劉金環(huán)，張珊玲，宋 瑋，羅萬和,2，陳 偉,2,3

（1.塔里木大學動物科學與技術(shù)學院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，阿拉爾 843300）

由金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）引起的奶牛乳腺炎導(dǎo)致全球每天損失380 t牛奶[1-2]。更嚴重的是，金黃色葡萄球菌常以小菌落變異株（Staphylococcusaureussmall colony variants，SASCVs）的形式在機體內(nèi)持續(xù)存在，并形成生物被膜。研究表明，成膜的SASCVs菌株對抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)的清除作用有更強的抵抗力，進而導(dǎo)致奶牛反復(fù)和長期感染乳腺炎[3]。體外藥敏試驗結(jié)果表明，替米考星對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性，其最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為2.2 μg/mL[4]。但替米考星具有較大的苦味，味覺敏感的動物口服替米考星時，容易拒食和引起反胃[5]。更為嚴重的是，替米考星難以穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株。故臨床上，替米考星對SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎療效相對較差[6]。

作為黃酮醇類化合物的槲皮素具有多種生物活性，能抑制細菌胞外多糖基質(zhì)的產(chǎn)生，從而減少胞外多糖蛋白復(fù)合物的形成，阻止SASCVs生物被膜進入成熟階段，并且通過破壞生物被膜的完整性，使抗菌藥物更易作用于細菌，從而起到抑制細菌生長的作用[7-9]。且槲皮素副作用小，無致畸、致癌、致突變等毒性作用，被廣泛應(yīng)用于臨床中[10]。但槲皮素在水和有機溶劑中幾乎不溶，且易降解，極大地限制了槲皮素生物活性的發(fā)揮[11]。鑒于此，本研究以槲皮素為中草藥，替米考星為化學合成藥，制備一種槲皮素-替米考星混合物納米粒，用于治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎。本試驗通過篩選槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)反應(yīng)條件，對比槲皮素-替米考星混合物納米粒和商品化替米考星溶液對SASCVs菌株的抗菌活性，評價槲皮素-替米考星混合物納米粒的優(yōu)勢以期為治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 SASCVs菌株由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室提供。

1.1.2 藥品與試劑 替米考星原料藥（1404001）購自武漢維物起源生物科技有限公司；替米考星標準品（K0310711）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度為91.0%；槲皮素原料藥（20111013）購自上海源葉生物科技有限公司，純度為98.5%；替米考星溶液（030142264）購自河北地邦動物保健科技有限公司；聚乙二醇6000（981007）購自天津永晟精細化工有限公司；β-環(huán)糊精（20190319）和聚乙烯醇（P8136）均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 集熱式恒溫磁力攪拌器（DF-101S）購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；加熱磁力攪拌器（IT-07A3）購自上海滬西股份有限公司；渦旋振蕩儀（XW-80A）購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；激光納米粒度儀（ZS3600）購自丹東百特儀器有限公司；生物顯微鏡（BX41）購自O(shè)lympus公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LRH-250-S）購自上海悅豐儀器儀表有限公司；掃描電子顯微鏡（JSM-6390LV）購自NTC公司；高通量實時微生物生長儀（MicroScreen HT）購自杰靈儀器制造有限公司。

1.2 槲皮素-替米考星混合物納米粒的制備

1.2.1 最優(yōu)配方用量的篩選 稱取一定量的槲皮素（0.05、0.10、0.15和0.20 g）分別溶解于7.5% 20 mL的聚乙二醇溶液中，再稱取一定量的替米考星原料藥（0.2、0.3、0.4和0.5 g）分別加入到槲皮素-聚乙二醇混合溶液中，保證藥物含量最高，且無沉淀、變色、產(chǎn)生氣體、異物或其他變質(zhì)現(xiàn)象的槲皮素和替米考星原料藥用量為最優(yōu)用量。

1.2.2 最優(yōu)反應(yīng)條件的篩選 結(jié)合槲皮素與替米考星理化性質(zhì)，選取聚乙二醇溶液濃度（5.0%、7.5%、10.0%）、轉(zhuǎn)速（500、1 000、1 500 r/min）、反應(yīng)時間（0.5、1.0、2.0 h）、反應(yīng)溫度（25、50、75 ℃）為影響因素，設(shè)計L9（34）正交試驗（表1）。以所制備槲皮素-替米考星混合物納米粒的外觀性狀為評價指標篩選出槲皮素-替米考星混合物納米粒的最優(yōu)反應(yīng)條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor level table of orthogonal test

