鮑遠(yuǎn)放，張綠萍，鄭 偉，王 彬

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所，貴陽(yáng) 550006）

0 引言

火龍果(Hylocereus undulates)又名吉祥果、紅龍果等，仙人掌科量天尺屬植物，為典型的熱帶亞熱帶水果[1]。因果實(shí)中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)深受人們的喜愛(ài)[2-3]。隨著火龍果種植面積的不斷增加，采后病害呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢(shì)，其中以桃吉爾霉為致病菌的果腐病尤為突出，具有發(fā)病速度快、侵染能力強(qiáng)的特點(diǎn)，從而嚴(yán)重影響火龍果果實(shí)采后品質(zhì)。紅肉火龍果采后極易腐爛，鮮果供應(yīng)期短，夏季一般采后3天鱗片黃化萎蔫，7天便開(kāi)始腐爛，火龍果采后貯藏保鮮技術(shù)成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大難題[4]。目前，化學(xué)農(nóng)藥仍是控制火龍果采后病害的主要方法，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑不但使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且會(huì)對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生一定影響。傳統(tǒng)的殺菌劑使用具有一定的污染性，與綠色環(huán)保理念相悖，植物抗病誘導(dǎo)劑具有高效、無(wú)毒、無(wú)污染的特性，而B(niǎo)TH（benzothiadiazole，苯并噻二唑）是一種典型的植物抗病誘導(dǎo)劑，離體條件下無(wú)殺菌活性，但能夠誘導(dǎo)植物的免疫活性，起到抗病、防病的作用，是火龍果的采后保鮮研究新方向[5-6]。前人對(duì)BTH 的研究涉及厚皮甜瓜[7]、蘋(píng)果[8]、荔枝[9]、桃[10]、香蕉[11]、梨[12]等，但在火龍果上的應(yīng)用暫未見(jiàn)報(bào)道。本研究以火龍果‘軟枝大紅’為試驗(yàn)材料，研究采后BTH處理對(duì)火龍果果實(shí)抗病性及貯藏品質(zhì)的影響，以期提高火龍果采后貯藏品質(zhì)，增強(qiáng)貯藏期抗病性，延長(zhǎng)貯藏期，為BTH在火龍果采后貯藏期的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料‘軟枝大紅’于2020年10月28日采于貴州省羅甸縣羅悃鎮(zhèn)，采后立即運(yùn)到貴州省果樹(shù)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室，選取大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病斑、色澤、成熟度基本一致的果實(shí)備用。

BTH購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，Tween-80購(gòu)于A(yíng)laddin公司，分析純。桃吉爾霉(Gilbertella persicaria)由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所提供。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒、過(guò)氧化物酶(POD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、多酚氧化酶(PPO)試劑盒、苯丙氨酸解氨酶(PAL)試劑盒、幾丁質(zhì)酶(CHI)試劑盒、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)試劑盒均購(gòu)于上海橋杜生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理和接種 BTH設(shè)5個(gè)質(zhì)量濃度，為0、50、100、150、200 mg/L（均含 0.05% Tween-80），其中以含0.05% Tween-80的清水為對(duì)照，火龍果于不同濃度的BTH溶液浸泡3 min，每個(gè)處理挑選150個(gè)果實(shí)，果面完全浸沒(méi)，瀝干后隨機(jī)分成3組，分別用于接種、腐爛情況觀(guān)察和取樣。貯藏和取樣的果實(shí)置于室溫下貯藏。

經(jīng)處理的火龍果果實(shí)進(jìn)行表面消毒后，采用刺傷法接種，接種濃度為1×106CFU/mL桃吉爾霉孢子懸浮液10 μL，覆蓋浸潤(rùn)的滅菌棉24 h，將火龍果置于室溫下觀(guān)察病斑情況。

1.2.2 病情指數(shù)和貯藏期腐爛率觀(guān)察 每天觀(guān)察其發(fā)病情況，自發(fā)病起，每2天采用十字交叉法記錄病斑直徑。每個(gè)處理接種15個(gè)火龍果，重復(fù)3次。

式中，d表示病斑直徑。

自發(fā)病起，每2天記錄病情指數(shù)。每個(gè)處理接種15個(gè)火龍果，重復(fù)3次。參照曾凱芳等[13]和弓德強(qiáng)等[14]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。0級(jí)，未發(fā)病；1級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積≤5%；2級(jí)，5%＜病斑面積占果實(shí)面積≤15%；3級(jí)，15%＜病斑面積占果實(shí)面積≤30%；4級(jí)，30%＜病斑面積占果實(shí)面積≤50%；5級(jí)，病斑面積占果實(shí)面積＞50%。病情指數(shù)(disease index，DI)的計(jì)算如式(2)。

