郝莉雨 李宗源 孫建輝 單中超 于澤玥 陳紅映 霍海如 李綺婧 張宏萌 李洪梅

摘要 目的：探究當(dāng)歸水提取物的補(bǔ)血作用，以及對(duì)血虛證模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。方法：采用單純放血法制備血虛證小鼠模型，通過測(cè)定小鼠外周血象、胸腺指數(shù)、紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性評(píng)價(jià)當(dāng)歸水提取物的補(bǔ)血作用，并利用MiSeq平臺(tái)對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，探究當(dāng)歸水提取物對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：與模型組比較，當(dāng)歸組雌性小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)量、白細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P<0.05），胸腺指數(shù)有上升趨勢(shì)，紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性顯著升高（P<0.01）;當(dāng)歸水提取物顯著提高血虛證小鼠腸道菌群中的益生菌屬如Lactobacillus（乳桿菌屬）、Muribaculaceae（Muri菌）、Alloprevotella（普雷沃菌屬）的豐度，且相關(guān)性分析表明，血虛證小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)量、白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白量、血細(xì)胞比容與腸道多種微生物群落豐度具有顯著相關(guān)性。結(jié)論：當(dāng)歸水提取物具有補(bǔ)血作用，且對(duì)小鼠腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞 血虛證;當(dāng)歸;腸道菌群;外周血象;補(bǔ)血

Effect of Angelica sinensis Water Extract on Tonifying Blood and Regulating Intestinal Flora

HAO Liyu1，LI Zongyuan1，2，SUN Jianhui1，SHAN Zhongchao1，YU Zeyue1，CHEN Hongying1，3，HUO Hairu1，LI Qijing4，ZHANG Hongmeng4，LI Hongmei1

（1 Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China; 3 Qionghai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qionghai 571400，China; 4 Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355，China）

Abstract Objective：To explore the blood-tonifying effect of Angelica sinensis water extract and the influence on intestinal flora in mice with blood deficiency syndrome.Methods：The model of blood deficiency syndrome in mice was induced by simple bloodletting method.The blood-tonifying effect of A.sinensis water extract was evaluated by measuring the peripheral blood，thymus index，and erythrocyte membrane Na+-K+-ATPase activity of the mice.The content of cecum in mice was subjected to 16S ribosomal ribonucleic acid（16S rDNA） sequencing by MiSeq to explore the effect of A.sinensis water extract on the structure of intestinal flora.Results：Compared with the model group，the number of peripheral blood red blood cells（RBC） and the number of white blood cells（WBC） from the female mice in the A.sinensis water extract group were significantly increased（P<0.05），the thymus index had an upward trend，and Na+-K+-ATPase activity was significantly increased（P<0.01）.A.sinensis water extract significantly increased the abundance of probiotics in the intestinal flora of mice，such as Lactobacillus，Muribaculaceae，and Alloprevotella.The correlation analysis showed that the number of RBC，WBC，hemoglobin（HGB），and hematocrit（HCT） was significantly correlated with the abundance of various intestinal microbial communities.Conclusion：A.sinensis water extract has the blood-tonifying effect and regulates the intestinal flora of mice.

Keywords Blood deficiency syndrome; Angelica sinensis; Intestinal flora; Peripheral blood; Blood tonification

中圖分類號(hào)：R256.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.002

在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中，血液運(yùn)行周身濡養(yǎng)臟腑、形體與經(jīng)絡(luò)，支持人體的正常生命活動(dòng)，是人體的重要組成成分[1]。血虛證是臨床常見證候，主要是指人體血液絕對(duì)或相對(duì)不足，不能濡養(yǎng)滋潤臟腑經(jīng)脈、四肢百骸，而出現(xiàn)一系列虛弱性表現(xiàn)的證候總稱[2]，存在于多種疾病中[3]。血虛證形成原因多數(shù)為失血過多、脾胃虛弱，或者血液生化之源不足以及瘀血阻滯等[4]，目前對(duì)于血虛證的治療，以補(bǔ)血為主，兼以補(bǔ)氣[5]。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》記載[6]，當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便的功效，尤擅于婦科血虛血瘀證候諸疾的治療和調(diào)養(yǎng)，為“補(bǔ)血之圣藥”[7]。當(dāng)歸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[8-9]。腸道菌群是人體中的一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的微生物群落，其在維持免疫代謝動(dòng)態(tài)平衡和抵御病原體方面起到至關(guān)重要的作用[10]。

