陸錚錚

（遵義師范學院，貴州遵義563002）

貴州是煙草種植的主產(chǎn)區(qū)，烤煙是遵義地區(qū)農(nóng)村的重要經(jīng)濟作物，是農(nóng)民脫貧致富、鄉(xiāng)村振興的重要渠道。煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanaceanm）侵染引起的細菌性土傳病害，是煙草生產(chǎn)種植中的一大毀滅性病害［1］。該病害在貴州廣泛發(fā)生和流行，且防治較難，其對煙草種植面積較大的遵義地區(qū)影響頗大，減緩了遵義地區(qū)煙草葉的發(fā)展。

目前防治該病害仍以化學防治為主，市面上防治細菌性病害的藥劑琳瑯滿目。近年來，在尋求綠色、安全的防治方法中，利用微生物源制劑防治植物病害中取得了一定的成效［2］，且市面上微生物農(nóng)藥的選擇也逐漸增多。為能更好地在室內(nèi)篩選出對煙草青枯病菌具有抑制作用的藥劑，探索出操作簡單、方便、效果顯著的細菌性病害防治方法及藥劑，選取常用的3種化學農(nóng)藥（中生·四霉素、中生菌素和春雷·中生）和3 種微生物農(nóng)藥（木霉菌、枯草芽孢桿菌和哈茨木霉菌）殺菌劑，考察劃線+紙碟法、劃線+打孔法、噴霧+紙碟法、噴霧+打孔法4種室內(nèi)對峙試驗方法的測定效果，并選取最優(yōu)方法考察6種殺菌劑對煙草青枯病菌的室內(nèi)防治效果，以期為田間試驗測定以及示范推廣提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 采集遵義市務川縣茅天鎮(zhèn)紅星村煙草種植區(qū)中煙草青枯病植株，帶回實驗室采用平板劃線分離法分離、純化。采用柯赫氏法則獲得煙草青枯病病原菌之后，采用斜面保存方法進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試藥劑 化學藥劑：1 號為中生·四霉素（海利爾藥業(yè)集團股份有限公司），推薦劑量50 mL/667m2；3 號為春雷·中生（福建凱立生物制品有限公司），推薦劑量為160 g/667m2；5 號為3%中生菌素可濕性粉劑（江西正邦作物保護有限公司），推薦劑量為40 g/667m2。微生物藥劑：2 號為2 億孢子/g 木霉菌可濕性粉劑（上海萬力華生物科技有限公司），推薦劑量為200 g/667m2；4 號為1 000 億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（武漢科諾生物科技股份有限公司），推薦劑量為120 g/667m2；6號為3億cfu/g 哈茨木霉菌可濕性粉劑（美國拜沃股份有限公司），推薦劑量為120 g/667m2。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3～5 g、10 g 蛋白胨、5 g NaCl、20～25 g 瓊脂、1 000 mL 蒸餾水、pH 7.0～7.2［3］。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 將采回的病株用清水沖洗，取發(fā)病部位一小塊組織在顯微鏡下觀察有無噴菌現(xiàn)象，觀察到噴菌現(xiàn)象后，采用平板劃線分離法分離。采用柯赫氏法則，將分離出的細菌接種于組織培養(yǎng)中的煙苗中，待發(fā)病之后，觀察、分離、純化獲得病原菌（濃度為3×108cfu/mL）。

平板劃線分離法［3］：取一小塊病組織，經(jīng)表面消毒后用無菌水洗3次，置于滅菌載玻片上的無菌水中，用滅菌解剖刀切碎。靜置60 s后，用滅菌的接種環(huán)蘸取組織液在NA 平板上劃線培養(yǎng)。置于32℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d 后，挑取單個菌落進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 藥劑配制 對峙試驗采用直徑為75 mm 的培養(yǎng)皿，則培養(yǎng)皿的面積=3.14×（0.037 5 m）2=0.004 4 m2，即為青枯病菌可生長的面積。

試驗設(shè)置3個濃度，分別是依據(jù)各藥劑推薦的濃度作為中間濃度，擴大10 倍和縮小10倍。配制濃度為各藥劑推薦劑量100 倍的母液，量取10 mL 置于90 mL 的無菌水中，混合、溶解均勻，標記為最大濃度，然后從最大濃度中取1 mL 藥液置于9 mL 的無菌水中混合均勻，標記為中間