式中，X為病情級(jí)數(shù)(0～5)，Nx為相應(yīng)級(jí)別病果的個(gè)數(shù)。

以果實(shí)表面出現(xiàn)直徑＞0.5 cm的病斑或多個(gè)病斑為腐爛的標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)腐爛果后，每2天觀(guān)察記錄1次，并及時(shí)清理腐爛的果實(shí)。

1.2.3 品質(zhì)測(cè)定及生化指標(biāo)測(cè)定 從采收當(dāng)天起，每3天取樣測(cè)定1次。每次隨機(jī)選取9個(gè)果實(shí)，以3個(gè)果實(shí)為1組重復(fù)，重復(fù)3次，分離果皮和果肉，切片后立即用液氮速凍處理，最后置于-80℃冰箱中保存用于品質(zhì)及生化指標(biāo)的測(cè)定。根據(jù)病斑直徑、病情指數(shù)和貯藏期腐爛率的變化規(guī)律篩選出效果最佳的BTH處理濃度，隨后測(cè)定對(duì)照和最佳的BTH濃度處理組的品質(zhì)及生化指標(biāo)來(lái)進(jìn)一步檢驗(yàn)該濃度對(duì)火龍果采后抗病性及貯藏品質(zhì)的影響。

總糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定。可滴定酸含量采用酸堿滴定法測(cè)定，以蘋(píng)果酸計(jì)。SOD、CAT、POD、MDA、PPO、PAL、CHI、GLU采用酶聯(lián)免疫法試劑盒，具體方法如下：稱(chēng)取0.1g的果皮冷凍粉末，加入0.9mLPBS（pH 7.4，濃度為0.05 mol/L）勻漿液勻漿，4℃ 3000 r/min離心15 min后取上清液，按試劑盒方法加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，加入100 μL酶標(biāo)試劑，37℃恒溫孵育60 min，隨后洗板5次，加入50 μL底物A、50 μL底物B，在37℃恒溫箱中避光孵育15 min，加入終止液50 μL，于15 min內(nèi)在450 nm處測(cè)出OD值。在37℃下，以每克鮮樣每分鐘在反應(yīng)體系中使OD450變化0.01為1個(gè)酶活單位(U)，以上指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel軟件以及SPSS 19.0軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后BTH處理對(duì)火龍果病斑面積變化的影響

由圖1A可知，BTH浸泡處理可以提高采后火龍果果實(shí)抗桃吉爾霉能力，降低火龍果的病斑面積，接種后1天時(shí)50、100、150 mg/L BTH處理組的病斑面積分別比對(duì)照低30.59%、47.62%、26.93%，200 mg/L BTH處理與對(duì)照無(wú)顯著性差異；接種后3天時(shí)均呈顯著性差異，處理組的病斑面積分別比對(duì)照低41.25%、60.57%、40.35%、36.23%；接種后5天時(shí)處理組與對(duì)照均呈顯著性差異，此時(shí)處理組的病斑面積分別比對(duì)照低28.61%、60.57%、40.35%、36.23%；接種后7天時(shí)處理組的病斑面積分別比對(duì)照低22.63%、42.35%、21.45%、12.72%。除接種后1天時(shí)100 mg/L與50 mg/L BTH處理組無(wú)顯著性差異，其余時(shí)期100 mg/L BTH處理與各處理組間均呈顯著性差異。在接種期內(nèi)綜合來(lái)看，100 mg/L BTH處理對(duì)火龍果病斑面積擴(kuò)大的抑制效果最好。

由圖1B可知，采后BTH浸泡處理可以顯著降低火龍果接種桃吉爾霉后的病情指數(shù)，50、100、150、200 mg/L BTH處理組在接種后3天時(shí)的病情指數(shù)分別比對(duì)照低21.15%、36.54%、19.23%、13.46%，5天時(shí)的病情指數(shù)分別比對(duì)照低20.80%、30.40%、19.20%、16.80%，7天時(shí)的病情指數(shù)分別比對(duì)照低22.00%、25.33%、12.00%、8.67%，9天時(shí)的病情指數(shù)分別比對(duì)照低19.39%、23.47%、18.88%、9.18%。100 mg/L BTH處理組僅在接種后7天和9天時(shí)與50 mg/L BTH處理組無(wú)顯著性差異，其余時(shí)期與各處理組間均呈顯著性差異。在接種期內(nèi)綜合來(lái)看，100 mg/LBTH處理對(duì)火龍果病情指數(shù)增加的抑制效果最好。