本研究采用單純放血法制備小鼠血虛證模型，在評(píng)價(jià)當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠治療效果的同時(shí)，探究其對(duì)血虛證模型小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響，為傳統(tǒng)中醫(yī)氣血理論與腸道內(nèi)環(huán)境的相關(guān)性研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠，40只，無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。小鼠飼育于屏障環(huán)境，保持飼養(yǎng)環(huán)境22～27 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，明暗交替12 h。試驗(yàn)所用的飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，飲用水由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0003。本研究所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過（倫理審批號(hào)：2020B174）。

1.1.2 藥物 當(dāng)歸（安國市昌達(dá)中藥材飲片有限公司，批號(hào)：2102003）。

1.1.3 試劑與儀器 小鼠Na+-K+-ATP酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試劑盒（凡科維公司，批號(hào)：202111）;DNA抽提試劑盒（Omega Bio-tek公司，美國，貨號(hào)：E.Z.N.A. soil DNA kit M9636-02）;瓊脂糖（biowest公司，西班牙，貨號(hào)：111860）;FastPfu Polymerase[北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）股份有限公司，貨號(hào)：AP211];AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，美國，貨號(hào)：AP-GX-250）;測(cè)序試劑盒（Illumina公司，美國，貨號(hào)：20028313）;電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：Sartorius BSA323S-CW）;電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號(hào)：PL203 METTLER TOLEDO];冷凍離心機(jī)（KUBOTA公司，日本，型號(hào)：5922）;電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：98-I-B）;全自動(dòng)流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Sysmex公司，日本，型號(hào)：XN-1000V）;小型離心機(jī)（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ABSON MiFly-6）;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國，型號(hào)：5424R）;超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific公司，美國，型號(hào)：NanoDrop2000）;酶標(biāo)儀（Biotek公司，美國，型號(hào)：ELx800）;旋渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：QL-901）;粉碎研磨儀（上海萬柏生物科技有限公司，型號(hào)：TL-48R）;研磨儀（MP公司，美國，型號(hào)：FastPrep-24 5G）;微型熒光計(jì)（Promega公司，美國，型號(hào)：QuantusTM）;電泳儀（北京市六一儀器廠，型號(hào)：DYY-6C）;測(cè)序儀（Illumina公司，美國，型號(hào)：Illumina Miseq）;超聲波破碎儀（Gene Company Limited公司，型號(hào)：Covaris M220）;超低溫冰箱（Thermo Fisher公司，美國，型號(hào)：Forma-86C）。PCR擴(kuò)增儀（ABI公司，美國，型號(hào)：GeneAmp 9700）。

1.2 方法

1.2.1 受試物制備 當(dāng)歸水提液的制備：稱取當(dāng)歸飲片200 g，放入圓底燒瓶，加入10倍量純凈水，置電熱套中加熱，保持微沸120 min，回流提取2次，過濾后合并濾液，取濾液置水浴鍋濃縮（80 ℃），得生藥質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的水提液，4 ℃保存[11]。

1.2.2 分組與模型制備 適應(yīng)期1～2 d，適應(yīng)期期間自由飲水、采食，給予小鼠維持飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組，分別為正常組（12只）、模型組（16只）、當(dāng)歸組（12只，劑量為4 g/kg），雌雄各半。除正常組外，其余各組給藥2周后采用單純放血法進(jìn)行造模，隔日經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢放血1次，約0.3 mL/次，持續(xù)3周，不限飲食，自由飲水。

