記抗體(1∶50倍稀釋)，37 ℃避光孵育2 h，PBST洗3次，5 min/次，封片鏡檢，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pET30a-GST-VP1(528 bp)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以SVA RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用VP1-R/VP1-F引物通過PCR的方法擴(kuò)增SVAVP1 (528 bp)基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在500 bp左右出現(xiàn)1條特異性條帶，與預(yù)期SVAVP1 (528 bp)基因大小相近(圖1)。

圖1 VP1基因(528 bp)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組SVA VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將擴(kuò)增的SVAVP1 (528 bp)基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a-GST上，重組pET30a-GST-VP1 (528 bp)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過IPTG大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，最后通過12% SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：重組蛋白主要在沉淀中，以包涵體的形式存在，大小約為47 kDa，與預(yù)期蛋白大小一致(圖2A)。將其尿素溶解后透析復(fù)性，經(jīng)鎳柱純化，使用不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫，最后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示，本研究得到了純化的重組蛋白(圖2B)。

圖2 VP1重組蛋白的12% SDS-PAGE分析

2.3 單克隆抗體的制備 將純化的VP1重組蛋白乳化后免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過3次免疫后，測量小鼠血清效價(jià)。經(jīng)檢測1號小鼠的血清效價(jià)最高，約為5×104。取1號小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞通過PEG方法進(jìn)行細(xì)胞融合，融合以后用含HAT半固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，經(jīng)過間接ELISA方法進(jìn)行3輪亞克隆篩選，得到1株能分泌抗VP1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將篩選出的單抗進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示其重鏈亞型為IgG2a，輕鏈為Kappa鏈(表1)。

表1 抗SVA VP1單克隆抗體亞型鑒定

2.4 單克隆抗體的純化 收集制備的小鼠腹水，通過辛酸-飽和硫酸銨法與Protein G柱純化單克隆抗體，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分析，在55 kDa和26 kDa出現(xiàn)2條清晰的條帶，與IgG重鏈和輕鏈的大小相符，結(jié)果顯示得到了純化的單克隆抗體(圖3)。

圖3 純化的VP1單抗的SDS-PAGE分析

2.5 單克隆抗體的鑒定 Western blotting檢測結(jié)果如圖4A所示，在29 kDa處出現(xiàn)明顯的條帶，與病毒編碼的SVA VP1蛋白大小相符，說明該單抗能夠與SVA編碼的VP1蛋白結(jié)合。間接免疫熒光鑒定結(jié)果如圖4B所示，病毒感染細(xì)胞后，單克隆抗體可以使感染病毒的細(xì)胞產(chǎn)生特異性熒光，且與正常的BHK-21細(xì)胞無反應(yīng)，證明該單克隆抗體能識別SVA病毒粒子。

圖4 VP1單克隆抗體的鑒定

3 討論

SVA感染后的臨床癥狀主要為肌肉無力、嗜睡、跛行、厭食、鼻部和蹄部冠狀帶出現(xiàn)水泡甚至潰瘍[16-18]，新生仔豬發(fā)病率高達(dá)70%，死亡率介于15%～30%，并伴有腹瀉癥狀[19]，與其他水泡病病毒，如口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、豬水泡性皰疹病毒(VESV)的感染難以區(qū)分，需要進(jìn)行鑒別診斷，因此發(fā)展SVA血清學(xué)檢測手段尤為重要，而單克隆抗體具有純度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性強(qiáng)和易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于A型塞內(nèi)卡病毒各個(gè)方面的研究。

在微RNA病毒科中VP1蛋白普遍具有良好免疫原性，例如FMDV的VP1蛋白[20-21]，并且經(jīng)常被用作候選疫苗研究的目標(biāo)蛋白[22]。SVA VP1蛋白的氨基酸序列在所報(bào)道的SVA毒株中高度保守，相似性為95.8%～100%，而與其他微RNA病毒科的其他成員相似性小于30%(例如心臟病毒)，易與其他微RNA病毒區(qū)分開，且SVA VP1蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[2]，因此本研究選擇VP1蛋白用于制備SVA的單克隆抗體。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后修飾的缺陷，例如構(gòu)象結(jié)構(gòu)缺失、甲基化修飾缺失等，但優(yōu)點(diǎn)是菌株生長快，易于操作和蛋白質(zhì)生產(chǎn)量大[23]，因此本研究通過大腸埃希菌大量表達(dá)了SVA VP1蛋白。但是在本研究中，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒時(shí)全長基因不能很好的表達(dá)SVA VP1蛋白，通過生物信息軟件分析，SVAVP1 148～675 bp 區(qū)域具備抗原性、親水性基因優(yōu)勢，因此將VP1基因截短，即截取全長的528 bp，去除存在疏水區(qū)的基因序列，成功表達(dá)SVA VP1蛋白。載體中連接GST基因，構(gòu)建的重組蛋白中包含GST蛋白，研究制備的單克隆抗體有可能針對GST蛋白，但在單克隆抗體的鑒定時(shí)，病毒編碼的VP1蛋白可以與單克隆抗體結(jié)合，因此該抗體具備識別的特異性，不與GST蛋白結(jié)合。另外本研究通過氨基酸序列比對，SVAVP1 (528 bp)與FMDVVP1氨基酸序列同源性為14.2%，SVAVP1(528 bp)與SVDVVP1氨基酸序列同源性為11.4%，表明SVAVP1序列與另外2個(gè)病毒的VP1同源性較低，抗SVA VP1單克隆抗體與另外2個(gè)病毒VP1反應(yīng)性較低。

本研究利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高純度的SVA VP1蛋白，通過小鼠免疫，細(xì)胞融合制備出SVA VP1單抗，該單抗可用于Western blotting和間接免疫熒光檢測，能夠與SVA感染的BHK-21細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，且不與未感染的BHK-21細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)性和特異性，為深入研究SVA VP1蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及A型塞內(nèi)卡病毒的鑒別診斷、致病機(jī)制的研究提供技術(shù)儲(chǔ)備。