王 璐，胡盼盼，程 佳，孫盼盼，孫 娜，范闊海，尹 偉，李宏全，孫耀貴

（中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

穿王消炎粉是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室依據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]收載的“穿王消炎片”（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為:WS-10487（ZD-0487）-2002，主要功效為消炎解毒，用于痰熱咳喘，腹痛，以及急慢性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎，急性腸胃炎、急性菌痢見(jiàn)以上癥狀者），按照《中獸藥、天然藥物分類及注冊(cè)資料要求》[2]屬第三類下第2項(xiàng)“現(xiàn)代中獸藥復(fù)方制劑”要求，將穿心蓮和了哥王兩味中藥經(jīng)提取制備而成，以為畜禽呼吸道和消化道感染性疾病的防治提供新的治療藥物，且滿足在飼料中添加解決畜禽群體給藥的需要。穿心蓮是爵床科植物穿心蓮（Andrographispaniculata（Burm.f.） Nees）的干燥地上部分[3]，性寒，味苦，歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)，主要功效為清熱解毒、涼血、消腫，藥用活性成分主要為二萜內(nèi)酯類、黃酮類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類等，具有抗菌、抗病毒、抗炎、解熱、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗心血管疾病等作用[4-5]，臨床上主要用于治療呼吸道和消化道感染等疾病[6]。 了哥王（Wikstroemiaindica）是瑞香科蕘花屬植物南嶺蕘花的干燥根或根皮[7]，性寒，味苦、微辛，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結(jié)、消腫止痛、通經(jīng)利水等功效，主要活性成分為香豆素類、黃酮類和木脂素類[8]，具有消炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[9]，主要用于治療支氣管炎、肺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。

病原微生物感染引發(fā)的呼吸道疾病對(duì)畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害，其引起的急性肺損傷（ALI）是造成畜禽呼吸衰竭乃至死亡的重要原因[10]。研發(fā)安全、有效的用于防治ALI的新獸藥已成為研究熱點(diǎn)，對(duì)于降低畜禽呼吸道感染性疾病的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。以脂多糖（LPS）為代表的生物因素誘導(dǎo)的ALI模型是評(píng)價(jià)篩選防治ALI藥物的最常用的方法[11]。研究表明，穿心蓮活性成分穿心蓮內(nèi)酯能夠緩解LPS誘導(dǎo)的ALI[12]。有關(guān)了哥王對(duì)ALI的治療作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)LPS誘導(dǎo)的ALI模型，開展穿王消炎粉對(duì)ALI的治療作用研究，以為其后續(xù)臨床試驗(yàn)研究、新獸藥注冊(cè)申報(bào)及在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 60只體重160～200 g的SD雄性大鼠，購(gòu)自北京斯貝福公司，飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心（溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光/暗周期），以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 藥物與試劑 穿王消炎粉制備：穿心蓮和了哥王生藥購(gòu)自河北省安國(guó)市祁源中藥材有限公司。按處方配比（3∶2）分別稱取穿心蓮和了哥王，將穿心蓮粉碎成粗粉，用85%的乙醇熱浸2次，每次2 h，合并提取液，靜置并過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮成浸膏備用；了哥王水煎2次，每次5 h，混合煎液并過(guò)濾。將了哥王濾液與穿心蓮濃縮液混合，濃縮成稠膏，低溫烘干后粉碎、過(guò)篩成細(xì)粉。分別稱量2、4、8 g穿王消炎粉干粉于20 mL CMC-Na溶液中，混合均勻。鹽酸左氧氟沙星藥液配制：稱取14 mg鹽酸左氧氟沙星藥粉（鹽酸左氧氟沙星膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990051，購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）溶于20 mL CMC-Na溶液中，混合均勻。LPS（大腸桿菌055∶B5，貨號(hào)L8880，純度≥99%）購(gòu)自Solarbio公司；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β） ELISA試劑盒（貨號(hào)：E02I0010）、IL-6 ELISA試劑盒（貨號(hào)：E02I0006）均購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司；TRIzol和兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；RIPA buffer和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸酶抑制劑購(gòu)自Bimake公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)于Solarbio公司；蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β抗體（貨號(hào):bs-0812R）、IL-6抗體（貨號(hào):bs-0782R）和GAPDH抗體（貨號(hào):bs-10900R）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG（貨號(hào):CW0103S）購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機(jī)（Leica公司）；高速低溫離心機(jī)（Eppendorf公司）；倒置顯微鏡（Leica公司）；7500定量PCR儀（Bio-Rad公司）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司）；電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.2 試驗(yàn)處理

