趙天睿，邵錦華,王朝好，嚴 蕊，雷鎰妃，劉曉雅，胡長敏

（1.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.廣州海關隸屬廣州會展中心海關，廣州 510335）

犬貓皮膚病是臨床上常見疾病之一，具有發(fā)病率高且易復發(fā)的特點。犬貓皮膚病會導致一系列癥狀，如原發(fā)性感染引發(fā)的表皮紅腫、瘙癢、皰疹和繼發(fā)性感染引發(fā)的膿腫。同時，皮膚病易導致動物抓撓等異常行為[1]，導致動物福利受損。細菌性皮膚病是由細菌性病原感染引起的皮膚病理變化，為皮膚病中最重要的一種。常見的細菌性皮膚病病原有金黃色葡萄球菌、貓葡萄球菌、中間型葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、鏈球菌、奇異變形桿菌、化膿性棒狀桿菌及假單胞菌等[2]。據報道，人畜共患病原中，有30～40種病原來自犬貓[3]。由于許多犬貓皮膚病病原具有人畜共患的特性，易造成病原在動物與人之間的傳播并引發(fā)公共衛(wèi)生問題。

犬貓細菌性皮膚病的臨床診斷可通過病史、癥狀進行初步判定，隨后開展皮膚抹片鏡檢、細菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗等實驗室檢查[4-5]。目前,臨床上常見的皮膚病治療用藥一般為抗生素，而抗生素的濫用也導致了耐藥性等一系列問題[6]。因此，許多研究者開始關注植物類產物[7]，并從中篩選到多種具有活性的化學物質。這些天然活性產物具有低毒、安全、環(huán)境友好的特點，其中多種天然活性產物兼具抑菌作用，既可作為傳統(tǒng)抗菌藥物的替代物[8]，也可與抗生素聯用以降低耐藥菌的抗藥性，如白花丹中提取的白花丹素可抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcusaureus,MRSA）的增殖[9]，血根堿可抑制大腸桿菌[10]，芫荽中的芳樟醇可與苯唑西林、慶大霉素等聯用抑制MRSA及銅綠芽孢桿菌的活性[11]。除此以外，部分天然活性產物還具有免疫調節(jié)機能[12]，顯著促進患有細菌性皮膚病犬貓的康復。

研究顯示，藤黃酸（gambogic acid,GA）具有抑制腫瘤細胞增殖[13]及神經保護[14]等作用，6-溴靛玉紅-3’-肟（6-bromoindirubin-3’-oxime,BIO）有抑癌[15]、延緩心肌細胞衰老[16]等功效。本實驗室前期研究證實了BIO及GA有較好的抑制炎癥的功效[17-18]。本研究擬對武漢市患皮膚病的犬貓開展細菌性病原分離鑒定，并探索其對傳統(tǒng)抗菌藥物與天然活性產物GA及BIO的敏感性，以期為臨床上犬貓皮膚病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及菌株 病例來自武漢市部分犬舍、貓舍及某動物醫(yī)院的患皮膚病犬貓。5周齡體重20 g左右的雌性SPF級昆明小鼠購自華中農業(yè)大學實驗動物中心。質控菌株金黃色葡萄球菌 ATCC 25923與ATCC 29213及大腸桿菌 ATCC 25922均購自溫州市康泰生物科技有限公司康泰菌株保藏中心。

1.1.2 主要試劑 GA標準品、BIO標準品及頭孢西丁標準品均購自上海源葉生物科技有限公司；培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自南京建成科技有限公司；TaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 Plus DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自Thermo Fisher Scientific公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 藥物配制與保存 將GA及BIO標準品溶于DMSO分別配制成1 000和2 000 mg/L溶液并于4 ℃避光保存，試驗前將其分別稀釋25倍，以保證DMSO終濃度<1%。頭孢西丁標準品用水配制成1 000 mg/L的溶液。藥物濃度見表1。

