周 凱，時翠銷，宋國濱，黃 穎，徐元宏

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)因產(chǎn)綠膿素而舊稱綠膿桿菌，是一種無孢子、專性需氧、運(yùn)動和氧化酶陽性的革蘭陰性桿菌，被認(rèn)為是最重要的機(jī)會致病菌之一，極易在免疫功能低下患者體內(nèi)滋生[1]。研究[2]表明，PA可以分泌外毒素、彈性蛋白酶、胞外酶等多種毒力因子，在感染中起重要作用，同時對不同抗生素產(chǎn)生抵抗性也是毒力因子的一個屬性。而群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)是PA通過產(chǎn)生小的可擴(kuò)散分子來增加其毒力的機(jī)制，可以調(diào)節(jié)毒力和營養(yǎng)獲取相關(guān)的一系列基因[3],也會影響抗菌藥物的敏感性。且伴隨著當(dāng)前PA耐藥情況的加劇，新型藥物如毒力因子抑制劑、群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑的研發(fā)已成為治療PA的新方向。該研究著重分析了PA對11種臨床常用抗菌藥物的耐藥性，對PA常見的QS系統(tǒng)調(diào)控基因和毒力基因的攜帶、表達(dá)情況進(jìn)行檢測，分析兩者與耐藥的相關(guān)性，并驗證了QS系統(tǒng)與毒力基因之間的調(diào)控關(guān)系，為臨床更有效地治療PA感染提供思路與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科2020年6月—12月PA97株，其中呼吸系統(tǒng)來源的46株(痰液39株、纖支鏡灌洗液7株)，其他系統(tǒng)來源的51株(創(chuàng)面9株、分泌物15株、尿液15株、血液6株、導(dǎo)管3株、引流液2株、組織1株)，同一患者相同部位分離株已剔除。對照菌株為本實驗室保存的PA標(biāo)準(zhǔn)菌株；質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC8739、PAATCC27853，均來自本科室。

1.2 儀器和試劑哥倫比亞血平板 (合肥天達(dá)診斷試劑有限公司)；VITEK-MS質(zhì)譜儀、Vitek2-Compact微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)；藥敏紙片 (英國Oxoid公司)；Tap PCR Master Mix、擴(kuò)增引物、瓊脂糖、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR Master mix(上海生工生物工程股份有限公司)；LifeECO基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀cobas z 480(羅氏分子有限公司)。

1.3 菌株鑒定及藥物敏感性實驗選取菌株后在血平板上分區(qū)劃線接種培養(yǎng)，待長出菌落后用質(zhì)譜儀進(jìn)行重新鑒定。鑒定明確后應(yīng)用Vitek2-Compact儀進(jìn)行藥敏試驗，缺少的抗菌藥物用紙片擴(kuò)散(K-B)法補(bǔ)全，以2020年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)文件為參照進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀及統(tǒng)計。

1.4 QS系統(tǒng)調(diào)控基因及毒力基因檢測

1.4.1DNA模板的制備 將鑒定后的菌株再次進(jìn)行接種、孵育培養(yǎng)留取菌落，采用煮沸法獲取基因擴(kuò)增所需DNA模板，整個過程防止污染，避免影響后續(xù)操作及結(jié)果。

1.4.2基因擴(kuò)增及電泳 基因種類及PCR引物序列(表1)根據(jù)文獻(xiàn)[4-5]獲得，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成，目的基因擴(kuò)增總體系為25 μl, 熱循環(huán)參數(shù)：初始變性95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，53～69 ℃退火30 s，72 ℃、60 s，循環(huán)35個周期；最終72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物置于4 ℃待電泳。每株各取10 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并留存圖像。

表1 QS系統(tǒng)調(diào)控基因及毒力基因引物序列

1.4.3核苷酸序列測定與分析 將擴(kuò)增的陽性PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。將所測序列與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的基因序列作比對。

1.5 調(diào)控基因及毒力基因表達(dá)水平檢測根據(jù)電泳及測序結(jié)果篩選出基因型相同的28株P(guān)A(其中14株為多重耐藥PA(multidrug resistantPseudomonasaeruginosa，MDR-PA))于溫箱搖菌過夜，運(yùn)用TRIzol法提取RNA，檢測其濃度、純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。并對其中兩種調(diào)控基因(LasI、rh1R)，兩種毒力基因(exoS、PCN)進(jìn)行qRT-PCR檢測，qRT-PCR引物序列見表2。過程中以16S rRNA作為內(nèi)參基因，PA標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對照組。熒光定量完成后采用相對定量法2-ΔΔCt計算各菌株基因的表達(dá)水平。