將SD大鼠隨機(jī)分為6組，具體為：空白組（Control）、左氧氟沙星陽(yáng)性藥物對(duì)照組（Levofloxacin）、LPS模型組（Model）、穿王消炎粉低劑量組（Low，1 g/kg體重）、穿王消炎粉中劑量組（Mid，2 g/kg體重）、穿王消炎粉高劑量組（High，4 g/kg 體重）。采用滴鼻LPS的方法制備大鼠ALI模型[13]。除空白組外,其余試驗(yàn)組大鼠均滴鼻LPS（3 mg/kg體重），24 h后穿王消炎粉給藥組每日灌服相應(yīng)濃度的穿王消炎粉溶液，陽(yáng)性藥物對(duì)照組灌胃左氧氟沙星溶液（7 mg/kg體重），空白組及模型組灌胃相同體積的生理鹽水。每天16:00灌胃，在治療的第4天處死，并剖檢大鼠，采集肺臟樣本。

1.3 觀察和檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 臨床癥狀觀察 每日灌胃前觀察各組大鼠的精神狀態(tài)，飲食以及呼吸情況。

1.3.2 肺臟組織濕/干重比 從剖檢的肺臟中收集右肺右上葉和右中葉，除去脂肪后立即稱重。將稱重后的肺臟組織放在60 ℃烘箱中干燥72 h，72 h后從烘箱中取出肺臟組織再次稱重，并計(jì)算大鼠肺臟組織的濕/干重比。

1.3.3 肺臟組織病理學(xué)觀察 取右肺右下葉和右后葉，除去肺臟組織表面的脂肪，用濾紙吸干表面液體，固定于Bouin’s液中24 h，將固定好的組織用70%酒精浸泡3次以上，每次6 h，脫水、透明、石蠟包埋，切厚度為5 μm的切片，通過(guò)梯度乙醇將切片脫水，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝組織病理學(xué)變化。

1.3.4 血清中IL-1β、IL-6含量 采用ELISA方法測(cè)定。將96孔酶標(biāo)包被板各孔編號(hào)并記錄，按照說(shuō)明書依次在標(biāo)準(zhǔn)孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，空白孔加入50 μL樣本稀釋液，待測(cè)樣品孔加入40 μL樣本稀釋液和10 μL待測(cè)樣本，并設(shè)置3個(gè)平行，除空白孔外其余各孔均加入100 μL酶標(biāo)試劑。用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次，后加入顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15 min，加終止液50 μL，測(cè)定450 nm各孔吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品實(shí)際蛋白濃度。

1.3.5 肺臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平 取凍存的左肺組織放到裝有液氮的研缽中，充分研磨后，稱取0.2 g加入1 mL TRIzol，按步驟提取總RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找目的基因序列，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由西安擎科澤西生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH為管家基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-1β和IL-6基因的表達(dá)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.6 肺臟組織中IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)量 將凍存的肺臟組織研磨后，每個(gè)樣品用1 mL含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA Buffer進(jìn)行裂解，在冰上靜置40 min，每隔10 min振蕩1次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分層后的上清即為肺臟組織的總蛋白。利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度后將蛋白變性（95 ℃，10 min）。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入IL-1β抗體、IL-6抗體和GAPDH抗體,4 ℃搖床過(guò)夜孵育，后用TBST洗3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。內(nèi)參對(duì)照為GAPDH，使用Image J軟件通過(guò)掃描光密度測(cè)定法分析蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)分析軟件中單因素方差分析（One-Way ANOVA）和多重比較（LSD）分析各組大鼠各觀測(cè)指標(biāo)之間的差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般狀況