濃度，然后從中間濃度中取1 mL 的藥液放入9 mL 的無菌水中混合均勻，標記為最小濃度。3個濃度的藥液配置完畢，待用。

1.2.3 對峙培養(yǎng)測定

1）劃線+紙碟法（方法1）：將待測的青枯病菌均勻的在NA 培養(yǎng)基上進行劃線，然后將直徑為7 mm 的無菌中性濾紙碟浸泡在每一梯度濃度的藥劑液中15 s，然后用滅菌鑷子取出濾紙碟，將剩余的藥液瀝干，然后將吸附了藥液的3 張濾紙碟重疊放入已經(jīng)劃線接種的青枯菌的培養(yǎng)基中央，輕輕按壓使其服帖在培養(yǎng)基上，每個濃度3 次重復，將無菌水浸泡的濾紙碟作為對照。做好標記，放入32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min 后將培養(yǎng)基倒扣繼續(xù)培養(yǎng)72 h后觀察、測量。

2）劃線+打孔法（方法2）：將待測的青枯病菌均勻的在NA 培養(yǎng)基上進行劃線，然后用直徑為7 mm 的打孔器在培養(yǎng)基中央打孔，將打孔后的培養(yǎng)基取出，使培養(yǎng)基中央形成一個洞穴，然后用移液槍吸取相應的藥劑30 μL注入到洞穴中，每個濃度3 次重復，將洞穴注入無菌水作為對照。做好標記，放入32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后觀察、測量。

3）噴霧+紙碟法（方法3）：將直徑為7 mm 的無菌中性濾紙碟浸泡在每一梯度濃度的藥劑液中15 s，然后用滅菌鑷子取出濾紙碟，將剩余的藥液瀝干，然后將吸附藥液的3 張濾紙碟重疊放入NA 培養(yǎng)基中央，輕輕按壓使其服帖在培養(yǎng)基上。然后用無菌喉頭噴霧器將濃度為3×108cfu/mL 的煙草青枯菌懸液噴入放有濾紙碟的NA 培養(yǎng)基上，每個濃度3 次重復，將無菌水浸泡的濾紙碟作為對照。做好標記，靜置30 min后，將平板倒扣置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后觀察、測量。

4）噴霧+打孔法（方法4）：用直徑為7 mm 的打孔器在培養(yǎng)基中央打孔，將打孔后的培養(yǎng)基取出，使培養(yǎng)基中央形成一個洞穴，用移液槍吸取相應的藥劑注入到洞穴中，然后用無菌喉頭噴霧器將濃度為3×108cfu/mL 的煙草青枯菌懸液噴入NA 培養(yǎng)基上，每個濃度3 次重復，將洞穴注入無菌水作為對照。做好標記，放入32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后觀察、測量。

在初步探究4 種對峙培養(yǎng)方法后發(fā)現(xiàn)紙碟法效果最佳，在重復第2 次試驗中采用劃線+紙碟法考察6 種藥劑對青枯病菌的室內(nèi)防治效果。

1.2.4 抑菌圈觀察、測量及計算公式 對峙培養(yǎng)的培養(yǎng)基置于32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，取出。觀察抑菌圈的形態(tài)（包括抑菌圈的透明度、邊緣清晰度和界限明顯度）。以及測量抑菌圈直徑的大?。ㄒ詍m為單位），計算其平均值。計算如下：

式中，d1為抑菌圈直徑，d2為長直徑，d3為濾紙碟直徑或洞穴直徑，d4為短直徑，D1為平均抑菌圈直徑，D為重復的抑菌圈直徑之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種對峙培養(yǎng)測定方法的效果

觀察比較4種方法發(fā)現(xiàn)，利用紙碟吸附藥液的方式比利用打孔形成洞穴注入藥液的方式效果更佳，操作更簡便，能形成邊界明顯、透明的抑菌圈。在同樣是利用紙碟吸附藥液的方式中，劃線和噴霧的方式接種病原細菌的方式各有優(yōu)勢。劃線方式操作簡單、不易污染，但是容易隨著灑落在培養(yǎng)基表面的水蒸氣變模糊；噴霧的方式均勻，但是操作較復雜、易污染。

如圖1所示，劃線+紙碟和噴霧+紙碟對峙方法效果好，其操作簡單，抑菌圈透明度高、邊界清晰。而劃線+打孔和噴霧+打孔對峙方法效果差。故在6 種藥劑防治煙草青枯病菌的室內(nèi)防治試驗中，選用劃線+紙碟法進行藥效的測定。