1.2.3 最優(yōu)槲皮素-替米考星混合物納米粒的制備 精確稱取1.2.1篩選出的槲皮素和替米考星原料藥的最優(yōu)用量，根據(jù)1.2.2所篩選出的最優(yōu)反應(yīng)條件，在最優(yōu)轉(zhuǎn)速下分別依次加入到20 mL最優(yōu)濃度聚乙二醇溶液中，在最優(yōu)的溫度下加熱并攪拌一定時間，最后將混合溶液通過0.45 μm的微孔濾膜，即得到最優(yōu)槲皮素-替米考星混合物納米粒。根據(jù)《中國獸藥典（2010版）》[12]中對于液體制劑的要求，觀察槲皮素-替米考星混合物納米粒的外觀性狀，包括氣味、顏色、狀態(tài)等，判斷其有無變色、發(fā)霉、產(chǎn)生氣體、異物或其他變質(zhì)現(xiàn)象。

1.3 表征

1.3.1 微觀形態(tài) 準確量取所制備的槲皮素-替米考星混合物納米粒100 μL，于光學顯微鏡下觀察其形態(tài)。并準確量取該納米粒1 mL，用蒸餾水稀釋100倍并搖勻，吸取2 μL樣品滴在帶有薄膜的銅網(wǎng)上，待其干燥后通過掃描電鏡觀察納米粒形態(tài)。

1.3.2 沉降體積比 準確量取30 mL槲皮素-替米考星混合物納米粒置于量筒中并搖勻，放置于水平面上靜置3 h，將沉降前懸浮物的液面初始高度記錄為H0，待靜置3 h后觀察沉降物部分的高度不再改變時為記為H，其沉降體積比（F）為H/H0。

1.3.3 再分散性 準確量取30 mL槲皮素-替米考星混合物納米粒于量筒中，室溫下放置1周后，以20 r/min的速度旋轉(zhuǎn)，根據(jù)量筒中的納米顆粒是否能重新均勻分散來評價槲皮素-替米考星混合物納米粒的再分散性。

1.3.4 Zeta電位和粒徑 準確量取200 μL槲皮素-替米考星混合物納米粒，用蒸餾水稀釋100倍，保存于5 mL離心管中備用，使用馬爾文納米激光粒度儀測定Zeta電位和粒徑，每次試驗重復(fù)測定3次，取平均值。

1.4 抗菌活性評價

1.4.1 SASCVs菌株生長曲線的繪制 挑取單個SASCV菌落接種于2 mL MH肉湯培養(yǎng)基中。用Micro Screen高通量實時微生物生長儀記錄細菌的濃度。以細菌濃度的對數(shù)（lg CFU/mL）的平均值為縱軸，以時間為橫軸繪制SASCVs菌株在MH肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線。

1.4.2 瓊脂擴散法測定抑菌圈 取100 μL對數(shù)生長期SASCVs菌懸液，均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基表面。涂布均勻后，在每個平板上打4個孔，分別加入生理鹽水和濃度為10 μg/mL的市售替米考星溶液、替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒各100 μL。將瓊脂板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用游標卡尺測定并對比各劑型在瓊脂板中抑菌圈直徑的大小。

1.4.3 微量肉湯稀釋法測定MIC 采用微量肉湯稀釋法測定市售替米考星溶液、替米考星原料藥和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的MIC。將市售替米考星溶液、替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒用MH肉湯倍比稀釋成終濃度為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.06 μg/mL。 將稀釋好的藥物和菌液（1×106CFU/mL）按體積比1∶1混于96孔板中，使接入96孔板中細菌終濃度為5×105CFU/mL左右。在15 min內(nèi)完成96微孔板的混菌。設(shè)置只含菌液不含藥物的陽性對照孔和只含培養(yǎng)基不含菌的陰性對照孔。設(shè)置3個平行且至少重復(fù)3次，于37 ℃普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h。并以金黃色葡萄球菌ATCC 29213、藥物環(huán)丙沙星作質(zhì)控。每次測定MIC值必須保證質(zhì)控菌的結(jié)果符合規(guī)定的質(zhì)控范圍試驗結(jié)果才有效；否則所有結(jié)果作廢[13]。

1.4.4 不同替米考星制劑對SASCVs菌株的體外殺菌曲線 配制含1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC市售替米考星溶液、替米考星原料藥和槲皮素-替米考星混合物納米粒的MH肉湯1 mL，另以空白肉湯作為生長對照。將不同濃度的含藥肉湯置于無菌細菌瓶中，分別加入1 mL對數(shù)期的SASCVs菌液，對照組做同樣處理，混勻后置于培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)。取空白對照瓶進行細菌計數(shù)，得初始細菌濃度。于0、1、2、4、8、12、18、24、48和72 h分別吸取培養(yǎng)液100 μL稀釋后進行細菌計數(shù)，計數(shù)時設(shè)置3個平行取平均值。得到各時間點不同濃度存活菌落數(shù)后，取此對數(shù)值為縱軸，時間點為橫軸繪制殺菌曲線，分析市售替米考星溶液、替米考星原料藥和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的殺菌作用。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，比較替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液抑菌活性的差異顯著性，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)配方和條件篩選