建模期間，空白組大鼠表現(xiàn)正常，反應(yīng)靈活，行動(dòng)敏捷；其余5組以滴鼻法給予LPS后，食欲下降，被毛豎立，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，蜷縮抱團(tuán)。用藥4 d后，各給藥組大鼠與LPS模型組大鼠相比，食欲增加，活動(dòng)量增多，精神狀態(tài)均比模型組大鼠好。

2.2 肺臟組織的濕/干重比

由圖1可知，與空白組相比，LPS模型組大鼠肺臟組織的濕/干重比極顯著增加（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉組和左氧氟沙星組大鼠肺臟濕/干重比均不同程度降低（P<0.01），有劑量依賴性的趨勢(shì)，其中穿王消炎粉中劑量組肺臟組織濕/干重比與低劑量組存在顯著差異（P<0.05），高劑量組與中劑量組差異極顯著（P<0.01），高劑量組與左氧氟沙星組無(wú)顯著差異（P>0.05）。

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著（P>0.05）。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference （P<0.05）;And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference （P<0.01）;While with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）.The same as below圖1 各組大鼠肺臟組織濕/干重比Fig.1 Rat wet/dry weight ratio in lung tissues of different groups

2.3 肺臟組織病理學(xué)變化

由圖2可知，空白組無(wú)水腫無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隙清晰。LPS模型組中，觀察到肺泡壁水腫和出血，肺泡間質(zhì)增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和其他明顯的肺損傷。與LPS模型組相比，穿王消炎粉各劑量組上述變化依次減輕，穿王消炎粉高劑量組肺臟組織間隙中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞滲出明顯減少，肺泡腔炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

A,空白組;B,左氧氟沙星陽(yáng)性藥物對(duì)照組;C,LPS模型組;D,穿王消炎粉低劑量組;E,穿王消炎粉中劑量組;F,穿王消炎粉高劑量組A,Blank group;B,Levofloxacin-positive drug group;C,LPS model group;D,Chuanwang Xiaoyan powder low-dose group;E,Chuanwang Xiaoyan powder medium-dose group;F,Chuanwang Xiaoyan powder high-dose group圖2 各組大鼠肺臟組織切片（HE染色）病理學(xué)變化（400×）Fig.2 Pathological changes of lung tissue sections （HE staining） in different groups （400×）

2.4 血清中IL-1β、IL-6的含量

由圖3可知，與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉中和高劑量組的IL-1β、IL-6含量均極顯著降低（P<0.01），其中高劑量組IL-1β、IL-6含量與空白組無(wú)顯著差異（P>0.05）。

圖3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量Fig.3 Serum IL-1β and IL-6 contents of rats in different groups

2.5 肺臟組織中IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)量

由圖4可知，與空白組相比，LPS模型組大鼠肺臟組織中炎性因子IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉和左氧氟沙星處理均可極顯著降低IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)量（P<0.01），其中穿王消炎粉高劑量組IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)量均與左氧氟沙星組均差異不顯著（P>0.05）。

圖4 各組大鼠肺臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)量Fig.4 The mRNA expression levels of IL-1β and IL-6 in lung tissues of rats in different groups

2.6 肺臟組織中IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)量

由圖5可知，與空白組相比，LPS模型組IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉各組IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)量隨穿王消炎粉劑量增加呈降低趨勢(shì)，高劑量組IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)量和左氧氟沙星組均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

A,Western blotting條帶圖;B、C，分別為IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)量A,Western blotting strip chart；B and C,Protein expression levels of IL-1β and IL-6,respectively圖5 各組大鼠肺臟組織中IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)量Fig.5 Protein expression levels of IL-1β and IL-6 in lung tissues of rats in different groups

