張 文，覃志彪，成 靜，于美玲，韋英益，黎 江，胡庭俊

（廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005）

辣蓼來源于蓼科蓼屬植物辣蓼及水蓼的全草，廣泛分布于廣西、廣東、四川等地[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼富含有機酸、黃酮類和萜類等化學成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等功效[4-7]。相關研究還發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能有效增強動物的免疫功能，將辣蓼黃酮作為飼料添加劑應用于畜牧水產(chǎn)方面對其疾病防控和健康生態(tài)養(yǎng)殖具有十分重要的意義[8]。大量臨床應用表明，辣蓼具有抗癌和抗腫瘤、鎮(zhèn)痛止血等多種生物活性[9-11],且隨著國內(nèi)外對其研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)辣蓼除了上述活性之外，還有許多值得進一步研究的功效。

為了將辣蓼黃酮提取物作為一種新型飼料添加劑，保證其安全性,本研究采取灌胃給藥的方式進行小鼠急性毒性試驗，對辣蓼黃酮提取物的毒性進行初步判斷。通過其試驗結果篩選出不同濃度的辣蓼黃酮提取物添加到飼料中，監(jiān)測大鼠的臨床體征、飲水量、采食量、體重、血常規(guī)指標、血液生化指標及病理組織學變化以考察辣蓼黃酮提取物是否具有明顯或潛在的毒副作用，評價其安全性，旨在為辣蓼黃酮提取物臨床使用劑量及更廣泛的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

辣蓼黃酮提取物由廣西大學動物科學技術學院制備。辣蓼黃酮的含量為65.37 mg/g，其中蘆丁含量為12.91 mg/g，槲皮苷含量為52.46 mg/g。

1.2 試驗動物

8周齡SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體重為 18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002；4周齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重為（100±20） g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （桂）2019-0003。

1.3 主要儀器

生物組織石蠟包埋機（YB-6LF）和生物組織自動脫水機（ZT-12M）均購自孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司；分析天平（EL204）購自Metteler-TOledo公司；全自動生化分析儀（Hitachi-7180）和全自動血液分析儀（Sysmex-2100）均購自希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司；電熱恒溫干燥箱（DHG-9071A）購自上海精宏實驗設備有限公司；輪轉(zhuǎn)式切片機（RM2245）購自徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.4 急性毒性試驗

1.4.1 急性毒性試驗預試驗 依據(jù)《獸藥急性毒性試驗（LD50測定）指導原則》，將20只SPF級昆明系小鼠隨機分為5組，每組4只，雌、雄各半。根據(jù)預試驗給予辣蓼黃酮5 g/kg BW未見小鼠死亡，故設5個劑量組，按照5 g/kg BW的4、2、1、0.5和0.25倍設計給藥劑量，則每組小鼠分別給予辣蓼黃銅提取物20、10、5、2.5和1.25 g/kg BW，隔夜空腹灌胃，24 h內(nèi)分2次等容積灌胃給藥，合并為單日一次劑量計算。試驗期間，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)、采食、飲水、健康狀況等，給藥后第8天，剖檢觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢、睪丸、胃和腸等是否存在異常。

1.4.2 最大給藥量試驗 根據(jù)急性毒性試驗確定最大給藥試驗的劑量為30 g/kg BW，灌胃前禁食12 h，每日灌胃3次，每次每只小鼠0.2 g/1.0 mL。試驗期間，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)、采食、飲水、健康狀況等，給藥后第8天，剖檢觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢/睪丸、胃和腸等是否存在異常。

1.5 亞慢性毒性試驗

1.5.1 試驗分組及給藥 80只SPF級SD大鼠，喂養(yǎng)觀察 7 d并稱重。利用Excel軟件進行隨機區(qū)組分組方法分為4組，每組 20 只，雌雄各半，雌雄分籠飼養(yǎng)，共8個籠。設高、中、低劑量辣蓼黃酮組（20、10和5 g/kg BW）和對照組（0 g/kg BW）。大鼠全價飼料用粉碎機粉碎，將辣蓼黃酮用藥劑量按大鼠每日飼料攝入量為體重的 10% 折算后，分別按照高、中、低劑量組混入飼料,充分混勻后加適量雙蒸水揉搓擠壓成條狀，55 ℃ 烘箱烘干；對照組飼料除不添加辣蓼黃酮外，與其他劑量組處理方式相同。連續(xù)給藥 30 d 后停藥，其后每組剩余大鼠喂普通全價飼料觀察 7 d。

