黃小強(qiáng) 祝丹江 王魯豫 陳雨田 孫嘉寧 黃濤 賈安

【摘 要】 目的：研究馬齒莧多糖對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷（ALI）的影響。方法：將60只體重為18～20 g昆明種小鼠隨機(jī)分6組。分別為正常組，LPS組，醋酸地塞米松組[0.005 g/（kg·d）]，馬齒莧多糖低、中、高劑量組[1.5、3、6 g/kg/d，生藥量]，每組10只，先連續(xù)灌胃給藥14 d，每天1次，第14天給藥2 h后，利用LPS建立小鼠ALI動(dòng)物模型，除正常組小鼠氣管滴注等量生理鹽水外，其他各組滴注LPS（10 mg/kg）溶液，12 h后酶聯(lián)免疫吸附劑法測(cè)定血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）含量以及肺組織中髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性，計(jì)算肺組織濕/干重（W/D）值，并進(jìn)行肺組織病理切片檢查。結(jié)果：與正常組比較，LPS組中W/D值，TNF-α和IL-1β含量及MPO活性均顯著性升高（P<0.05或0.01）;與LPS組比較，醋酸地塞米松組、馬齒莧多糖中劑量和高劑量組中W/D值，TNF-α和IL-1β含量及MPO活性、肺損傷評(píng)分均顯著降低（P<0.05或0.01）。結(jié)論：馬齒莧多糖具有一定的保護(hù)ALI作用，其機(jī)制可能與抑制體內(nèi)炎性介質(zhì)釋放有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 馬齒莧多糖;脂多糖;急性肺損傷;小鼠

【中圖分類號(hào)】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）06-0035-05

Experimental Study of Purslane Polysaccharide on LPS-induced Acute Lung Injury in Mice

HUANG Xiaoqiang ZHU Danjiang WANG Luyu CHEN Yutian SUN Jianing HUANG Tao JIA An*

Medical School， Huanghe Science & Technology College， Zhengzhou 450063， China

Abstract：Objective To investigate the effects of Purslane Polysaccharide on lipopolysaccharide induced ALI in mice. Methods Sixty KM mice weighing 18-20 g were randomly divided into 6 groups： Normal group， LPS group， Dexamethasone group （0.005 g/kg/d）， Purslane Polysaccharide low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.5， 3， 6 g/kg/d ）， with 10 mice in each group， First continuous gavage for 14 days， once a day. 2 hours after the last administration， On the 14th day， 2 hour after administration， LPS was used to establish ALI animal model， Except for the normal group， the mice were injected with the same amount of normal saline in the trachea， and the other groups were injected with LPS （10 mg/kg） solution. After 12 hours， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum and the activity of myeloperoxidase （MPO） in lung tissue were measured， and pathological examination of lung tissue was performed. Results Compared with the normal group， The contents of W/D， TNF-α， IL-1β and MPO activity in LPS group were significantly increased （P<0.05， P<0.01）; Compared with LPS group， W/D value， contents of TNF - α and IL-1 β， MPO activity and lung injury score in dexamethasone acetate group， Purslane Polysaccharide medium dose group and high dose group were significantly decreased （P<0.05，P< 0.01）. Conclusion Purslane Polysaccharide can protect the acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice， and its mechanism may be related to inhibiting the release of inflammatory mediators in the body.

Key words：Purslane Polysaccharide; Lipopolysaccharide; Acute Lung Injury; Mice3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是急診科室中最常見(jiàn)的危重病之一，它的特點(diǎn)是肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，同時(shí)伴隨蛋白質(zhì)的滲出、大量炎癥介質(zhì)及因子的釋放[1]。炎癥細(xì)胞因子和相關(guān)介質(zhì)伴隨ALI的發(fā)生與發(fā)展全過(guò)程，例如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和NO等[2]。ALI在臨床上具有較高的死亡率和發(fā)病率，其死亡率然高達(dá)40%～60%[3]。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧（Portulaca oleracea L.）的干燥地上部分，全國(guó)絕大地區(qū)均有分布，中國(guó)藥典（2020版）記載具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效[4];由于富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中以維生素及ω-3脂肪酸最為突出，因此馬齒莧也是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的食物[5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究[6-8]發(fā)現(xiàn)馬齒莧的主要化學(xué)成分包括：多糖類、黃酮類、生物堿類、有機(jī)酚酸類等，同時(shí)藥理學(xué)研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，馬齒莧多糖具有一定程度地降低炎癥因子和護(hù)肝等作用。為了探討馬齒莧多糖是否對(duì)ALI的保護(hù)作用，本研究應(yīng)用馬齒莧多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠模型開展相關(guān)研究。為馬齒莧今后進(jìn)一步深入開發(fā)和臨床應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 試藥 馬齒莧（張仲景大藥房）;脂多糖（美國(guó)Sigma公司）;醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司）;腫瘤壞死因子ɑ（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）;髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 動(dòng)物 60只清潔級(jí)KM雄性小鼠，體重18～20 g，由黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物房光照條件12 h/d，溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀（奧地利，Infinite公司）;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)，賽默飛世爾科技有限公司）;FY135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）;BS-3000A系列電子天平（上海友聲衡器有限公司）;光學(xué)顯微鏡（日本，OLYMPUS）;RM2125型石蠟切片機(jī)（德國(guó)，Leica公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 馬齒莧多糖的制備[13-14] 將馬齒莧粗粉，過(guò)10目篩，稱取500 g，加入4倍量無(wú)水乙醇浸泡24 h，抽濾，60 ℃烘干藥渣，然后加入10倍量的蒸餾水，置于80 ℃水浴鍋中溫浸2 h，溫浸提取2次，合并2次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至200 mL，然后加入800 mL無(wú)水乙醇至80%，劇烈搖勻，4 ℃低溫靜置分層，抽濾，收集沉淀，即為馬齒莧粗多糖。沉淀完全溶于蒸餾水后加入適量活性炭進(jìn)行脫色，抽濾，再加入少量Sevage試劑，充分震蕩，靜置分層，收集上清液，減壓濃縮，并真空冷凍干燥，得馬齒莧多糖，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?。采用硫?苯酚法對(duì)馬齒莧多糖含量進(jìn)行測(cè)定[15]，其工作曲線為C=3.6311A+0.0023，R2=0.9991，測(cè)定馬齒莧多糖含量為62.22%

