馬洪娜 王海燕 黃麗容 檀龍顏

（貴州中醫(yī)藥大學，貴州貴陽 550025）

在喀斯特地區(qū)土壤中，高濃度鈣離子能夠顯著抑制植物生長，影響農作物產量以及植物種類和群落的分布[1]。檀龍顏等[2]觀察了鈣離子脅迫對金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）種子萌發(fā)的影響，結果顯示，在低濃度鈣離子脅迫時，萌發(fā)種子主要受到滲透脅迫，細胞通過抗氧化酶清除活性氧自由基，而在高濃度鈣離子脅迫時，萌發(fā)種子可能受到離子毒害作用。呂朝燕等[3]觀察了鈣離子脅迫對白車軸草（Trifolium repens）、紫云英（Astragalus sinicus）、紫花苜蓿（Medicago sativa）種子的影響，發(fā)現鈣脅迫下紫花苜蓿種子恢復萌發(fā)率較好、對高濃度鈣離子環(huán)境的適應能力要好于白車軸草和紫云英，是喀斯特地區(qū)較為適宜的栽培牧草品種。馮曉英等[4]分析了鈣離子脅迫下傘花木（Eurycorymbus cavaleriei）和華山松（Pinus armandii）幼苗中的脯氨酸和可溶性蛋白含量，結果顯示傘花木比華山松更能適應貴州高鈣的喀斯特環(huán)境。此外，彭 博等[5]觀察了不同鈣濃度梯度下狹葉香蒲（Typha angustifolia）的生長狀況及生理特性，發(fā)現狹葉香蒲對高濃度鈣脅迫有較強的適應能力，可作為喀斯特湖濱濕地植被恢復及生態(tài)重建的理想材料。檀龍顏等[6]研究發(fā)現，鈣離子脅迫對金蕎麥幼葉的影響主要表現為滲透脅迫，在一定程度上解釋了金蕎麥在貴州成為廣布種的原因。檀龍顏等[1]對植物響應鈣離子脅迫的機制進行了研究，認為植物通過富集鈣離子方式、通過表皮結構將鈣離子排出、通過合成滲透保護物質應對鈣離子導致的滲透脅迫、通過抗氧化酶系統(tǒng)消除鈣離子導致的氧化脅迫、通過固醇甲基轉移酶調節(jié)鈣離子脅迫下膜的完整性、通過增強光合特性適應鈣離子脅迫等機制適應高濃度鈣離子環(huán)境。但是，以高濃度鈣離子為非生物脅迫因素的研究較少，而系統(tǒng)性鈣離子脅迫研究將為解析喀斯特地區(qū)植物的適生機制、品種選育和石漠化治理提供有價值的科學依據。

喜鈣植物越南槐（Sophora tonkinensis）為豆科植物，其干燥根和根莖入藥稱為山豆根[7-8]。山豆根為臨床常用藥，屬清熱解毒藥[8]。同時，山豆根也是一種重要工業(yè)原料。越南槐的繁殖方式主要是種子繁殖[9]。本課題組先期對鈣脅迫下越南槐萌發(fā)種子的萌發(fā)率、含水量、總可溶性糖含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性和過氧化物酶活性等指標進行了研究，顯示鈣脅迫對越南槐種子可能產生滲透脅迫[10]。本文在先期研究結果的基礎上，研究了其他滲透保護物質（脯氨酸和甜菜堿）含量、電導率、不同活性氧自由基（過氧化氫和超氧陰離子）的含量以及抗氧化酶系統(tǒng)其他主要酶活性，以期為驗證和解析越南槐適應貴州喀斯特生境的生理機制提供基礎資料，為貴州越南槐規(guī)模化種植提供科學指導，為植物響應鈣離子脅迫的生理機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為越南槐種子，于2018年9月采自安順市紫云縣貓營鎮(zhèn)山豆根種繁基地，室內陰干后，于4℃保存，備用。供試試劑為CaCl2。

1.2 試驗方法

試驗共設3個處理，即以蒸餾水為對照（CK），50 mmol/L CaCl2溶液（A）、100 mmol/L CaCl2溶液（B）作為鈣脅迫處理條件。供試種子采用2%次氯酸鈉消毒20 min。每個處理選用50粒大小均勻、飽滿的種子，將這些種子置于直徑15 cm的培養(yǎng)皿中，基質為2層定性濾紙（蒸餾水充分潤濕，無明水）。分別用蒸餾水及50、100 mmol/L CaCl2溶液潤濕基質，每天上午9：00定時補充溶液。3次重復。將培養(yǎng)皿置于人工智能氣候箱中培養(yǎng)，要求黑暗條件、溫度25℃。發(fā)芽標準為胚根突破種皮1 mm以上，發(fā)芽結束標準為連續(xù)5 d無新發(fā)芽種子[11]。本試驗觀察20 d，試驗過程中及時補充處理液。

測定指標包含脯氨酸含量、甜菜堿含量、電導率、超氧陰離子含量、過氧化氫含量及抗壞血酸過氧化物酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶活性，測定方法參考文獻[12]。

1.3 數據統(tǒng)計及分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 脯氨酸和甜菜堿含量變化