1.5.2 臨床觀察及檢測 試驗期間每天觀察大鼠的一般行為表現(xiàn)、中毒及死亡情況，并記錄大鼠的體重、攝食量和飲水量，每周稱量一次體重，血常規(guī)檢測項目包括白細胞（WBC）、淋巴細胞（LYMPH）、中間細胞（MID）、中性粒細胞（GRA）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）；生化指標檢測包括白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、總蛋白（TP）；采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢、睪丸、胃和腸等臟器稱重，計算臟器系數(shù)，制作切片進行病理學檢查。

臟器系數(shù)=臟器重量/體重

增重率（%）=（終末重-初始重）/初始重×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行One-Way ANOVA方差齊性分析，如方差分析結果P>0.05則進行單因素方差分析，如P<0.05則進行Kruskal-Wallis H檢驗。結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 急性毒性試驗結果

2.1.1 急性毒性試驗預試驗結果 試驗觀察期間，未見中毒癥狀且小鼠全部存活，試驗期間小鼠采食、排便、日常行為等未見異常。試驗第 8天，剖檢觀察小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢/睪丸、胃、腸等均沒有發(fā)現(xiàn)異常情況，無法測出辣蓼黃酮提取物的半數(shù)致死量（LD50），說明藥物安全性較高。

2.1.2 急性毒性試驗最大給藥量試驗結果 試驗期間，小鼠未出現(xiàn)中毒或死亡情況。小鼠采食、飲水、排便及日?；顒訜o異常情況，被毛、可視黏膜未見異常，剖檢后觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢/睪丸、胃和腸等主要臟器無肉眼可見病變。

2.2 亞慢性毒性試驗結果

2.2.1 一般觀察 試驗期間，各組大鼠未見死亡情況。大鼠被毛順滑有光澤，可視黏膜顏色正常，呼吸狀態(tài)良好，飲水、攝食未見異常，排泄物形態(tài)正常，分泌物未見異常增加，未出現(xiàn)行為異常情況。

2.2.2 飲水量 給藥第7、21天及停藥后7 d各劑量組大鼠的每日飲水量差異不明顯；給藥第14天，與對照組雌性大鼠相比，中劑量組雌性大鼠飲水量極顯著增加（P<0.01）；給藥第28天，與對照組雄性大鼠相比，低劑量組中雄性大鼠飲水量極顯著增加（P<0.01）（表1）。

表1 大鼠每日每只平均飲水量統(tǒng)計結果Table 1 Statistical results of average daily drinking water consumption of each rat mL

2.2.3 采食量 給藥第14天高、中劑量組雌性大鼠的采食量顯著低于對照組（P<0.05）；自給藥21 d起各組大鼠的采食量差異不顯著（P>0.05）（表2）。

表2 大鼠每日每只平均采食量變化結果Table 2 The change of average daily intake of each rat g

2.2.4 體重變化 給藥第7天，中劑量組雄性大鼠體重顯著低于對照組（P<0.05）；給藥第14天高、中劑量組雌性大鼠體重顯著低于對照組（P<0.05）；自給藥第21天起各組體重差異不顯著（P>0.05）；各給藥組大鼠增重率與對照組相比差異均不顯著（P>0.05）（表3）。

2.2.5 血常規(guī)指標 給藥30 d后對部分大鼠進行血常規(guī)指標檢測，與對照組雌性大鼠相比，中劑量組雌性大鼠白細胞指標顯著下降（P<0.05）。與對照組雄性大鼠相比，高、中劑量組雄性大鼠白細胞指標顯著或極顯著下降（P<0.05；P<0.01）；高劑量組雄性大鼠淋巴細胞指標顯著下降（P<0.05）；高劑量組雄性大鼠中性粒細胞指標顯著上升（P<0.05）。其余各組之間各指標差異均不顯著（P>0.05），停藥7 d后，各組之間無顯著差異（P>0.05）（表4、5）。

2.2.6 血液生化指標 給藥30 d 后，與對照組雌性大鼠相比，高劑量雌性大鼠血液中TG水平顯著上升（P<0.05）；中劑量組雌性大鼠BUN水平顯著下降（P<0.05），CREA水平顯著上升（P<0.05）；低劑量組雌性大鼠ALT、TG水平均顯著上升（P<0.05）。與對照組雄性大鼠相比，高劑量組雄性大鼠BUN、CREA和TBIL水平均顯著下降（P<0.05）；中、低劑量組雄性大鼠BUN水平顯著下降（P<0.05）；其余各組之間各指標差異均不顯著（P>0.05）（表6）。