表1 藥物濃度Table 1 Drug concentration mg/L

1.2 方法

1.2.1 采樣 無菌生理鹽水清潔病變處，用一次性無菌棉拭子進行采樣并將棉拭子頭保存于2 mL EP管中。

1.2.2 樣品處理 將棉拭子于TSA平板一區(qū)進行劃線，再用接種環(huán)進行余下三區(qū)劃線。37 ℃倒置培養(yǎng)12～24 h，觀察分辨平板上的絕對優(yōu)勢菌落并挑取單菌落，接種于 TSB 培養(yǎng)基。

1.2.3 菌種保藏 取800 μL甘油及等體積菌液存于2 mL EP管中，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 生長特性觀察 將菌種按1%濃度接種于TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～20 h；復蘇后挑取一環(huán)菌液，于TSA 平板上四區(qū)劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)16～20 h后，觀察菌落形態(tài)。

1.2.4.2 革蘭氏染色鏡檢及生化鑒定 制作細菌抹片，利用革蘭氏染色試劑盒進行染色并鏡檢。生化鑒定：將菌液接種至細菌生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.2.4.3 分子生物學鑒定 以煮沸法提取各菌株DNA，以提取的基因組 DNA 為模板，用細菌16S rRNA通用引物（27F/1492R）進行PCR，擴增目的片段，用葡萄球菌屬特異性引物（Staph 756F/Staph 750R）[19]、變形桿菌屬特異性引物（TUF F/TUF R）[20]、鏈球菌特異性引物（EF-TU F/EF-TU R）[21]分別擴增疑似菌株。16S rRNA PCR反應體系25 μL：上、下游引物各 1 μL，2×TaqMaster Mix 12 μL，DNA模板 2 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL。16S rRNA PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。葡萄球菌[22]、變形桿菌[23]、鏈球菌[24]的PCR反應條件按照文獻方法進行。PCR 產物經 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳驗證。擴增后出現與目的條帶大小相近的條帶，則判為PCR擴增陽性并送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，測序結果在 BLAST進行相似性比對，以確定分離菌株種屬。

1.2.5 皮膚感染模型復制 為驗證分離菌株的致病性，對其進行皮膚感染模型復制試驗。選取體重20 g以上的SPF 昆明小鼠20只，每組2只,共計10組，將1～9組設為試驗組,10組設為對照組。在其背部皮膚選取一處進行剃毛，并將皮膚用刮刀刮至皮下出血且皮膚無破損，用棉拭子蘸取菌液涂抹于試驗組小鼠受試部位，對照組涂布TSB培養(yǎng)基，連續(xù)3 d。每組小鼠分籠飼養(yǎng)于SPF動物房，3 d后觀察受試部位病變情況，并對病變位置重新進行取樣、分離及鑒定。

1.2.6 臨床分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥的耐藥性測定 根據美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）給出的參考，選擇能在該標準中查詢到具體抑菌圈數據的對應藥物，采用K-B紙片法進行分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性測定。選擇大腸桿菌ATCC 25922及金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為質控菌株。

1.2.7 天然活性產物的MIC試驗 通過肉湯稀釋法測定天然活性產物GA及BIO對各臨床菌株的最小抑菌濃度（MIC）值，并設置大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 29213為質控菌株，頭孢西丁為質控藥物。

2 結 果

2.1 病原菌分離鑒定結果

2.1.1 生長特性 采樣后對樣品進行分離純化，最終獲得9株細菌。將臨床分離的9株菌依次編號為F1、F2、C3、C4、F5、C6、C7、C8和F9,分別接種至TSA平板，經37 ℃培養(yǎng)16～20 h后，F2、C4、F5（圖1A）和F9（圖1B）形成表面光滑、濕潤、直徑為1～2 mm的黃白色圓形菌落；C6、C7、C8（圖1C）成表面光滑、濕潤、直徑1 mm左右的白色圓形菌落；C3出現表面粗糙、邊緣不平滑、直徑1 mm左右的白色圓形菌落（圖1D）；F1形成表面光滑、濕潤、直徑0.5～1 mm的灰白色圓形菌落（圖1E）。

A，F5;B，F9;C，C8;D，C3;E，F1圖1 犬貓皮膚病病原在TSA平板上的生長特性Fig.1 Growth characteristics of skin pathogenic bacteria from dogs and cats on TSA plates