以外觀性狀為評價指標，當替米考星為0.4 g、槲皮素為0.1 g、溶劑為20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液，在轉(zhuǎn)速為1 000 r/min、反應(yīng)時間為1 h、反應(yīng)溫度為50 ℃時，所制備的槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)，其顏色清亮，無沉淀和絮狀物，且無發(fā)霉、變色、產(chǎn)生氣體等其他變質(zhì)現(xiàn)象（圖1）。

圖1 槲皮素-替米考星混合物納米粒的外觀性狀Fig.1 Appearance properties of quercetin-tilmicosin mixture nanoparticles

2.2 表征

2.2.1 微觀形態(tài) 光學顯微鏡下最優(yōu)配方的槲皮素-替米考星混合物納米粒分布均勻，顆粒大小一致（圖2A）；掃描電鏡下最優(yōu)配方的槲皮素-替米考星混合物納米粒顆粒大小均一，分布均勻，表面光滑平整（圖2B）。

A，光鏡下圖像（800×）;B，SEM圖像（10 000×）A，Light microscope image （800×）;B，SEM images（10 000×）圖2 槲皮素-替米考星混合物納米粒微觀形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles

2.2.2 沉降體積比 所制備槲皮素-替米考星混合物納米粒的F 值為1，表明該納米粒穩(wěn)定性高。

2.2.3 再分散性 量筒下部的槲皮素-替米考星混合物納米粒能夠很快地重新均勻分散且流動性良好，表明該納米粒不易凝集，再分散性良好。

2.2.4 Zeta電位和粒徑 所制備最優(yōu)配方的槲皮素-替米考星混合物納米粒Zeta 電位為-7.69 mV（圖3A），粒徑為741.9 nm（圖3B）。

圖3 槲皮素-替米考星混合物納米粒Zeta電位（A）和粒徑（B）Fig.3 Zeta potential （A） and particle size （B） of quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles

2.3 抗菌活性評價

2.3.1 SASCVs菌株生長曲線 SASCVs菌株在MH肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線如圖4所示。在1～3 h時，細菌生長緩慢，處于遲緩期；在4～24 h時，細菌生長迅速，細菌數(shù)目以幾何級數(shù)增加，處于對數(shù)生長期。 在25～28 h時，細菌生長數(shù)與死亡數(shù)幾乎相等，活菌數(shù)目不增不減，處于穩(wěn)定期。 在29～48 h，死亡細菌數(shù)目逐漸上升，活菌數(shù)減少，處于衰亡期。

圖4 SASCVs菌株在MH肉湯中的生長曲線（n=3）Fig.4 Growth curve of SASCVs strain in MH broth （n=3）

2.3.2 瓊脂擴散法測定抑菌活性 替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液的抑菌圈直徑分別為（2.54±0.51）、（1.51±0.23）和（1.38±0.17）cm，槲皮素-替米考星混合物納米粒的抑菌區(qū)域比相同濃度的市售替米考星溶液略大，小于替米考星標準品，但三者之間差異均不顯著（P>0.05）。

2.3.3 微量肉湯稀釋法測定抑菌活性 替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株的MIC分別為1、1和2 μg/mL。由此可見，替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的MIC相等，且小于市售替米考星溶液對SASCVs菌株的MIC，但三者之間差異均不顯著（P>0.05）。

2.3.4 體外殺菌曲線 替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株的體外殺菌曲線如圖5所示。結(jié)果表明，替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株均具有較強的殺菌能力，且3種藥物均隨濃度的增加，對SASCVs菌株的殺菌效果隨之增加。當替米考星標準品為2MIC時（4 μg/mL）、槲皮素-替米考星混合物納米粒為1MIC（1 μg/mL）和市售替米考星為1MIC（1 μg/mL）時，均已經(jīng)表現(xiàn)出殺菌作用。

圖5 替米考星標準品（A）、市售替米考星溶液（B）和槲皮素-替米考星混合物納米粒（C）對SASCVs菌株的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of tilmicosin standard （A）,commercial tilmicosin solution （B） and quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles （C） against SASCVs strain