圖1 采后BTH處理對(duì)火龍果果實(shí)接種桃吉爾霉后病斑面積和病情指數(shù)變化的影響

2.2 采后BTH處理對(duì)火龍果貯藏期間腐爛率變化的影響

由圖2可知，采后適宜濃度的BTH浸泡處理能延后火龍果貯藏期間開(kāi)始腐爛的時(shí)間、降低腐爛率以及延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。處理組比對(duì)照延后2天開(kāi)始出現(xiàn)腐爛，于15天開(kāi)始出現(xiàn)腐爛，貯藏期間其腐爛率均低于對(duì)照。200 mg/L BTH處理組比對(duì)照延后2天全部腐爛，50、100、150 mg/L BTH處理組均比對(duì)照延后4天全部腐爛。綜合整個(gè)貯藏期的腐爛率變化情況，可以得出100 mg/LBTH處理效果最好。

圖2 采后BTH處理對(duì)火龍果貯藏期間腐爛率變化的影響

2.3 采后BTH處理對(duì)貯藏期間火龍果果肉總糖含量及可滴定酸的影響

由圖3A可知，對(duì)照和100 mg/L BTH處理火龍果果肉總糖含量在貯藏期間均呈先上升再下降的趨勢(shì)。除貯藏9天和12天時(shí)，在整個(gè)貯藏過(guò)程中BTH處理組的果實(shí)總糖含量均顯著高于對(duì)照。3天時(shí)，對(duì)照和處理組總糖含量均達(dá)到峰值，處理組總糖含量比對(duì)照高7.30%。至貯藏18天時(shí)，對(duì)照總糖含量下降了29.77%，處理組總糖含量下降了22.49%(P＜0.05)。

圖3 采后BTH處理對(duì)火龍果貯藏期間總糖含量和可滴定酸含量變化的影響

由圖3B可知，對(duì)照和100 mg/L BTH處理火龍果果肉可滴定酸含量在貯藏期間均呈下降趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏過(guò)程中BTH處理組的果實(shí)可滴定酸含量均顯著低于對(duì)照組。至貯藏18天時(shí)，對(duì)照可滴定酸含量下降了40.62%，處理組可滴定酸含量下降了50.24%(P＜0.05)。

上述結(jié)果表明，采后100 mg/L BTH處理可以提高貯藏期火龍果的總糖含量和降低可滴定酸含量。

2.4 采后BTH處理對(duì)貯藏期間火龍果果皮抗氧化酶活性的影響

火龍果貯藏期間果皮SOD活力的變化如圖4A所示，對(duì)照和處理組均呈先上升后下降的趨勢(shì)。BTH處理組火龍果果皮的SOD活力始終高于對(duì)照，對(duì)照在3天時(shí)SOD活力達(dá)到最大值，處理組在6天時(shí)SOD活力達(dá)到最大值，為136.80 U/mL，比同期對(duì)照高13.15%(P＜0.05)。

火龍果貯藏期間果皮CAT活力的變化如圖4B所示，BTH處理組的CAT活力始終高于對(duì)照，在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照CAT活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，在6天時(shí)CAT活力達(dá)到峰值；處理組在3天時(shí)CAT活力達(dá)到峰值，9天時(shí)CAT活力達(dá)到最低值。貯藏18天時(shí)，對(duì)照組和處理組CAT活力差異最大，此時(shí)處理組CAT活力比對(duì)照高24.89%(P＜0.05)。

火龍果貯藏期間果皮POD活力的變化如圖4C所示，BTH處理組的POD活力顯著高于對(duì)照，在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照和處理組POD活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在貯藏3天時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)處理組POD活力比對(duì)照高19.45%(P＜0.05)。

圖4 采后BTH處理對(duì)貯藏期間火龍果果皮抗氧化酶活性的影響

火龍果貯藏期間果皮MDA含量的變化如圖4D所示，BTH處理組的MDA含量始終低于對(duì)照，在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照和處理組MDA含量均呈上升趨勢(shì)。貯藏0～6天，對(duì)照MDA含量呈急速上升趨勢(shì)。處理組在貯藏6～9天時(shí)才開(kāi)始第一個(gè)急速上升趨勢(shì)。貯藏6天時(shí)，處理組和對(duì)照MDA含量差異最大，其MDA含量比對(duì)照低17.49%(P＜0.05)。