2.1.2 革蘭氏染色結果 在鏡下，F2、F4、F5、C6、C7、C8、F9呈藍紫色，為革蘭氏陽性，球形或稍呈橢圓形，直徑1.0 μm左右，排列成葡萄狀（圖2A～2C）；C3呈紅色，為革蘭氏陰性，長約1.0～3.0 μm，兩端鈍圓（圖2D）；F1呈革蘭氏陽性，球形或卵圓形，直徑0.6～1.0 μm，大多為鏈狀排列（圖2E）。

A，F5;B，F9;C，C8;D，C3;E，F1圖2 革蘭氏染色結果（1 000×）Fig.2 Gram staining results （1 000×）

2.1.3 生化鑒定 由表2可知，F2、F9、C4、F5、C6、C7、C8對乳糖、甘露糖等均呈現陽性，C4和F5 V-P實驗、硝酸鹽還原實驗呈陽性，其他5株V-P實驗、硝酸鹽還原實驗為陰性。

表2 F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification results of F2,C4,F5,C6,C7,C8 and F9

另外，F1對PYR、精氨酸、MAG、TMZ、蕈糖、蔗糖表現為陽性，對V-P、GPP、七葉苷、山梨醇表現為陰性。C3對V-P、苯丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、枸櫞酸鹽、尿素、硫化氫、磷酸酶、β-半乳糖苷、棉籽糖、戊糖、山梨醇、二磷酸酶表現為陽性，對靛基質、側金盞花醇表現為陰性。

2.1.4 PCR檢測16S rRNA及屬特異性基因的結果 提取分離得到的9株細菌的DNA，用細菌通用引物（27F/1492R）擴增細菌的16S rRNA基因序列，由圖3可知，9株菌均擴增出了1 500 bp左右的條帶，陰性對照無條帶。

M,DL2000 Plus DNA Marker；N,ddH2O；1～9,依次為F1、F2、C3、C4、F5、C6、C7、C8和F9M,DL2000 Plus DNA Marker;N,ddH2O;1-9,F1,F2,C3,C4,F5,C6,C7,C8 and F9,respectively圖3 病原菌16S rRNA PCR產物電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of 16S rRNA PCR products of pathogenic bacteria

葡萄球菌屬特異性引物擴增后，F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9均出現756 bp條帶，說明該7株菌均為葡萄球菌（圖4A）；變形桿菌屬特異性引物擴增后，C3出現541 bp 條帶（圖4B）；鏈球菌屬特異性引物擴增后，F1出現 197 bp 條帶（圖4C）。對擴增結果進行測序及BLAST比對，確定F2、F9為貓葡萄球菌，C4、F5為金黃色葡萄球菌，C6、C7、C8為偽中間型葡萄球菌，C3為奇異變形桿菌，F1為犬鏈球菌。

①A,葡萄球菌；B,變形桿菌；C,鏈球菌。②M，DL2000 Plus DNA Marker；N，ddH2O；1～9，分別為F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9、C3和F1①A,Staphylococcus;B，Proteus;C，Streptococcus.②M,DL2000 Plus DNA Marker；N,ddH2O；1-9,F2,C4,F5,C6,C7,C8,F9,C3 and F1,respectively圖4 菌屬特異性引物擴增病原菌對應基因片段的PCR產物電泳結果Fig.4 Electrophoresis results of PCR products of corresponding gene fragment amplified by specific bacterial primers

2.2 臨床分離菌株皮膚感染模型復制結果

在連續(xù)對試驗組SPF小鼠受試部位涂抹菌液3 d、對照組SPF小鼠涂抹TSB培養(yǎng)基3 d后觀察，試驗組小鼠受試部位出現病變，對照組未見病變，說明各臨床菌株均具有致病性。涂抹偽中間型葡萄球菌小鼠，其受試部位出現3 mm×7 mm的病變，并形成較厚、表面粗糙的黑紅色血痂（圖5A）；涂抹犬鏈球菌菌液的小鼠于受試部位形成一處略凹陷、表面粗糙的暗紅色病變（圖5B）；涂抹貓葡萄球菌菌液的小鼠于受試部位出現6 mm×3 mm的病變，并形成紅褐色痂皮（圖5C）；涂抹金黃色葡萄球菌菌液的小鼠于受試部位出現明顯的起皮、掉屑，并在病灶中心形成淡黃色痂皮（圖5D）；涂抹奇異變形桿菌菌液的小鼠于受試部位出現一處較小的表面較厚的血痂（圖5E）；對照組小鼠在3 d后背部經刮刀刮出的滲血在逐漸消退，于皮下留下淡紅色痕跡（圖5F）。