1.2.3 給藥方法 除正常組、模型組外，其他各組灌胃給予相應(yīng)濃度的藥物，1次/d，連續(xù)35 d，正常組與模型組灌胃給予等體積的純凈水（20 mL/kg）。當(dāng)歸劑量設(shè)計(jì)：當(dāng)歸成人每天推薦用量按12 g（2020版《中華人民共和國藥典》推薦用量為6～12 g）計(jì)算，成人體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，以成人劑量的20倍作為小鼠的劑量，即為4 g/kg體質(zhì)量。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠體質(zhì)量的影響 每天觀察動(dòng)物一般狀況，每周稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.2.4.2 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠外周血象的影響 末次給藥1 h后，小鼠摘眼球取血，取0.3 mL全血于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，采用全自動(dòng)流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，檢測(cè)小鼠抗凝全血中紅細(xì)胞數(shù)量（Red Blood Cell，RBC）、白細(xì)胞數(shù)量（White Blood Cell，WBC）、血紅蛋白量（Hemoglobin，HGB）、血細(xì)胞比容（Hematocrit，HCT）、紅細(xì)胞平均體積（Mean Corpuscular Volume，MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白（Mean Corpuscular Hemoglobin，MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration，MCHC）、紅細(xì)胞體積分布寬度（Red Blood Distribution Width，RDW）、血小板數(shù)量（Platelet，PLT）。

1.2.4.3 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠胸腺指數(shù)的影響 取血后，將小鼠脫頸椎處死，摘取胸腺，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100。

1.2.4.4 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠紅細(xì)胞膜能量代謝酶活性的影響 將小鼠抗凝全血離心，吸取上層血漿，加入3倍體積的生理鹽水，輕輕顛倒混勻，（50～190）×g，離心5 min，棄上清留沉淀紅細(xì)胞，重復(fù)2～3次，直至上清液無色為止（洗滌紅細(xì)胞），應(yīng)用Elisa試劑盒測(cè)定Na+-K+-ATP酶活性。

1.2.4.5 腸道內(nèi)容物DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序? 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取小鼠回盲部容物于無菌無RNA酶離心管中，迅速置于液氮中，于-80 ℃保存。腸道內(nèi)容物DNA提取按DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度和純度;使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃，變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。PCR體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L，脫氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside-triphosphates ，dNTPs）2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，雙蒸水（Double-distilled Water，ddH2O）補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.2.4.6 Illumina Miseq測(cè)序 將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusTM Fluorometer對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫：1）接頭鏈接;2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段;3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集;4）磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4.7 生物信息分析 使用Fastp[12]（https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH[13]（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件進(jìn)行拼接，使用UPARSE[14]軟件（http：//drive5.com/uparse/，version 7.1），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行運(yùn)算分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）聚類并剔除嵌合體[15]，利用RDP classifier[16]（http：//rdp.cme.msu.edu/，version 2.2）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋。其中群落結(jié)構(gòu)多樣性基于α多樣性及β多樣性（主成分分析及PcoA分析）進(jìn)行;豐度顯著差異分類單元篩選使用LEfSe[17]方法在屬水平進(jìn)行，判別標(biāo)準(zhǔn)為：Kruskal-Wallis檢驗(yàn)篩選值α<0.05，配對(duì)Wilcoxon檢驗(yàn)篩選值α<0.05，顯著判別值線性判別分析（LDA）>2;小鼠腸道微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性利用Heatmap圖來分析，以WBC、RBC、HGB、HCT作為環(huán)境因子進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 腸道微生物多樣性采用生物信息學(xué)分析，其余藥效學(xué)指標(biāo)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠體質(zhì)量的影響?? 與正常組比較，造模后雌性模型組體質(zhì)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。雄性小鼠體質(zhì)量未見明顯影響。見表1。