停藥7 d后，與對照組雌性大鼠相比，高劑量組雌性大鼠AST、TG水平均顯著降低（P<0.05），CREA、TP水平均顯著升高（P<0.05）；低劑量組雌性大鼠GLB水平顯著升高（P<0.05），TG水平顯著降低（P<0.05）。與對照組雄性大鼠相比，高劑量組雄性大鼠GLU、TBIL水平均顯著降低（P<0.05），TP含量水平顯著升高（P<0.05）；中劑量組雄性大鼠GLU水平顯著降低（P<0.05）；低劑量組雄性大鼠ALT水平顯著降低（P<0.05）。其余各組之間各指標差異均不顯著（P>0.05）（表7）。

2.2.7 臟器系數(shù) 給藥30 d后，與對照組雌性大鼠相比，高劑量組雌性大鼠胸腺指數(shù)顯著下降（P<0.05），其余各組之間各指數(shù)差異均不顯著（P>0.05）（表8）。

停藥7 d后，與對照組雌性大鼠相比，雌性大鼠各組各臟器系數(shù)均無顯著差異（P>0.05）。與對照組雄性大鼠相比，高劑量組雄性大鼠心臟指數(shù)顯著降低（P<0.05），低劑量組雄性大鼠腎臟指數(shù)顯著升高（P<0.05），中劑量組雄性大鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.05），其余各組各臟器指數(shù)均無顯著差異 （P>0.05）（表9）。

2.2.8 組織病理學檢查 對各組大鼠進行大體剖檢發(fā)現(xiàn)，辣蓼黃酮提取物高、中、低劑量組和對照組大鼠主要臟器均未見明顯病變。對大鼠進行組織病理學檢查，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各藥物組與對照組大鼠均未見心肌細胞出現(xiàn)變性，細胞之間無炎性細胞浸潤，細胞核、質(zhì)清晰；肝細胞核大且圓，核膜清楚；脾臟髓、質(zhì)清晰，未見結締組織增生；肺泡上皮細胞的細胞核、質(zhì)清晰，肺泡腔清晰飽滿；腎小球未見明顯增大、萎縮或變性等；腸絨毛完整，排列整齊，絨毛外覆一層單層柱狀細胞，杯狀細胞呈空泡狀，腸腺結構完整清晰；卵泡細胞間出現(xiàn)大小不同的腔隙，皮質(zhì)層內(nèi)可觀察到處于不同發(fā)育階段的卵泡，以原始卵泡居多；曲細精管結構清晰，睪丸間質(zhì)未見出血壞死等，睪丸間質(zhì)細胞、肌樣細胞、精原細胞、支持細胞、各級精母細胞及精子結構清晰完整（圖1、2）。

A～I，高劑量組心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、十二指腸、卵巢、睪丸；A′～I′，對照組心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、十二指腸、卵巢、睪丸。下同A-I,Heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovary and testis of high dose group；A′-I′,Heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovary and testis of control group.The same as below圖1 給藥30 d后大鼠各臟器組織病理學觀察（HE,400×）Fig.1 Histopathological observation on the organs of rats 30 days after the administration （HE,400×）

圖2 停藥 7 d后大鼠各臟器組織病理學觀察（HE,400×）Fig.2 Histopathological observation on the organs of rats after 7 days of drug withdrawal （HE,400×）