3 討 論

LPS建立ALI模型是目前最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病模型，通常用LPS誘導(dǎo)建立，給藥途徑有腹腔注射法、尾部靜脈注射法、氣管內(nèi)給藥法、滴鼻吸入法[14-16]。腹腔注射法和尾部靜脈注射法均易引起全身炎癥反應(yīng)，劑量過(guò)大時(shí)還易導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物死亡；氣管內(nèi)給藥法對(duì)操作要求較高，切口處極易被微生物感染而出現(xiàn)炎癥，影響試驗(yàn)結(jié)果；而滴鼻吸入法操作簡(jiǎn)便，且誘導(dǎo)急性肺部炎癥較明顯[14]。肖亞強(qiáng)等[17]通過(guò)滴鼻吸入法建立了大鼠ALI模型，模型大鼠表現(xiàn)為肺臟組織結(jié)構(gòu)受損、水腫、肺泡及間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。水腫和出血是肺部炎性損傷的主要特征[18]。本研究通過(guò)滴鼻吸入LPS構(gòu)建大鼠肺損傷模型，與空白組相比，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，肺組織濕/干重比升高，病理組織切片觀察到肺泡壁出血、水腫，間質(zhì)增厚，表明模型構(gòu)建成功。

研究表明，炎性因子含量急劇升高是急性炎癥的共同表現(xiàn)[19-20]。LPS通過(guò)改變炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來(lái)誘導(dǎo)急性炎癥[21-22]，在此過(guò)程中大量的炎性細(xì)胞被激活，產(chǎn)生炎癥因子，最終造成肺損傷。研究顯示，IL-1β和IL-6的分泌水平大幅上升會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，引起器官組織細(xì)胞損傷，對(duì)動(dòng)物機(jī)體會(huì)產(chǎn)生傷害[23]。IL-1β作為炎癥反應(yīng)的早期物質(zhì)，在炎癥形成過(guò)程中起到了積極作用，可以促進(jìn)其他促炎因子釋放，維持炎癥誘導(dǎo)反應(yīng)，是IL-6表達(dá)的主要激活劑。IL-6主要由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌，其表達(dá)水平的高低可以指征炎癥的輕重，可作為內(nèi)毒素所致肺損傷模型中急性炎癥的標(biāo)志[24]，其作為促炎細(xì)胞因子，在宿主防御中起重要作用[25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠的肺臟組織中肺泡間質(zhì)增厚，出現(xiàn)積液，這可能是炎癥因子大量釋放所導(dǎo)致。穿心蓮的主要成分是穿心蓮內(nèi)酯[26]，李學(xué)勤等[27]發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可以減少促炎因子IL-1β、IL-6分泌，進(jìn)而減輕肺部損傷程度，對(duì)肺臟組織具有保護(hù)作用；張婕斐等[28]和柯雪紅等[29]研究發(fā)現(xiàn)了哥王對(duì)急性炎癥具有良好治療效果；楊振宇等[30]發(fā)現(xiàn)了哥王水提物無(wú)毒性，同時(shí)對(duì)細(xì)菌也具有抑制作用。本試驗(yàn)用穿王消炎粉對(duì)ALI大鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺臟的炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量均顯著高于空白組，穿王消炎粉處理組中以高劑量組（4 g/kg體重）IL-1β和IL-6水平降低最顯著，說(shuō)明穿王消炎粉可以通過(guò)降低IL-1β和IL-6的分泌水平對(duì)ALI起到治療作用。

綜上所述，穿王消炎粉（4 g/kg體重）可以明顯改善LPS誘導(dǎo)的ALI和炎癥程度，效果與陽(yáng)性藥左氧氟沙星相似。目前穿王消炎粉緩解肺損傷的機(jī)制尚不明確，后續(xù)將對(duì)其作進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

穿王消炎粉（4 g/kg體重）可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺部損傷和炎癥程度，減少炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌，對(duì)ALI有治療作用。