2.2 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠外周血象的影響? 在雌性小鼠中，與正常組比較，模型組小鼠外周血RBC、HGB、HCT、RDW明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，當(dāng)歸組小鼠外周血RBC、WBC明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。雄性小鼠外周血象未見明顯影響。見表2。

2.3 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠胸腺的影響 在雌性小鼠中，與正常組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，當(dāng)歸組小鼠胸腺指數(shù)有上升趨勢(shì)。雄性小鼠胸腺指數(shù)未見明顯影響。見表3。

2.4 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠紅細(xì)胞膜能量代謝酶活性的影響 在雌性小鼠中，與正常組比較，模型組小鼠的紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，當(dāng)歸組小鼠的紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表4。

2.5 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠腸道菌群多樣性的影響 通過α多樣性分析顯示，模型組小鼠腸道微生物豐富度指數(shù)（Chao、ACE、Sobs指數(shù)）均明顯降低，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5。小鼠腸道菌群β多樣性分析顯示，在雌性小鼠中，可以觀察到正常對(duì)照組與模型組之間菌群輪廓可在一定程度上分離，群落結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），給予當(dāng)歸水提取物后對(duì)雌性小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度上的影響。見圖1。在雄性小鼠中，可以觀察到正常對(duì)照組與模型組之間菌群輪廓可在一定程度上分離，群落結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。可以觀察到正常組與模型組之間菌群輪廓差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5.2 當(dāng)歸水提取物對(duì)血虛證小鼠腸道微生物群落組成的影響 在雌性小鼠腸道菌群中豐度較高的菌群依次為Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Desulfobacterota（脫硫菌門）以及Patescibacteria（巴氏桿菌門），其中厚壁菌門具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在屬水平上，Lactobacillus（乳桿菌屬）豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他豐度較高的菌群依次為Muribaculaceae（Muri菌）、Enterorhabdus（腸桿菌屬）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）以及Alistipes（另枝菌屬）。見圖3。在雄性小鼠腸道菌群中豐度較高的菌群依次為Firmicutes、Bacteroidota、Actinobacteriota、Patescibacteria以及Desulfobacterota，其中厚壁菌門具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在屬水平上，豐度較高的菌群依次為Lachnospiraceae_NK4A136（毛螺菌科_NK4A136）、Muribaculaceae、unclassified_f__Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Lactobacillus（乳桿菌屬）、Alistipes等。見圖4。

2.5.3 豐度顯著差異分類單元篩選 雌性小鼠在門水平上，與正常組比較，模型組的Firmicutes、Bacteroidota、Actinobactota豐度下降;與模型組比較，當(dāng)歸組Bacteroidota豐度上升。在屬水平上，與正常組比較，模型組Lactobacillus、Muribaculaceae、Clostridia（梭狀芽孢桿菌屬）豐度有所下降，Alistipes豐度有所上升;與模型組比較，當(dāng)歸組Lactobacillus、Muribaculaceae、Alloprevotella（普雷沃菌屬）豐度有所上升。雄性小鼠在門水平上，與正常組比較，模型組小鼠Firmicutes、Bacteroidota、Desulfobacterota豐度上升，Actinobacteriota、Patescibacteria豐度下降;與模型組比較，當(dāng)歸組的Bacteroidota、Desulfobacterota、Actinobacteriota、Patescibacteria豐度上升，F(xiàn)irmicutes豐度下降。在屬水平上，與正常組比較，模型組中Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136、unclassified_f__Lachnospiraceae豐度上升，Lactobacillus、Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）豐度下降;與模型組比較，當(dāng)歸組Muribaculaceae、Lactobacillus、Desulfovibrio豐度上升，Lachnospiraceae、unclassified_f__Lachnospiraceae豐度下降。見圖5。

