海永慧 ， 欽 倩 ， 李蓓蓓 ， 任靜靜 ， 馬 勛 ， 蔣建軍 ， 王鵬雁

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 新疆 石河子 832003)

腸外致病性大腸桿菌(Extra-intestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)可通過其特有的毒力因子定殖腸道外的其他組織中，最終導(dǎo)致宿主發(fā)病[1]。ExPEC包括新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitis causingEscherichiacoli，NMEC)、尿道致病性大腸桿菌(UropathogenicEscherichiacoli，UPEC)、敗血癥大腸桿菌(SepticemicEscherichiacoli,SEPEC)[2]和禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)[3]。近年來，新疆多個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的犢牛出現(xiàn)了以神經(jīng)癥狀為主的病例，剖檢發(fā)現(xiàn)患牛腦膜嚴重出血，從腦組織中分離出來的病原菌經(jīng)鑒定為腸外致病性大腸桿菌，這給奶牛養(yǎng)殖場帶來了經(jīng)濟損失，同時也給牛源ExPEC的防控帶來了挑戰(zhàn)[4]。

目前用于ExPEC的疫苗主要以傳統(tǒng)滅活苗為主，但此類疫苗免疫保護效果相對比較局限，且副作用大，此外，可用于牛源致腦炎大腸桿菌的疫苗鮮有報道。多表位候選疫苗可克服傳統(tǒng)疫苗的缺點，能更高效地刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并消除針對不良表位的免疫應(yīng)答[5]。多表位疫苗可以刺激機體保守和有利的表位，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具有更高安全性，還可以通過抗原表位的工程設(shè)計和預(yù)測來提高疫苗的廣度和效力[6]。

牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場患病犢牛腦組織中，本課題組前期已對其進行全基因組測序并將E.coliS9922全基因組序列分別與GenBank上公布的56個具有全基因組序列的大腸桿菌進行比較分析，得到了69個E.coliS9922特有毒力基因，因此本試驗從中選取了與黏附有關(guān)的FimD和PilN兩個菌毛蛋白，利用生物信息學(xué)工具分析其蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢B細胞表位，為牛源致腦炎大腸桿菌多表位疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場患病犢牛腦組織中，并已被鑒定為腸外致病性大腸桿菌，由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室保存。將S9922進行全基因組測序并進行比較基因組學(xué)研究，篩選到與細菌致病有關(guān)的特異性黏附蛋白FimD、PilN等。

1.2 方法

1.2.1 蛋白的理化性質(zhì)分析 運用在線服務(wù)器ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)，分析FimD、PilN蛋白的氨基酸組成、分子質(zhì)量、理論等電點、原子組成、不穩(wěn)定指數(shù)和平均親水系數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2.2 蛋白跨膜區(qū)、信號肽、糖基化位點和磷酸化位點分析 運用在線服務(wù)器TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SignalP-5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，分別分析FimD、PilN蛋白氨基酸序列的跨膜區(qū)、信號肽區(qū)域、糖基化位點和磷酸化位點。

1.2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 利用SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白的β轉(zhuǎn)角、β折疊、α螺旋、無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)。同時用DNASTAR軟件中的Protean板塊分析蛋白抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性較好的肽段。

1.2.4 蛋白三級結(jié)構(gòu)分析 將FimD、PilN蛋白的氨基酸序列提交至在線服務(wù)器SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)，F(xiàn)imD蛋白選取3rfz.1.B作為模板，PilN蛋白選取3ezj.1.A作為模板，構(gòu)建FimD、PilN蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。

1.2.5 蛋白優(yōu)勢B細胞表位預(yù)測 利用BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)、Immunomedicine Group(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)對FimD、PilN蛋白的B細胞表位進行預(yù)測。綜合DNASTAR軟件中的Protean板塊的抗原性、柔韌性、親水性和表面可及性以及信號肽、跨膜區(qū)、二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測FimD、PilN蛋白的B細胞優(yōu)勢抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 FimD、PilN蛋白的理化性質(zhì)分析 FimD蛋白由382個氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸：Gly占10.7%，共有41個；Ser占10.2%，共有39個；Asn占9.4%，共有36個；Thr占8.1%，共有31個；Leu占7.1%，共有27個；帶負電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為28，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為25，理論等電點為6.16。FimD蛋白的原子組成為C1828H2798N510O588S9，相對分子質(zhì)量為41 615.93 Da，不穩(wěn)定系數(shù)為28.31，小于閾值40，歸類為穩(wěn)定蛋白。平均親水系數(shù)(GRAVY)為-0.435，GRAVY的范圍為-2～2，負值表明蛋白為親水蛋白，F(xiàn)imD蛋白歸類為親水蛋白。