上述結(jié)果表明，采后100 mg/L BTH處理可以提高貯藏期火龍果果皮SOD、CAT、POD活力，降低其MDA含量，增強(qiáng)了其抗氧化能力。

2.5 采后BTH處理對(duì)貯藏期間火龍果果皮抗病相關(guān)酶活性的影響

火龍果貯藏期間果皮PPO活力的變化如圖5A所示，對(duì)照組PPO活力在貯藏期間呈先上升再下降的趨勢(shì)，處理組PPO活力在貯藏期間呈先下降再上升的趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏期間，除18天時(shí)，BTH處理組PPO活力均顯著低于對(duì)照，對(duì)照在貯藏3天時(shí)達(dá)到峰值，處理組在貯藏9天時(shí)達(dá)到最低值。貯藏9天時(shí)，處理組和對(duì)照PPO活力差異最大，其PPO活力比對(duì)照低33.72%(P＜0.05)。

圖5 采后BTH處理對(duì)貯藏期間火龍果果皮抗病相關(guān)酶活性的影響

火龍果貯藏期間果皮PAL活力的變化如圖5B所示。在整個(gè)貯藏期間，BTH處理組PAL活力均顯著高于對(duì)照，對(duì)照在貯藏3天時(shí)達(dá)到峰值，處理組在貯藏6天時(shí)達(dá)到第一個(gè)峰值。貯藏12天時(shí)，處理組和對(duì)照的PAL活力均達(dá)到最低值，此時(shí)處理組的PAL活力比對(duì)照高23.63%(P＜0.05)。

火龍果貯藏期間果皮CHI活力的變化如圖5C所示，BTH處理組CHI活力在貯藏期間總體呈上升趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏期間，除6天時(shí)，處理組CHI活力均顯著高于對(duì)照。貯藏18天時(shí)，處理組和對(duì)照CHI活力差異最大，其CHI活力比對(duì)照高96.98%(P＜0.05)。

火龍果貯藏期間果皮GLU活力的變化如圖5D所示，在整個(gè)貯藏期間,處理組的GLU活力均顯著高于對(duì)照，BTH處理組GLU活力總體呈上升趨勢(shì)，在6天時(shí)GLU活力達(dá)到第一個(gè)峰值，此時(shí)其GLU活力比對(duì)照高28.19%。對(duì)照GLU活力在6天時(shí)達(dá)到峰值，在9天時(shí)達(dá)到最低值，此時(shí)處理組GLU活力比對(duì)照高60.23%(P＜0.05)。

上述結(jié)果表明，采后100 mg/L BTH處理可以提高貯藏期火龍果果皮PAL、CHI、GLU活力，增強(qiáng)其抗病能力，降低其PPO活力，抑制果皮褐變。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/L BTH處理顯著降低了刺傷接種Gilbertella persicaria后火龍果果實(shí)的病斑面積、病情指數(shù)和貯藏期間的果實(shí)腐爛率，誘導(dǎo)了果皮中CAT、SOD、POD、CHI、GLU、PAL等防御酶活性的增強(qiáng)，有效降低了MDA含量，顯著鈍化了PPO的活力，從而延緩火龍果果實(shí)采后衰老進(jìn)程，提高了果實(shí)采后抗病性和貯藏品質(zhì)。由此可見(jiàn)，采后適當(dāng)濃度的BTH處理不僅能增強(qiáng)火龍果果實(shí)的抗病性，還能提高果實(shí)貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期。

4 討論

BTH作為植物抗病誘導(dǎo)劑，可通過(guò)誘導(dǎo)果實(shí)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性及代謝產(chǎn)物來(lái)增強(qiáng)果實(shí)的抗性[15]。Zhou等[10]研究表明BTH處理桃果實(shí)能有效激活抗氧化酶活性，減少活性氧對(duì)植物細(xì)胞的損傷，并提高抗病相關(guān)酶活性，從而達(dá)到對(duì)褐霉病病菌的抑制作用。BTH處理對(duì)厚皮甜瓜黑斑病的抗性[7]、荔枝霜霉病的抗性[9]、香蕉炭疽病的抗性[11]等均有顯著性的增強(qiáng)作用。本試驗(yàn)的研究結(jié)果也表明，BTH處理對(duì)火龍果采后由桃吉爾霉引發(fā)的果腐病具有顯著抗性，也進(jìn)一步驗(yàn)證了BTH的廣譜抗病性。