表2 qRT-PCR調(diào)控基因及毒力基因引物

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，對調(diào)控基因及毒力基因與耐藥性的相關(guān)性分別應(yīng)用t檢驗、χ2檢驗進(jìn)行分析，利用線性相關(guān)系數(shù)分析調(diào)控基因LasI、rh1R與毒力基因exoS、PCN的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PA對11種常見抗菌藥物的耐藥率及分析97株P(guān)A對11種常見抗菌藥物的耐藥率最高的為亞胺培南25.77%，其次為氨曲南24.74%，最低為阿米卡星2.06%，見表3。其中43株為MDR-PA且多數(shù)對四種及以上抗菌藥物耐藥。根據(jù)標(biāo)本來源不同分為呼吸系統(tǒng)(痰、纖支鏡)來源和其他部位來源兩大類，呼吸系統(tǒng)來源的菌株對抗菌藥物的耐藥率相對更高，且對氨曲南、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表3 97株P(guān)A對11種抗菌藥物的藥敏結(jié)果[n(%)]

表4 不同來源PA對11種抗菌藥物耐藥性分析[n(%)]

2.2 QS系統(tǒng)調(diào)控基因及毒力基因檢測結(jié)果QS系統(tǒng)調(diào)控基因LasI、LasR、Rh1I、Rh1R均檢出且檢出率為100%；7種毒力基因也均被檢出，檢出率由高到低依次為exoT 98.97%(96/97),exoY 97.94%(95/97),ToxA 97.94%(95/97)，LasB 96.91%(94/97)，exoS 86.60%(84/97)，PCN 43.30% (42/97),exoU 13.40%(13/97)，PCR陽性條帶見圖1。

圖1 QS系統(tǒng)調(diào)控基因、毒力基因陽性條帶圖M：marker；1～11：LasR、LasI、rh1I、rh1R、exoS、exoT、exoY、exoU、lasB、PCN、ToxA基因陽性條帶

2.3 QS系統(tǒng)調(diào)控基因及毒力基因測序分析測得的基因序列與NCBI基因庫比對，一致率在98%以上。部分基因測序結(jié)果，見圖2～4。

圖2 LasR基因測序圖

圖3 exoU基因測序圖

圖4 PCN基因測序圖

2.4 毒力基因與耐藥性的關(guān)系攜帶不同毒力基因菌株的耐藥性有所不同，其中未攜帶毒力基因的菌株對頭孢他啶等6種抗菌藥物耐藥，攜帶有7種毒力基因的菌株對頭孢他啶耐藥；PCN、exoS、exoU陽性菌株中，非多重耐藥PA(non-multidrug resistantPseudomonasaeruginosa，NMDR-PA)所占比例更高；與PCN-菌株之相比，PCN+菌株對頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等藥物的耐藥率相對較高，且對哌拉西林/他唑巴坦的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；exoS+/exoU- 菌株對阿米卡星等大部分藥物較exoS-/exoU+菌株耐藥率相對更高，其中對頭孢他啶、妥布霉素、慶大霉素的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PCN-/exoS+/exoU-與PCN+/exoS+/exoU-之間的耐藥率也有所差異，其中PCN+/exoS+/exoU-對抗菌藥物的耐藥率更高，且對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、美洛培南耐藥率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 攜帶不同毒力基因的PA耐藥性分析[n(%)]

2.5 調(diào)控基因和毒力基因表達(dá)水平及分析調(diào)控基因LasI、rh1R在28株P(guān)A菌株中均有表達(dá)，表達(dá)水平見圖5，其中，與14株MDR-PA相比，NMDR-PA

圖5 28株P(guān)A調(diào)控基因rh1R、LasI表達(dá)水平

調(diào)控基因rh1R、LasI的相對表達(dá)量更高，且LasI的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 毒力基因exoS均有表達(dá)，而PCN表達(dá)不完全，隨機(jī)挑選15株四種基因全部表達(dá)的菌株，分別分析兩種調(diào)控基因與兩種毒力基因相對表達(dá)量的關(guān)系，調(diào)控基因rh1R與毒力基因exoS之間的表達(dá)呈正向線性關(guān)系(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)r=0.685 ；調(diào)控基因LasI與毒力基因PCN之間的表達(dá)呈正向線性關(guān)系(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)r=0.692。見圖6。