A，偽中間型葡萄球菌;B，犬鏈球菌;C，貓葡萄球菌;D，金黃色葡萄球菌;E，奇異變形桿菌;F，對照組A，Staphylococcus pseudintermedius;B， Streptococcus canis;C，Staphylococcus felinae;D，Staphylococcus aureus;E，Proteus mirabilis;F，Control group圖5 小鼠受試部位病變情況Fig.5 Pathological changes in the tested parts of mice

2.3 分離菌株耐藥性結果

2.3.1 分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物的耐藥性 根據臨床菌株的類別，開展分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物的耐藥性測定，即葡萄球菌組、犬鏈球菌組及奇異變形桿菌組對抗生素的耐藥情況。由表3可知，貓葡萄球菌F2、偽中間型葡萄球菌C6對復方新諾明、青霉素、苯唑西林等10種抗菌藥均敏感，金黃色葡萄球菌C4對青霉素耐藥，金黃色葡萄球菌F5對復方新諾明、青霉素、氯霉素、紅霉素耐藥，偽中間型葡萄球菌C7對復方新諾明、青霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素耐藥，貓葡萄球菌F9、偽中間型葡萄球菌C8對復方新諾明、青霉素、苯唑西林、氯霉素、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星耐藥。由表4可知，犬鏈球菌F1對萬古霉素、利福平等8種抗菌藥均敏感。由表5可知，奇異變形桿菌C3對呋喃妥因、氨芐西林等6種抗菌藥均敏感。

表3 7株葡萄球菌對10種抗菌藥的耐藥情況Table 3 Resistance of 7 strains of Staphylococcus to 10 traditional antibiotics

表4 1株犬鏈球菌對8種抗菌藥的耐藥情況Table 4 Resistance of 1 strain of Streptococcus to 8 traditional antibiotics

表5 1株奇異變形桿菌對6種抗生素的耐藥情況Table 5 Resistance of 1 strain of Proteus to 6 traditional antibiotics

2.3.2 天然產物GA及BIO的MIC結果 天然活性產物GA和BIO對臨床分離菌株的MIC結果顯示，GA及BIO對各臨床分離菌株均具有較強的抑菌活性，其中GA對臨床分離株的MIC在0.625～2.5 mg/L,BIO的MIC在2.5～5 mg/L（表6）。且在本試驗中，除金黃色葡萄球菌F5外，GA的MIC值均小于BIO。

表6 2種天然活性產物對各菌株的MICTable 6 MIC of 2 natural active products to each strain mg/L

3 討 論

細菌性皮膚病是由細菌性病原感染引起的皮膚病理變化，是最常見的一種犬貓皮膚病。免疫缺陷、內分泌功能障礙、皮膚創(chuàng)傷、真菌感染、特應性皮炎等病因導致皮膚菌群生態(tài)平衡失調[25]、皮膚抑制細菌滋生能力下降，進而引發(fā)細菌性感染。細菌性皮膚病不僅導致患病動物皮膚局部病變，嚴重時可能誘發(fā)全身感染。抗生素是臨床上治療細菌性皮膚病的常見手段，但存在療效不確定、個體差異大、容易復發(fā)等問題[26]，且抗生素濫用導致的細菌耐藥性問題也愈發(fā)嚴峻，影響了其治療效果。從植物中提取的天然產物低毒且安全，其中有許多天然產物有一定的抑菌活性，具有作為替代抗生素成為犬貓皮膚病治療藥物的潛力，如植物提取物W16P57被證實對耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌有抑制作用[27]。本實驗室前期研究發(fā)現，GA可抑制促炎因子白介素-1β（IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α） mRNA表達量及TLR4-NF-κB/MAPKs信號通路來抑制乳腺炎[18]，靛玉紅也可下調上述炎性因子來達到抑炎效果[17]。