PilN蛋白由560個氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸：Thr占12.7%，共有71個；Ser占11.1%，共有62個；Leu占9.1%，共有51個；Ala占7.7%，共有43個；Gly占7.5%，共有42個；帶負電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為43，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為44，理論等電點為7.61。PilN蛋白的原子組成為C2586H4184N724O858S22。相對分子質(zhì)量為59 851.32 Da，不穩(wěn)定系數(shù)為36.5，小于閾值40，歸類為穩(wěn)定蛋白。GRAVY為-0.274，GRAVY的范圍為-2～2，負值表明蛋白為親水蛋白，F(xiàn)imD蛋白歸類為親水蛋白。

2.2 FimD、PilN蛋白的跨膜區(qū)、信號肽、糖基化位點和磷酸化位點分析 利用在線服務(wù)器TMHMM分析FimD蛋白和PilN蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)imD蛋白不存在跨膜區(qū)，PilN蛋白在1～50位氨基酸上可能出現(xiàn)跨膜區(qū)。利用在線服務(wù)器SignalP-5.0 分析FimD蛋白和PilN蛋白的信號肽，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)imD蛋白不存在信號肽；PilN蛋白在26～27位氨基酸上出現(xiàn)信號肽。

圖2 蛋白信號肽分析

利用在線服務(wù)器NetNGlyc1.0進行蛋白糖基化位點分析，F(xiàn)imD蛋白共有7個潛在的糖基化位點，PilN蛋白共有2個潛在的糖基化位點。利用在線服務(wù)器NetPhos 3.1進行蛋白磷酸化位點分析，分析結(jié)果如彩版封二圖3所示，F(xiàn)imD蛋白共有潛在的48個磷酸化位點，其中有23個Ser位點，15個Thr位點，10個 Tyr位點；PilN蛋白共有85個潛在的磷酸化位點，其中有47個Ser位點，33個Thr位點，5個Tyr位點。

圖3 磷酸化位點分析

2.3 FimD、PilN蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析 利用在線服務(wù)器SOPMA對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，F(xiàn)imD蛋白結(jié)果如彩版封二圖4所示，α螺旋占6.54%，延伸鏈占32.94%，β轉(zhuǎn)角占5.50%，無規(guī)則卷曲占56.02%；PilN蛋白結(jié)果如彩版封三圖5所示，α螺旋占23.75%，延伸鏈占20.54%，β轉(zhuǎn)角占4.29%，無規(guī)則卷曲占51.43%。

圖4 FimD蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 PilN蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用DNASTAR軟件中的Protean板塊分析蛋白抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性的結(jié)果如彩版封三圖6所示，綜合分析得出親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性都較好的肽段(表1)。

圖6 DNASTAR軟件預(yù)測蛋白親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性

表1 FimD、PilN蛋白親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性都較好的肽段預(yù)測

2.4 FimD、PilN蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析 利用SWISS-MODEL進行同源建模，同源建模也可稱比較建模，是利用已知的同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)建立目的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。FimD蛋白、PilN蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖7所示，F(xiàn)imD蛋白選取3rfz.1.B作為模板，全局模型質(zhì)量評估(GMQE)結(jié)果為0.78,QMEAN為-2.01,相似性為56.81%；PilN蛋白選取3ezj.1.A作為模板，GMQE結(jié)果為0.10,QMEAN為-4.44,相似性為12.78%，所有圖中都存在α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，與二級結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果相符合。

圖7 FimD蛋白、PilN蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 FimD、PilN蛋白的優(yōu)勢B細胞表位預(yù)測 采用BepiPred預(yù)測的蛋白B細胞表位結(jié)果如表2所示，Immunomedicine Group預(yù)測的蛋白B細胞表位結(jié)果如表3所示。參照高瞻等[7]的方法進行最終的蛋白優(yōu)勢B細胞表位預(yù)測，由于表位大多出現(xiàn)在表面可及性、抗原性、柔韌性、親水性都較好的肽段，并且目前預(yù)測B細胞表位的在線工具都未達到百分之百的準確率，因此需要選取用BepiPred預(yù)測的B細胞表位結(jié)果和用Immunomedicine Group預(yù)測的B細胞表位結(jié)果的共同部分，并綜合DNASTAR軟件、SOPMA分析的結(jié)果，選出表面可及性、抗原性、柔韌性、親水性都較好并且沒有α螺旋的肽段，預(yù)測出最終的蛋白優(yōu)勢B細胞表位。最終預(yù)測出FimD蛋白潛在的優(yōu)勢B細胞表位為：7～18、144～152、307～315、365～373；PilN蛋白潛在的優(yōu)勢B細胞表位為：77～86、138～149、516～524。