總糖和可滴定酸的含量是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其含量的高低會(huì)直接影響果蔬的適口性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BTH處理可以顯著降低火龍果貯藏期間的可滴定酸含量，這與葛永紅等[12]對(duì)梨果實(shí)的研究結(jié)果一致。采后貯藏過(guò)程中，總糖含量先上升再下降，由于采時(shí)成熟度不夠，于3天時(shí)達(dá)到峰值；隨著貯藏時(shí)間的推移，呼吸不斷消耗，糖含量逐漸降低，這與任亞琳等[16]對(duì)厚皮甜瓜的研究結(jié)果一致。

MDA含量反映細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，是衡量果實(shí)耐貯性的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BTH誘抗處理可減少火龍果采后貯藏期間MDA的積累，抑制細(xì)胞膜的降解；由于水因子在采后貯藏期間會(huì)降低細(xì)胞膜完整率，從而促進(jìn)了貯藏后期MDA的積累，這與胡妍蕓等[7]對(duì)厚皮甜瓜的研究結(jié)果一致。

李欣等[17]的研究結(jié)果表明，BTH能夠有效降低貯藏過(guò)程中果實(shí)的病害，主要與增強(qiáng)果實(shí)活性氧代謝、苯丙烷代謝相關(guān)酶活性有關(guān)。CAT、SOD、POD等抗氧化酶的活力，是果實(shí)貯藏過(guò)程中清除自由基，延緩衰老進(jìn)程的重要指標(biāo)，同時(shí)，POD可催化酚類(lèi)物質(zhì)的前體聚合為木質(zhì)素，起到加固植物細(xì)胞壁、抵抗病原物入侵的作用，同時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，避免其在植物體內(nèi)產(chǎn)生和積累[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BTH處理可以顯著提高CAT、SOD、POD的活力，增強(qiáng)抵抗病原菌入侵的能力。經(jīng) BTH 處理，梨[10]、厚皮甜瓜[13]、香蕉[20]、芒果[21]等果實(shí)中CAT、SOD、POD活力顯著增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致。

PAL是苯丙烷類(lèi)代謝中的關(guān)鍵酶和限速酶，由該途徑合成的中間產(chǎn)物如酚類(lèi)物質(zhì)以及木質(zhì)素和類(lèi)黃酮類(lèi)植保素等都是植物體內(nèi)重要的抗菌物質(zhì)[18,22]。幾丁質(zhì)酶(CHI)和β-1,3-葡聚糖酶(GLU)酶活性與植物抗病性有密切關(guān)系[23]。CHI和GLU是胞外水解酶，可以直接攻擊病原菌，誘導(dǎo)植物的抗病性[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BTH處理可以顯著增強(qiáng)PAL、CHI、GLU的活力，提升抗病能力，這與前人在蘋(píng)果[8]、香蕉[20]等研究結(jié)果一致。PPO可以將酚類(lèi)物質(zhì)氧化為高毒性的醌類(lèi)物質(zhì)，從而毒殺入侵病原菌，還參與木質(zhì)素的合成，使細(xì)胞壁變厚，形成木質(zhì)素保護(hù)植物免受感染[25]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)BTH處理在貯藏前期可鈍化PPO活力，抑制果皮褐變；在貯藏后期快速提升PPO活力，產(chǎn)生高毒性的醌類(lèi)物質(zhì)毒殺病菌，這與前人對(duì)荔枝[26]、甘薯[27]的研究結(jié)果一致。

本研究以‘軟枝大紅’為試驗(yàn)材料，分析了不同濃度BTH處理對(duì)火龍果采后貯藏期間果實(shí)品質(zhì)及抗病、抗氧化酶活性的影響，填補(bǔ)了BTH在火龍果采后保鮮領(lǐng)域研究的空白。但在試驗(yàn)過(guò)程中，缺乏對(duì)更多果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)和生理指標(biāo)的測(cè)定，如失重率、電導(dǎo)率、總酚、黃酮類(lèi)物質(zhì)測(cè)定等，將更加全面地了解BTH處理對(duì)火龍果品質(zhì)及生理指標(biāo)的影響。此外，還可增加機(jī)理分析，從而明晰BTH在火龍果上的作用機(jī)理和抗菌機(jī)制。