綜上所述，各藥物組與對照組大鼠的主要器官病理切片未見特征性病變。

3 討 論

辣蓼是中國傳統(tǒng)中藥之一，《本草綱目》、《別錄》、《唐本草》、《嶺南采藥錄》等多部中國古代醫(yī)書中均有對辣蓼的功效應用的記載。辣蓼在中國常用于防治痢疾、腹瀉、胃腸炎、子宮出血、跌打腫痛、風濕關節(jié)痛及寄生蟲疾病等，外用治療毒蛇咬傷、皮膚濕疹時，具有良好療效[12]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學中，辣蓼與青蒿、蒼耳、赤小豆、苦杏仁等中藥混合，加以面粉、麩皮混合發(fā)酵制成六神曲，具有健脾利胃、消食化中等功效[13-14]。辣蓼配合牛耳楓使用，是海南黎藥的代表之一，水提濃縮制成的復方牛耳楓片對急性腸胃炎和消化不良患者的療效顯著[15]。周世明等[16]發(fā)現(xiàn)，采用新鮮辣蓼莖葉粉碎后加5倍質(zhì)量的水放置12 h后濾過的原液3倍稀釋后，可用于農(nóng)作物種植中防治蚜蟲、茶毛蟲、稻飛虱地老虎等多種昆蟲。肖祝華等[17]研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼對大腸埃希菌性腹瀉有良好的治療作用，其作用機制可能與減少腸組織炎癥因子釋放、改善腸道黏膜屏障、干預 TGF-β/Smads 信號轉(zhuǎn)導有關。Devesh等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮可造成Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4,TLR4）下調(diào)及AP-1和p-JNK蛋白水平的下降，且TLR4途徑的阻斷及Sirtuin1/Nrf2途徑的增加，誘導抗氧化劑防御，減少了炎癥和氧化應激。但鮮見有關其毒理學的研究，故為揭示辣蓼黃酮提取物在中毒過程中所出現(xiàn)的毒性反應，本研究對辣蓼黃酮提取物進行了安全性研究。

急性毒性試驗是評價藥物安全性的重要指標，其結果可為后續(xù)的亞急性、慢性毒性試驗提供理論基礎[19]。急性毒性試驗預試驗中，辣蓼黃酮提取物的給藥劑量達到20 g/kg BW時，未出現(xiàn)小鼠中毒癥狀或死亡；最大給藥量試驗中，藥物劑量達到30 g/kg BW，未出現(xiàn)小鼠中毒或死亡的情況。大鼠30 d喂養(yǎng)試驗結果中，各劑量組大鼠在給藥期間和停藥期間被毛順滑有光澤，可視黏膜顏色正常，發(fā)育良好。這與李洋等[20]研究發(fā)現(xiàn)主要有效成分為黃酮的叉分蓼在劑量范圍內(nèi)屬于安全無毒的結果一致，也與賴偉勇[21]對辣蓼等的急性毒性研究結果一致。同期同性別大鼠各組之間飲水量略有差異，但差異并不明顯，雌性大鼠的增重趨勢低于雄性大鼠，這與大鼠的生長趨勢相符合[22]。

血常規(guī)和血液生化指標中，停藥7 d后，各項血常規(guī)指標與對照組相比差異不顯著；ALT、AST是反應肝臟實質(zhì)損害的指標，BUN和CREA是反映腎功能的指標[19]。本試驗中連續(xù)給藥30 d后，中劑量組雌性大鼠BUN和CREA、各給藥組雄性大鼠BUN、高劑量組雄性大鼠CREA與對照組相比顯著降低，說明該藥物對大鼠腎臟有一定的影響，但其變化在正常范圍內(nèi)。

臟器系數(shù)可在一定程度上體現(xiàn)藥物對機體的毒性，且能直觀的觀察到臟器的變化，可作為判斷藥物在體內(nèi)毒性累積的指標之一[23]。在停藥7 d后，低劑量雄性大鼠腎臟指數(shù)明顯高于其他組,表明辣蓼黃酮提取物給藥后會對大鼠腎臟有輕度損傷。各藥物組雌性、雄性大鼠胸腺指數(shù)較對照組均有下降，胸腺是大鼠的免疫器官，其具有先發(fā)育后退化的特征[24]。根據(jù)本研究結果分析，辣蓼黃酮提取物長期應用會對大鼠胸腺造成輕微的影響。

病理組織學診斷是目前臨床醫(yī)學領域常用的一種診斷方式[25]，對辣蓼黃酮提取物各劑量組與對照組的大鼠進行病理組織學切片觀察后發(fā)現(xiàn)，各組的主要臟器結構形態(tài)正常，未見炎性浸潤、增生、變性等異常情況，未出現(xiàn)特征性病理變化。綜上所述，辣蓼黃酮提取物在5 g/kg BW以下連續(xù)應用30 d不會對大鼠造成毒性損害，為辣蓼黃酮的臨床應用提供了科學論證，有助于促進辣蓼黃酮提取物的推廣。

4 結 論

急性毒性試驗測得辣蓼黃酮提取物口服給藥的最大給藥量為30 g/kg BW；亞慢性毒性試驗結果表明，辣蓼黃酮提取物以5 g/kg BW或以下對大鼠口服給藥后30 d，大鼠血液學指標和生化指標未見明顯變化，表明辣蓼黃酮提取物在5 g/kg BW及以下劑量對大鼠無毒副作用，安全性好。