圖1 同一濃度、不同方法中生·四霉素對煙草青枯病菌對峙培養(yǎng)的效果（依次為方法1、2、3、4）

2.2 6種藥劑防治煙草青枯病菌的效果

從表2 可知，藥劑1 號、2 號、3 號、4 號對煙草青枯病菌有抑制作用，5號、6號對煙草青枯病菌無抑制作用。其中抑制效果最好的是1 號，4 號藥劑其次。從抑菌圈的形態(tài)上看，1 號藥劑（中生·四霉素）對青枯病菌的對峙產(chǎn)生的抑菌圈是透明、邊緣清晰和界限明顯的，且平均抑菌圈直徑在中濃度和最大濃度下分別為16.5 mm 和28.5 mm，說明該殺菌劑對該病害的防治效果最佳。4 號藥劑1 000 億芽孢/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制效果較好，平均抑菌圈直徑在中濃度和最大濃度下分別為22 mm 和13 mm，抑菌圈為半透明、邊緣較清晰、界限較明顯。

表2 采用紙碟+劃線法對6種藥劑的藥效進行測定后的平均抑菌圈直徑和形態(tài)

3 分析與結(jié)論

煙草青枯病是常見的細菌性病害，目前利用藥劑防治該病害仍然是主要的方法，因而研究在室內(nèi)對病原細菌進行藥劑對峙試驗，篩選出效果好的藥劑進行防控，對大田防治具有十分重要的意義。

研究設(shè)計劃線和噴霧2種接種細菌方法，紙碟和洞穴2 種投放藥劑方法。組合形成4種不同室內(nèi)對峙試驗的方法，即劃線+紙碟法、劃線+打孔法、噴霧+紙碟法、噴霧+打孔法，考察4 種方法的測定效果，并選取最優(yōu)方法考察中生·四霉素、木霉菌；春雷·中生、枯草芽孢桿菌、中生菌素、哈茨木霉菌6 種殺菌劑對煙草青枯病菌的抑制效果。結(jié)果表明，利用紙碟比洞穴投放藥劑的效果好，即劃線+紙碟和噴霧+紙碟對峙方法效果好，劃線+紙碟法操作簡單，抑菌圈透明度高、邊界清晰，使其與紙碟中的藥劑產(chǎn)生抑制效應，進而產(chǎn)生抑菌圈，相比于“改良抑菌圈法”產(chǎn)生的抑菌圈操作較簡單、直觀、可量化［4］，在操作過程中推薦使用；6 種殺菌劑中，中生·四霉素、春雷·中生、2億孢子/g木霉菌可濕性粉劑和1 000 億芽孢/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對煙草青枯病菌均產(chǎn)生了抑制作用，前兩者是化學殺菌劑，后兩者是微生物藥劑。從抑菌圈的形態(tài)上看，1 號藥劑（中生·四霉素）對青枯病菌的對峙產(chǎn)生的抑菌圈表現(xiàn)為透明、邊緣清晰、界限明顯，且平均抑菌圈直徑在中濃度和最大濃度下分別為16.5 mm 和28.5 mm，說明該殺菌劑對該病害的防治效果最佳。4 號1 000 億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑藥劑抑制效果次之，平均抑菌圈直徑在中濃度（推薦劑量）和最大濃度（最大劑量）下分別為22 mm和13 mm，抑菌圈呈半透明，邊緣較清晰、界限較明顯。化學藥劑在防治煙草青枯病菌中的研究較多，且防治效果明顯，但是化學藥劑的副作用較大［5］，可在煙草生產(chǎn)種植中酌情使用。目前關(guān)于市面上微生物藥劑對煙草青枯病菌的抑制作用的研究報道較少［6］，因此研究同時對常見的3 種微生物藥劑的防治效果進行初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木霉菌可濕性粉劑、枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對煙草青枯病菌具有一定的抑制作用，且試驗中從抑菌圈直徑上觀察，推薦劑量下，其抑制的效果大于春雷·中生這一化學藥劑。

研究表明，1 000 億芽孢/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑藥劑且平均抑菌圈直徑在推薦劑量和最大劑量下分別為22 mm 和13 mm，抑菌圈呈半透明、邊緣較清晰、界限較明顯。綜合推薦劑量和藥劑類型考慮，推薦劑量下1 000 億芽孢/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑可作為室內(nèi)防治煙草青枯病菌的最佳微生物藥劑，該發(fā)現(xiàn)對煙草病害的綠色防治具有十分重要的意義。但研究仍存在選取的微生物藥劑不夠豐富，且抑制的效果有待提高等不足，需對微生物藥劑和煙草根圍土壤拮抗微生物的篩選試驗進一步研究，為煙草青枯病菌防治提供更科學的參考依據(jù)。