表2 BepiPred方法預(yù)測蛋白B細胞表位的肽段位置

表3 Immunomedicine Group方法預(yù)測蛋白B細胞表位的肽段位置

3 討論

大腸肝菌(Escherichiacoli,E.coli)引起的腦膜炎是一個復(fù)雜的多步驟過程，包括從腸黏膜的定植到進入血液循環(huán)并形成高水平的菌血癥，然后進一步穿過血腦屏障，進入腦脊液最終引起腦膜炎[8]。黏附是NMEC致病機理中的第一步，也是穿越血腦屏障的重要一步。E.coli對構(gòu)成血腦屏障的腦微血管內(nèi)皮細胞的黏附被認為是其侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要因素[9]。菌毛與E.coli的黏附、定植和致病都有著非常密切的關(guān)系[10]，F(xiàn)imD和PilN都屬于菌毛的亞單位蛋白，在菌毛的組裝中起著重要的作用[11-12]。

表位是蛋白抗原性的基礎(chǔ),而且與機體的固有免疫、獲得性免疫等密切相關(guān)，表位的研究對于疾病的診斷和分子疫苗的設(shè)計有至關(guān)重要的意義[13]。隨著生物信息學(xué)研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，生物信息學(xué)被廣泛地應(yīng)用[14]，目前，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能進行生物信息學(xué)技術(shù)分析已經(jīng)成為大多表位和疫苗研究的首選方法[15]，與傳統(tǒng)的試驗方法相比，生物信息學(xué)技術(shù)使蛋白結(jié)構(gòu)分析和表位的預(yù)測更加準確和簡便[16]。表位大多出現(xiàn)在蛋白表面可及性強、柔韌性好、親水性和抗原指數(shù)高的肽段[17]，以及結(jié)構(gòu)較松散，易扭曲、盤旋并展示在蛋白表面的β轉(zhuǎn) 角及無規(guī)則卷曲和該蛋白的膜外區(qū)域，從而有利于抗體結(jié)合[18]。

本試驗利用生物信息學(xué)方法綜合分析FimD和PilN表面可及性、柔韌性、蛋白親水性、抗原指數(shù)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等參數(shù)來預(yù)測B細胞表位。結(jié)果顯示，F(xiàn)imD和PilN蛋白的膜外區(qū)域占較高比例，因此可能被抗原遞呈細胞接觸并引發(fā)免疫應(yīng)答。蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)imD蛋白的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占61.52%，PilN蛋白的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占55.72%，2個蛋白的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲所占比例之和大于50%。BepiPred-2.0基于隨機森林算法提供了最先進的基于B細胞表位序列的預(yù)測[19]，與其他可用工具相比，該表位被認為具有更高的質(zhì)量，并且確實顯著提高了預(yù)測能力[20]。Immunomedicine Group使用Kolaskar和Tongaonkar的方法預(yù)測表位，只有當(dāng)最小氨基酸殘基大小為8個時才被報告，該方法的準確性約為75%[21]。IEDB為科學(xué)界提供了表位數(shù)據(jù)的開放訪問，以及表位預(yù)測和分析工具，收集了最廣泛的試驗驗證的B細胞和T細胞表位數(shù)據(jù)[22]。分別使用在線預(yù)測工具BepiPred和Immunomedicine Group預(yù)測出FimD蛋白具有11個和14個B細胞表位肽段，PilN蛋白具有12個和23個B細胞表位肽段?，F(xiàn)已有的預(yù)測B細胞表位的在線工具均未達到百分之百的準確性。本試驗選取除去信號肽和跨膜區(qū)后的肽段，綜合分析FimD、PilN蛋白在不同在線預(yù)測工具得出的B細胞表位預(yù)測結(jié)果以及DNASTAR軟件分析得出的2個蛋白表面可及性、柔韌性、抗原性、親水性較好的肽段，選取共同部分最終確定潛在的優(yōu)勢B細胞表位。綜上所述，F(xiàn)imD、PilN蛋白具有很多潛在的抗原表位，推測這2個蛋白具有良好的免疫原性，但還需要在后期的試驗中進一步驗證。本試驗預(yù)測篩選得到的FimD、PilN蛋白潛在表位可為牛源致腦炎大腸桿菌多表位疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。