2.1.2 醋酸地塞米松溶液的制備 取適量將醋酸地塞米松片置于研缽中，充分研磨，用生理鹽水配制成濃度為0.0005 g/mL的溶液，備用。

2.2 分組、造模與給藥 將60只清潔級(jí)KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6組：正常組，LPS型組，醋酸地塞米松組（0.005 g/kg·d），馬齒莧多糖低、中、高劑量組（1.5、3、6 g/kg/d，生藥材），每組10只，按10 mL/kg體重灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d，除正常組和LPS組小鼠給予等量常溫生理鹽水，其他各組給予相應(yīng)體積的藥物。末次給藥后2 h，采用鼻腔滴注法慢慢滴注LPS生理鹽水溶液（0.5 mL/kg），正常組按照相同的方法給予相應(yīng)體積的生理鹽水[16]。建立模型[17]后小鼠禁食不禁水12 h，采用眼眶取血，隨后脫臼處死，并迅速取出肺組織，備用。

2.3 肺組織W/D值計(jì)算[18] 取小鼠右肺上葉，剔除肺組織上面結(jié)締組織，同時(shí)利用濾紙吸盡組織表面水分和血液，并稱量記錄為肺組織濕重;隨后將肺組織放置于溫度為80 ℃干燥箱中連續(xù)干燥48 h后，稱量記錄為肺組織干重，計(jì)算（W/D）。

2.4 肺組織中MPO活性測(cè)定 取適量小鼠肺組織置于組織勻漿器中，按試劑盒說(shuō)明書操作制備成5%的肺組織勻漿液，并檢測(cè)MPO活性。

2.5 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量測(cè)定 取血后，在低溫條件下4000 r/min離心10 min分離血清，取上清;按照試劑盒說(shuō)明書步驟，采用酶聯(lián)免疫吸附劑法測(cè)定各組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6 肺組織病理學(xué)檢查 切下右肺組織下葉經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后，用蒸餾水沖洗至無(wú)多聚甲醛味;然后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋，切片厚度5 μm。進(jìn)行切片脫蠟、蘇木素-伊紅染色、封片。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察分析，根據(jù)肺泡壁厚度、肺組織破壞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行評(píng)分[19]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分=最小損傷;1分=輕度損傷;2分=中度損傷;3分=重度損傷;4分=最大損傷。肺損傷評(píng)分為3個(gè)指標(biāo)評(píng)得分之總和。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析，計(jì)量資料均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧多糖對(duì)肺組織W/D值的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織W/B值顯著性升高（P<0.01）。與LPS組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠W/B值均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或0.01）。見(jiàn)表1。3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

3.2 馬齒莧多糖對(duì)肺組織中MPO活性的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織中MPO活性顯著性升高（P<0.01）。與LPS?? 組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠MPO活性均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或<0.01）。見(jiàn)表2。

3.3 馬齒莧多糖對(duì)血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量影響 與正常組比較，LPS組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著性升高（P<0.01）。與LPS組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）。見(jiàn)表3。

3.4 馬齒莧多糖對(duì)肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)滲出液，同時(shí)也沒(méi)有出現(xiàn)水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。LPS組小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的炎性浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚及間質(zhì)水腫等較為嚴(yán)重的病理?yè)p傷現(xiàn)象，與正常組比較，LPS組小鼠肺損傷評(píng)分顯著性升高（P<0.01）。與LPS組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠肺組織損傷均有不同程度的改善，同時(shí)肺損傷評(píng)分也有不同程度降低。如圖1所示。

4 討論

該研究通過(guò)鼻腔滴注LPS溶液建立ALI小鼠動(dòng)物模型。在滴注LPS后2～4 h內(nèi)可誘發(fā)ALI，在24～48 h內(nèi)便可造成最大肺損傷[20]，該種方法可有效避免由于皮下注射LPS溶液引起的全身炎癥反應(yīng)和臟器官衰竭[21]。革蘭陰性菌感染導(dǎo)致的肺炎是ALI最常見(jiàn)的誘導(dǎo)因素之一，由于LPS刺激巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致機(jī)體大量釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，進(jìn)一步引發(fā)急性炎癥反應(yīng)[22]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ALI的致病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者[23]認(rèn)為，ALI發(fā)生的主要原因是體內(nèi)促炎和抗炎系統(tǒng)失衡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠顯著性降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥細(xì)胞含量，提示馬齒莧多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI作用與其抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

肺組織的W/D值大小在一定程度上反映了水腫的程度[24]，肺水腫程度與W/D值密切相關(guān)，W/D值越大則肺水腫程度越大，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠顯著降低W/D值，從而緩解LPS所誘導(dǎo)的ALI。肺組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)LPS組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重，通過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后上述病理變化明顯得到減輕。

綜上，本研究結(jié)果顯示：馬齒莧多糖能夠降低肺組織W/D值和肺組織中MPO活性，同時(shí)降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子含量，提示馬齒莧多糖對(duì)LPS所致的ALI具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

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（收稿日期：2021-08-06 編輯：陶希睿）3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD