王 森 黃宇希 彭 歡 蘇 鵬 黎睿君 *

（1大連海洋大學(xué)遼寧省海洋動(dòng)物免疫學(xué)與疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；3大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；4大連富谷食品有限公司，遼寧莊河116400）

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes），隸屬于鲀形目（Tetraodontiformers）、鲀亞目（Tetraodontoidei）、鲀科（Tetraodontidae）、東方鲀屬（Takifugu），俗稱河鲀，主要分布于中國(guó)、日本、朝鮮及韓國(guó)等亞洲北部沿海地區(qū)[1]。紅鰭東方鲀?nèi)赓|(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，享有“魚(yú)中之王”的美譽(yù)，因其具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國(guó)河北、山東、遼寧大連等地均廣泛養(yǎng)殖[2]。近年來(lái)，紅鰭東方鲀養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，已成為我國(guó)北方重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種[3]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害問(wèn)題也日趨嚴(yán)重，制約其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。關(guān)于紅鰭東方鲀免疫系統(tǒng)及免疫機(jī)制的研究受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，以期通過(guò)免疫手段對(duì)病害進(jìn)行預(yù)防。

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是由 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在有頜脊椎動(dòng)物的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起重要作用的一類免疫活性分子。一個(gè)典型的免疫球蛋白分子由2條重（H）鏈和2條輕（L）鏈組成，每條鏈包含1個(gè)可變（V）區(qū)和1個(gè)或多個(gè)（在H鏈中）恒定（C）區(qū)?？乖Y(jié)合通過(guò)H和L鏈V區(qū)所進(jìn)行[4]。根據(jù)CH區(qū)的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異可將Ig劃為多種類型，目前在哺乳動(dòng)物中已鑒定出IgM、IgD、IgG、IgE和IgA等5種亞型[5]，在硬骨魚(yú)中已發(fā)現(xiàn)IgM、IgD、IgT和IgZ[6]等。其中，IgM作為系統(tǒng)及個(gè)體發(fā)育中最早出現(xiàn)的免疫球蛋白，是魚(yú)類特異性體液免疫應(yīng)答中的最主要介質(zhì)[7]，在抵抗病原入侵方面發(fā)揮著重要作用[8]。

抗體具有特異性高、親和力高、半衰期長(zhǎng)以及毒性低等特點(diǎn)，是脊椎動(dòng)物免疫學(xué)診斷及治療的重要工具[9]。硬骨魚(yú)類抗體的功能與哺乳動(dòng)物相似，具有調(diào)理吞噬細(xì)胞、激活補(bǔ)體途徑、中和細(xì)菌和病毒等作用?？贵w也可用來(lái)檢測(cè)與純化抗原，免疫印跡、免疫沉淀、免疫組織化學(xué)和免疫親和層析等試驗(yàn)均需要抗體參與[10]。本試驗(yàn)克隆并表達(dá)了紅鰭東方鲀IgM的CH區(qū)片段，并利用重組表達(dá)的IgM蛋白制備鼠抗血清，以期為紅鰭東方鲀免疫系統(tǒng)、免疫機(jī)制研究及相關(guān)免疫檢測(cè)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀來(lái)自遼寧省大連市富谷紅鰭東方鲀養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)約20 cm；BALB/c小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；克隆載體pMD19 simple、表達(dá)載體pET28a均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司；Tris、Glycine、AP標(biāo)記的兔抗鼠IgG均購(gòu)自BBI公司。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

取紅鰭東方鲀成魚(yú)脾臟，按照RNAiso Plus試劑盒操作說(shuō)明提取紅鰭東方鲀脾臟總RNA，按照Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將提取的紅鰭東方鲀脾臟總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，于-20℃保存。

1.3 紅鰭東方鲀IgM重鏈基因克隆

根據(jù)GenBank中收錄的紅鰭東方鲀IgM基因序列（登錄號(hào)：AB125609.1），利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)用于IgM CH區(qū)（CH1～CH4）基因擴(kuò)增的特異性引物，上游引物TrIgM-F1帶有Sac I酶切識(shí)別位點(diǎn)：5′-CGAGCTCGCAACACCCAAAGCCCCTTCTCTG-3′，下游引物TrIgM-R1帶有Xho I酶切識(shí)別位點(diǎn)：5′-CC GCTCGAGCTTGGCCTTGCACTTGTCGGGGAT-3′，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為1 326 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用特異性引物TrIgMF1和TrIgM-R1擴(kuò)增紅鰭東方鲀IgM H鏈基因，將反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的片段?；厥蘸蟮钠闻cpMD19 simple載體連接，連接后的產(chǎn)物pMD19-IgM轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB平板（含氨芐西林），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定并送樣檢測(cè)。

1.4 紅鰭東方鲀IgM原核表達(dá)體系的構(gòu)建

將鑒定正確的陽(yáng)性單菌落擴(kuò)培后經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，用Xho I和Sac I雙酶切處理pMD19-IgM與質(zhì)粒pET28a，雙酶切產(chǎn)物切膠回收后使用T4連接酶16℃連接過(guò)夜。連接獲得重組質(zhì)粒pET28a-IgM轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板（含卡那霉素），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定并送樣檢測(cè)，檢測(cè)正確的菌液擴(kuò)培后提取質(zhì)粒，將pET28a-IgM轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB平板（含卡那霉素），再于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，檢測(cè)正確菌液擴(kuò)培后-80℃保存。

1.5 紅鰭東方鲀IgM重組蛋白表達(dá)與制備

將BL21-pET28a-IgM菌株接種到LB液體培養(yǎng)中（含卡那霉素），于37℃條件下振蕩培養(yǎng)至吸光度為0.4時(shí)加入0.1 mol/L IPTG誘導(dǎo)劑，在37℃條件下誘導(dǎo)1 h后，于4℃條件下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心20 min。盡量去除培養(yǎng)上清液，用適量無(wú)菌PBS緩沖液重懸沉淀。于4℃條件下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心20 min，洗滌1次后置于超聲波破碎裝置中，在冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎。以255 Hz超聲波處理5 s，暫停5 s，溶液至澄清后停止破碎。然后，于4℃條件下以轉(zhuǎn)速12 000r/min離心20 min。分別收集上清液與沉淀，沉淀用與上清液相同體積的無(wú)菌PBS重懸。采用12%SDS-PAGE電泳分析上清液、沉淀與菌體中重組蛋白的表達(dá)情況。

將收集的重組蛋白沉淀依次使用濃度為0、2、4、6 mol/L尿素溶液于4℃以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心20 min洗滌，并用8 mol/L尿素溶液溶解過(guò)夜。于4℃以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行透析復(fù)性。透析液中尿素濃度依次為 4.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0 mol/L等8個(gè)梯度，每隔8 h更換1次透析液。復(fù)性后重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，于-80℃保存。

1.6 鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體的制備

選6只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，采用腹腔注射方式進(jìn)行免疫。將紅鰭東方鲀IgM重組蛋白在冰上解凍，與等體積的弗氏佐劑充分乳化，制成疫苗。首次免疫使用弗式完全佐劑，免疫計(jì)量100 μL/只。首免2周后進(jìn)行第2次免疫，加強(qiáng)免疫使用弗式不完全佐劑，免疫計(jì)量為100 μL/只。取IgM重組蛋白50 μg與弗氏完全佐劑等量混合乳化，于小鼠腹腔進(jìn)行注射。7 d后進(jìn)行第3次免疫，第3次免疫7 d后采用心臟取血方法，分離純化多抗血清。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，對(duì)照組不進(jìn)行注射，與免疫組同時(shí)取血并分離純化血清。

1.7 鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體Western Blot分析

通過(guò)尾部取血方法收集紅鰭東方鲀成魚(yú)血清，將重組蛋白與天然紅鰭東方鲀血清進(jìn)行SDS-PAGE電泳與Western Blot分析。Western Blot同時(shí)設(shè)立試驗(yàn)組與對(duì)照組，待SDS-PAGE電泳結(jié)束后，用PVDF膜（需提前使用甲醇浸泡）小心覆蓋住膠體并驅(qū)趕氣泡，濾紙及夾板夾緊置于轉(zhuǎn)膜儀中，恒流180 mA，轉(zhuǎn)膜50 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，小心取出PVDF膜，將膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中，室溫封閉2 h；棄去脫脂奶粉溶液，使用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；試驗(yàn)組加入PBS緩沖液按1∶1 000比例稀釋的鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體作為一抗，對(duì)照組使用按1∶1 000比例稀釋的未注射組小鼠血清，于4℃孵育過(guò)夜；使用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；加入PBS緩沖液按1∶3 000比例稀釋的AP標(biāo)記兔抗鼠二抗，室溫孵育1 h；使用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；根據(jù)膜的大小加入適當(dāng)體積的NBT/BCIP顯色試劑，避光室溫孵育至顯色，將膜置于去離子水中，終止顯色反應(yīng)并觀察試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅鰭東方鲀IgM重鏈基因克隆與原核表達(dá)體系的構(gòu)建

根據(jù)紅鰭東方鲀IgM CH區(qū)（CH1～CH4）基因設(shè)計(jì)特異性引物TrIgM-F1和TrIgM-R1，對(duì)提取的紅鰭東方鲀cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并切膠回收，擴(kuò)增條帶大小為1 300 bp左右，與目的基因（1 326 bp）大小相符，見(jiàn)圖1（a）。將回收后片段與pMD19 simple載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定并送樣檢測(cè)，檢測(cè)正確后提取質(zhì)粒。使用Xho I和Sac I雙酶切處理pMD19-IgM與質(zhì)粒pET28a，將目的基因插入表達(dá)載體pET-28a，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定并送樣檢測(cè)，檢測(cè)正確后提取質(zhì)粒。將pET28a-IgM轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增條帶大小為1 300 bp左右，與目的基因大小相符，見(jiàn)圖2（b）。這表明BL21-pET28a-IgM表達(dá)體系構(gòu)建完成。

2.2 紅鰭東方鲀IgM重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

選取加入0.1 mol/L IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)菌體BL21-pET28a-IgM，利用超聲波破碎后離心，將pET28a空載體菌與誘導(dǎo)后的BL21-pET28a-IgM表達(dá)菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖2（a）。結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的表達(dá)菌有目的蛋白表達(dá)，蛋白分子量為62 kDa左右，與預(yù)期相符合。取表達(dá)菌總蛋白、破碎后上清和無(wú)菌PBS重懸沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖2（b），目的蛋白只存在于沉淀中，說(shuō)明IgM以包涵體形式表達(dá)。

2.3 鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體Western Blot分析

將復(fù)性后重組蛋白與天然紅鰭東方鲀血清進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot分析。SDS-PAGE結(jié)果表明，天然紅鰭東方鲀血清中76kDa處有明顯蛋白條帶，為紅鰭東方鲀分泌型IgM（sIgM）蛋白（圖3）。Western Blot結(jié)果顯示，試驗(yàn)組鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體可以特異性識(shí)別天然紅鰭東方鲀血清76 kDa處蛋白，見(jiàn)圖 4（a），同時(shí)可以特異性識(shí)別62 kDa處重組蛋白且顯色過(guò)程迅速（1 min）；對(duì)照組血清未出現(xiàn)條帶，見(jiàn)圖4（b），表明鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體不僅可以特異性識(shí)別IgM重組蛋白，而且可以特異性識(shí)別天然紅鰭東方鲀血清中的IgM蛋白。以上結(jié)果與預(yù)期相符合，說(shuō)明鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體已成功制備。

3 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)NCBI紅鰭東方鲀IgM H鏈序列，成功克隆紅鰭東方鲀IgM的CH區(qū)（CH1～CH4）1 326 bp基因。紅鰭東方鲀IgM H鏈全長(zhǎng)約為3 500 bp，其中sIgM約為1 900 bp，包含一個(gè)VH區(qū)和CH1～CH4這4個(gè)恒定區(qū)。其中每個(gè)VH結(jié)構(gòu)域可分為3個(gè)高度可變序列的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）和4個(gè)相對(duì)恒定序列的框架區(qū)（FR）。VH結(jié)構(gòu)域的多樣性主要由3個(gè)CDR區(qū)域決定，CDR區(qū)域序列具有高變性，有利于識(shí)別不同種抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。IG亞型則可以基于CH區(qū)的性質(zhì)來(lái)定義[11]，與哺乳動(dòng)物sIgM五聚體的結(jié)構(gòu)不同，魚(yú)類sIgM在CH4結(jié)構(gòu)域下游缺少一個(gè)額外的結(jié)構(gòu)域，是由2條L鏈和2條H鏈所組成的單體通過(guò)連接鏈“J”將4個(gè)單體連接而成，為四聚體結(jié)構(gòu)[12]。