3 討 論

奶牛乳腺炎給奶牛業(yè)帶來了巨大損失，由于SASCVs菌株可在機體內(nèi)持續(xù)存在，會引起奶牛持續(xù)性和反復(fù)性感染乳腺炎[14-16]。雖然替米考星對金黃色葡萄球菌的MIC值較低，具有較強的抗菌活性，但SASCVs菌株表面易形成生物被膜，常規(guī)抗菌藥物劑型難以穿透生物被膜直接作用于SASCVs菌株，常引起奶牛乳腺炎治療失敗[17-19]。槲皮素通過阻止SASCVs生物被膜進入成熟階段，破壞生物被膜的完整性，使抗菌藥物更易作用于細菌，從而起到抑制細菌生長的作用，被廣泛應(yīng)用于臨床中[20-21]。當槲皮素-替米考星混合物納米粒作用于SASCVs生物被膜，槲皮素會破壞SASCVs生物被膜的完整性，可有助于替米考星穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株，從而起到殺菌作用。故本研究以槲皮素為中草藥，替米考星為化學合成藥，制備一種適用于治療由SASCVs菌株引起奶牛乳腺炎的槲皮素-替米考星混合物納米粒。

本試驗以外觀性狀篩選槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)配方，發(fā)現(xiàn)槲皮素的溶解性較差，與文獻報道一致[22-23]。當替米考星為0.4 g、槲皮素為0.1 g、溶劑為20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液，在轉(zhuǎn)速為1 000 r/min、反應(yīng)時間為1 h、反應(yīng)溫度為50 ℃時，可獲得槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)配方。其外觀形性狀符合《中國獸藥典（2010版）》[12]中對于液體制劑的要求。光學顯微鏡和掃描電鏡下的槲皮素-替米考星混合物納米粒分布均勻，顆粒大小一致；根據(jù)《中國獸藥典（2010版）》[12]規(guī)定沉降體積比F值不得低于0.9。F值越大，表示沉降物的高度越接近納米粒的原始高度，納米粒就越穩(wěn)定[12]。本研究所制備槲皮素與替米考星混合物納米粒的F值為1，表明該納米粒穩(wěn)定性高[24]。且該納米粒能夠很快地重新均勻分散且流動性良好，表明該納米粒不易凝集，再分散性良好[25]；該納米粒平均粒徑為741.9 nm，與其他文獻報道的替米考星納米粒[26-28]相比，粒徑偏大；Zeta電位為-7.69 mV，有利于該混合物納米粒制劑通過靜電作用與SASCVs生物被膜表面正電荷相作用，并吸附于生物被膜表面，從而更有利于該納米粒破壞SASCVs生物被膜的完整性，促進替米考星穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株[29]。因此，本試驗所研制的槲皮素-替米考星混合物納米粒符合納米粒的制備要求。

肉湯培養(yǎng)基中，SASCVs菌株在1～3 h處于遲緩期，4～24 h處于對數(shù)期，25～28 h處于穩(wěn)定期，29～48 h處于衰亡期，符合常規(guī)細菌生長規(guī)律[30]。3種不同制劑的抑菌圈直徑大小表現(xiàn)為替米考星標準品>槲皮素-替米考星混合物納米粒>市售替米考星溶液。由此可見，槲皮素-替米考星混合物納米粒的抑菌區(qū)域比相同濃度的市售替米考星溶液略大，但小于替米考星標準品。此結(jié)果可能是由于槲皮素的加入，使納米粒的抑菌圈直徑大于市售替米考星溶液。但是又由于在瓊脂培養(yǎng)基中，納米粒擴散較差，故納米粒的抑菌圈直徑小于替米考星標準品[31]。且微量肉湯稀釋法測定MIC值發(fā)現(xiàn)，替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的MIC相等，且小于市售替米考星溶液對SASCVs菌株的MIC值，表明槲皮素-替米考星混合物納米粒和替米考星標準品具有相同的殺菌活性，且強于市售替米考星溶液。當藥物濃度為4、8和16MIC時，8 h內(nèi)殺菌速度和程度仍然相應(yīng)增加，即為濃度依賴性的藥物[32-33]。所以，由體外殺菌曲線可知，替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株的殺菌能力呈現(xiàn)出濃度依賴性，即替米考星濃度越大，對SASCVs菌株的殺菌效果就越強。且根據(jù)殺菌速率和程度，發(fā)現(xiàn)槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的殺菌能力略大于替米考星標準品，明顯大于市售替米考星溶液。

4 結(jié) 論

本研究所制備的槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株具有較強的殺菌能力，可為治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基礎(chǔ)研究資料。