從圖1可以看出，處理A越南槐萌發(fā)種子中脯氨酸含量與CK之間無明顯差異，但是處理B脯氨酸含量與CK相比顯著升高。從圖2可以看出，越南槐萌發(fā)種子中甜菜堿含量變化與脯氨酸含量變化不同，處理A甜菜堿含量與CK相比顯著增加，但處理B甜菜堿含量與CK無明顯差異。本課題組先前研究發(fā)現，總可溶性糖含量隨著鈣離子濃度的增加逐漸增加[10]。這表明處理A滲透保護物質以總可溶性糖和甜菜堿為主，而處理B滲透保護物質以總可溶性糖和脯氨酸為主。

2.2 電導率變化

從圖3可以看出，越南槐萌發(fā)種子的電導率隨著鈣離子濃度的升高表現出先升高后下降的趨勢，但處理B越南槐萌發(fā)種子的電導率與CK相比仍然較高。本課題組先前研究發(fā)現，丙二醛含量隨著鈣離子濃度的升高呈逐漸增加趨勢[10]。以上結果表明，在高濃度鈣離子脅迫下，萌發(fā)種子的膜發(fā)生了氧化性損傷，且發(fā)生了電解質泄漏。

2.3 過氧化氫和超氧陰離子含量變化

從圖4、5可以看出，越南槐萌發(fā)種子中過氧化氫、超氧陰離子的含量隨著CaCl2濃度的增加逐漸升高。以上結果表明，在高濃度鈣離子脅迫下，細胞內產生了活性氧自由基，引起了細胞氧化性損傷。

2.4 不同處理4種酶活性變化

本課題組前期研究表明，過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性和過氧化物酶的活性隨著鈣離子濃度的增加呈逐漸增強趨勢[10]。從圖6可以看出，處理A抗壞血酸過氧化物酶活性與CK相比無明顯差異，但處理B抗壞血酸過氧化物酶活性與CK相比顯著增強。從圖7、8、9可以看出，單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶的活性均隨著CaCl2濃度的增加而增加。以上結果顯示，抗氧化酶系統(tǒng)啟動用于活性氧自由基的清除。

3 結論與討論

3.1 結論

本文研究發(fā)現，在CaCl2濃度不超過100 mmol/L時，鈣離子脅迫對越南槐種子的脅迫主要為滲透脅迫，種子細胞通過合成甜菜堿和脯氨酸等滲透保護物質維持細胞滲透平衡，滲透脅迫誘導產生的活性氧自由基主要通過抗氧化酶系統(tǒng)清除。

3.2 討論

3.2.1 越南槐種子通過合成滲透保護物質維持滲透平衡。用不同濃度（0～240 mmol/L）的CaCl2溶液處理提燈蘚（Mnium cuspidatum）、石地錢（Reboulia hemisphaerica）、青蘚（Brachythecium albicans）3 種苔蘚植物配子體發(fā)現，隨著CaCl2濃度超過40 mmol/L，可溶性糖和脯氨酸含量急劇上升[13]。用含不同濃度CaCl2（0～200 mmol/L）的液體MS培養(yǎng)基培養(yǎng)假馬齒莧（Bacopa monnieri）28 d 后發(fā)現，與空白對照相比，在150、200 mmol/L CaCl2處理下，甜菜堿含量逐漸升高[14]。本課題組結果顯示，越南槐萌發(fā)種子通過合成總可溶性糖、脯氨酸和甜菜堿維持細胞滲透平衡，且在50 mmol/L CaCl2處理下，滲透保護物質以總可溶性糖和甜菜堿為主，而在100 mmol/L CaCl2處理下，滲透保護物質以總可溶性糖和脯氨酸為主。滲透保護物質含量的提高能有效降低細胞水勢、增強吸水功能，進而抵抗因鈣離子濃度提高造成的滲透脅迫[1]。

3.2.2 越南槐種子通過抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧。在高濃度鈣離子處理下，單性木蘭、傘花木、青岡櫟和華山松的過氧化物酶活性隨鈣離子濃度的增加而增加[15]。 用含不同濃度 CaCl2（0～200 mmol/L）的液體MS培養(yǎng)基培養(yǎng)假馬齒莧苗28 d后發(fā)現，當CaCl2濃度大于100 mmol/L時，苗中丙二醛含量顯著增加[14]；在0～100 mmol/L CaCl2處理下，隨著CaCl2濃度的升高，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性逐漸增加，且在100 mmol/L CaCl2處理下抗壞血酸過氧化物酶活性顯著高于0、50 mmol/L CaCl2處理[14]。使用含CaCl2（0～200 mmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)印度人參苗，苗中過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶活性均隨CaCl2濃度的升高而升高[16]。在高濃度鈣離子脅迫下，越南槐萌發(fā)種子中丙二醛含量增加，膜質遭到氧化[10]，電解質發(fā)生泄漏。而超氧陰離子和過氧化氫含量的增加，表明這2種活性氧自由基在膜質氧化過程中發(fā)揮了作用（圖10）。抗氧化酶活性[10]檢測發(fā)現，除抗壞血酸過氧化物酶活性在100 mmol/L鈣離子濃度下增強外，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶的活性均隨著鈣離子濃度的增強而增加（圖10）。因此，抗氧化酶系統(tǒng)在活性氧自由基清除過程中發(fā)揮了重要作用。