本研究首先對臨床病樣進行收集，并進行病原菌的分離與鑒定，共分離到9株細菌。在所分離病原中，葡萄球菌是犬貓最常見的皮膚病致病菌；犬鏈球菌是一種感染多種動物的致病菌，Pesavento等[28]報道證實了其單獨感染也可導致貓皮膚??；亦有研究表明奇異變形桿菌對皮膚有致病性[29-30]。本研究使用SPF小鼠對臨床分離株進行了皮膚病模型復制，為防止小鼠間撕咬、打斗、交配等行為影響試驗結果，本試驗中選擇的均為雌性小鼠。最終成功復制了皮膚病模型，不僅說明犬貓源菌株在小鼠進行皮膚感染模型復制的可行性[31]，并且驗證了臨床分離株對皮膚的致病性。

本研究分離得到菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性表現較大差異，其中1株犬鏈球菌及1株奇異變形桿菌在對傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性的試驗中表現為對受試藥物全敏感；葡萄球菌中2株對受試藥物全敏感（貓葡萄球菌F2、偽中間型葡萄球菌C6），1株對1種藥物耐藥（金黃色葡萄球菌C4），1株對4種藥物耐藥（金黃色葡萄球菌F5），1株對5種藥物耐藥（偽中間型葡萄球菌C7），2株對8種藥物耐藥（貓葡萄球菌F9、偽中間型葡萄球菌C8）。Be?a等[32]從動物、獸醫(yī)專業(yè)人員和臨床獸醫(yī)環(huán)境中分離到12株偽中間葡萄球菌，其中有4例為耐甲氧西林偽中間葡萄球菌。同時，對獸醫(yī)專業(yè)人員手部進行采樣，約有20%的樣本可分離得到耐甲氧西林偽中間葡萄球菌,該研究表明葡萄球菌的耐藥問題已較為突出。多重耐藥菌株更對臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)[33]。在本研究中，葡萄球菌對傳統(tǒng)抗菌藥的耐藥性也明顯高于鏈球菌和變形桿菌。張文皓[34]報道的耐藥性分析結果表明，葡萄球菌對氨基糖苷類（慶大霉素）及氟喹諾酮類（左氧氟沙星）敏感性較高，與本研究部分結果相符。

本研究進一步對天然活性產物GA及BIO的抑菌效果開展了評價，GA及BIO對犬貓皮膚病源菌株均有較好的抑菌效果。有研究表明GA對MRSA有抑菌效果[35]。王丹等[36]在關于GA的牛津杯試驗中，觀察到其濃度在20和2 mg/mL時均對金黃色葡萄球菌產生抑菌圈，對大腸桿菌均無抑菌圈。本研究中GA對于金黃色葡萄球菌的效果與王丹等[36]的試驗結果相符。本研究中也檢測到了GA對大腸桿菌ATCC 25922的抑菌作用，且GA對于該大腸桿菌菌株的MIC值大于所有受試葡萄球菌菌株，其差異原因可能為藥敏試驗方法的區(qū)別；其次，在本研究中應用的大腸桿菌為非臨床菌株。

Czelen等[37]研究發(fā)現,靛玉紅可通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶和 DNA 聚合酶來影響細菌生長。林健等[38]驗證了靛玉紅對MRSA的抑菌活性。在本研究中，選取了靛玉紅的衍生物BIO進行試驗，發(fā)現其對受試菌株均有抑菌活性;同時除金黃色葡萄球菌F5外，GA的MIC值均小于BIO，說明GA對于本次分離得到的菌株抑菌效果更強。

4 結 論

本研究從武漢市部分皮膚病患病犬貓分離得到共計5種、9株臨床菌株，并通過小鼠皮膚感染模型驗證了其對皮膚的致病性。上述部分臨床分離株對傳統(tǒng)抗菌藥產生不同程度的耐藥性，而GA和BIO對犬貓皮膚病源分離菌株均有明顯抑菌活性，顯示其可作為潛在高效防控犬貓細菌性皮膚病的藥物，為臨床上犬貓細菌性皮膚病的治療提供新思路。