IgM作為硬骨魚(yú)類體內(nèi)含量最多的免疫球蛋白，目前研究認(rèn)為其主要分布于魚(yú)類的腎臟、胸腺及脾臟器官中，而隨著魚(yú)類個(gè)體的生長(zhǎng)，胸腺逐漸退化，其在免疫中發(fā)揮的功能也逐漸減小[13]。Saha等[14]研究發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀中頭腎、中腎與脾臟中IgM的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織，而胸腺中IgM的表達(dá)量與其他組織并無(wú)顯著性差異，表明成年紅鰭東方鲀的胸腺在機(jī)體免疫中的作用可能并不如脾臟與頭腎重要。對(duì)草魚(yú)[15]、金魚(yú)[16]等魚(yú)類的研究也證明魚(yú)類的腎臟與脾臟在魚(yú)類的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。對(duì)紅鰭東方鲀?cè)缙诎l(fā)育時(shí)期的sIgM mRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在孵化后1 d已經(jīng)產(chǎn)生表達(dá)，表明紅鰭東方鲀可能在早期就可以識(shí)別抗原并產(chǎn)生相關(guān)免疫應(yīng)答[14]。當(dāng)細(xì)菌、寄生或者病毒刺激魚(yú)體時(shí)，研究魚(yú)體內(nèi)的IgM的變化規(guī)律有助于病害的防治工作。Tsutsui等[17]通過(guò)親和層析法與離子交換層析法從天然紅鰭東方鲀血清中分離得到IgM蛋白，發(fā)現(xiàn)其對(duì)海水魚(yú)類常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌以及大腸桿菌的生長(zhǎng)都有顯著的抑制作用，表明IgM分子在抵抗魚(yú)類細(xì)菌性疾病中發(fā)揮重要作用；在抵抗寄生蟲(chóng)疾病方面，紅鰭東方鲀皮膚和鰓的黏膜中分泌的IgM分子同樣被證實(shí)可以與單殖吸蟲(chóng)的纖毛表皮細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而識(shí)別并抵抗寄生蟲(chóng)寄生[18]。

為研究紅鰭東方鲀患病前后IgM表達(dá)量的變化規(guī)律，本研究將合成的IgM基因片段克隆到pET28a載體上進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果表明，pET28a-IgM蛋白大部分以包涵體的形式存在，通過(guò)尿素使蛋白變性后透析復(fù)性得到可溶蛋白TrIgM。本研究以TrIgM蛋白作為抗原制備了鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體，為了檢測(cè)制備的抗血清的結(jié)合特異性，分別與TrIgM蛋白、天然紅鰭東方鲀血清進(jìn)行了Western Blot檢測(cè)。有研究表明，紅鰭東方鲀的IgM H鏈約為76 kDa[19]，與本試驗(yàn)中Western Blot檢測(cè)的紅鰭東方鲀IgM的大小相符，說(shuō)明所制備的TrIgM鼠抗血清可以與天然紅鰭東方鲀血清中的IgM特異性結(jié)合。因此，本試驗(yàn)中所制備的TrIgM鼠抗血清可以用于檢測(cè)紅鰭東方鲀IgM在不同條件下表達(dá)量。

綜上所述，本研究成功合成了紅鰭東方鲀IgM CH區(qū)基因片段，表達(dá)了TrIgM H鏈蛋白并成功制備了鼠抗紅鰭東方鲀IgM多克隆抗體，為進(jìn)一步研究紅鰭東方鲀IgM在不同條件下的表達(dá)規(guī)律和免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。