2.5.4 血虛證小鼠腸道微生物與外周血象相關(guān)性分析 鼠腸道微生物與外周血象相關(guān)性分析顯示，在雌性小鼠中RBC、HGB、HCT 3個(gè)指標(biāo)與小鼠腸道微生物群落之間相關(guān)性顯著，其中Dubosiella（杜氏乳桿菌屬）、Turicibacter與RBC、HGB、HCT顯著正相關(guān)（P<0.05或P<0.01），Lachnoclostridium（藍(lán)綠藻菌屬）豐度與RBC、HCT正相關(guān)（P<0.05或P<0.01），Gemella（孿生球菌屬）豐度與RBC、HGB、HCT負(fù)相關(guān)（P<0.05）。在雄性小鼠中，Clostridium innocuum（無害梭菌）、Bacteroides（桿菌屬）與RBC、HGB、HCT 3個(gè)指標(biāo)正相關(guān)（P<0.05或P<0.01），與WBC負(fù)相關(guān)（P<0.05）;Erysipelato-clostridium菌屬與HGB、HCT正相關(guān)（P<0.05），與WBC負(fù)相關(guān);Lachnospiraceae_NK4A136、Desulfovibrio與HGB、HCT負(fù)相關(guān)（P<0.05），與WBC正相關(guān)（P<0.05）。見圖6。

3 討論

血虛證是指血液虧虛不能濡養(yǎng)臟腑、經(jīng)絡(luò)、形體器官，以面、瞼、唇、舌色淡白，毛發(fā)不澤、頭昏、脈細(xì)、乏力等為特征的綜合性證候。血液虧虛的主要原因，一是血液生化或來源不足，如相關(guān)臟腑（脾胃、腎等）功能減退所致;二是血液耗損過多，可見于出血之后或因大病、久病而勞神太過暗耗陰血等[18-19]。血虛證的造模方法包括失血法[20]、溶血法[21]、輻射損傷法[22]、化學(xué)損傷法[23]等，本研究采取單純放血法制備血虛證小鼠模型，旨在更好地模血液耗損這一病因，使得模型與臨床癥候更為相似。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，造模后模型組小鼠體質(zhì)量、外周血RBC、HGB、MCV、RDW含量、胸腺指數(shù)以及紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性明顯下降，說明本實(shí)驗(yàn)所采用的單純放血法成功地模出了血虛證血液虧損、免疫力低下、血液缺乏濡養(yǎng)且來源不足的臨床癥狀[24]。在連續(xù)給藥35 d后，與模型組比較，當(dāng)歸組雌性小鼠外周血RBC、WBC及紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性顯著升高（P<0.05），胸腺指數(shù)也有上升趨勢(shì)，說明當(dāng)歸水提取物具有補(bǔ)血作用，可在一定程度上改善血虛證小鼠的血虛癥狀。

在腸道菌群的研究中，血虛證小鼠長期服用當(dāng)歸水提取物后，小鼠門水平腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中Bacteroidota豐度上升，F(xiàn)irmicutes豐度明顯下降，有研究表明Bacteroidota豐度下降，F(xiàn)irmicutes上升是肥胖發(fā)生的標(biāo)志之一[25]，說明當(dāng)歸水提取物可能通過調(diào)節(jié)血虛證小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)生影響。在屬水平上，以Lactobacillus、Muribaculaceae為代表的有益菌豐度顯著升高[26]，其中Muribaculaceae被認(rèn)為在機(jī)體能量代謝中發(fā)揮重要作用[27]。此外，通過小鼠外周血象指標(biāo)與腸道菌群的相關(guān)性分析可以得出，小鼠外周血象與腸道微生物結(jié)構(gòu)有著非常密切的聯(lián)系，中醫(yī)氣血理論與腸道微生物結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系仍需要深入研究。

綜上所述，當(dāng)歸水提取物具有補(bǔ)血作用，且對(duì)小鼠腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。

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（2022-03-10收稿 本文編輯：王明）