圖6 15株P(guān)A調(diào)控基因rh1R、LasI及毒力基因exoS、PCN的表達(dá)水平

3 討論

PA是院內(nèi)感染中最常見的病原菌之一,而且致病及耐藥機(jī)制復(fù)雜，對其防治是醫(yī)務(wù)工作中的巨大挑戰(zhàn)，因此對臨床標(biāo)本分離PA的研究具有重要價值。本文較國內(nèi)其他相關(guān)分析報道，擴(kuò)大了毒力因子范圍并加入了對QS系統(tǒng)調(diào)控基因及PA耐藥情況的監(jiān)測。本研究中97株P(guān)A的耐藥率與李國強(qiáng)[6]監(jiān)測的PA臨床重點藥物敏感率有所不同，其中對碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美洛培南)耐藥率較頭孢類藥物(頭孢他啶、頭孢吡肟)高，考慮可能是不同地區(qū)對PA的耐藥性產(chǎn)生影響。其中近1/2為MDR-PA，且多數(shù)對四種及以上抗菌藥物耐藥，因此，重視藥敏結(jié)果，選擇有效的藥物聯(lián)合來抑制或殺滅MDR-PA是臨床治療其感染的有效方案[7]。同時，該研究提示呼吸系統(tǒng)來源菌株的耐藥性相對更高，與全國細(xì)菌耐藥檢測網(wǎng)的結(jié)果[8]一致。

本研究選取了Lasl、LasR、Rhll、RhIR四種調(diào)控基因進(jìn)行檢測，且檢出率均為100%，說明調(diào)控基因在PA中是穩(wěn)定存在的，一般不會發(fā)生缺失。挑選兩種調(diào)控基因LasI、RhIR進(jìn)行表達(dá)量的檢測，結(jié)果顯示兩者在NMDR-PA中表達(dá)量相對更高，且LasI的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時結(jié)果顯示調(diào)控基因能正向調(diào)控毒力基因的表達(dá)，由此可以看出QS系統(tǒng)在PA耐藥及其毒力表達(dá)方面具有重要作用。目前已有研究[9]提出抑制QS系統(tǒng)作為治療PA的靶點，如近來Abbas et al[10]研究表明西格列汀作為一種新型的抗群體感應(yīng)藥物，可用于由PA造成感染的糖尿病或非糖尿病患者的預(yù)防和治療，所以在治療過程中應(yīng)注意必要時抗群體感應(yīng)藥物的使用。

該研究根據(jù)毒力基因檢出率及組合分析，未檢測到毒力基因的菌株對頭孢他啶等6種抗菌藥物耐藥，而含有7種毒力基因的菌株僅對頭孢他啶耐藥；前者耐藥性明顯高于后者，同時在PCN、exoS、exoU陽性菌株中，NMDR-PA所占比例更高，這與調(diào)控基因Rh1R、LasI在NMDR-PA中相對表達(dá)量更高較一致；因此推測PA可能存在高毒力低耐藥的現(xiàn)象。ToxA檢出率為97.94%，與相關(guān)報道[4]類似。lasB檢出率為96.91%，明顯高于內(nèi)蒙古地區(qū)[11]檢出率，這可能與菌株選擇或地區(qū)分布有關(guān)；因此應(yīng)重視對LasB的研究，探討本地區(qū)有高檢出率的原因，或許有利于對PA的監(jiān)測與治療。PCN檢出率為43.30%，其中PCN+菌株對哌拉西林/他唑巴坦耐藥率更高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而Dietrich et al[12]已研究表明綠膿菌素可以上調(diào)外排泵mexGHI-opmD基因的表達(dá)，而外排泵系統(tǒng)是PA重要的耐藥機(jī)制之一，同時有哌拉西林/他唑巴坦能夠?qū)A外排泵系統(tǒng)MexAB-OprM、MexXY-OprM影響的報道[13],因此進(jìn)行PCN陽性菌株對哌拉西林/他唑巴坦耐藥性研究有一定的價值。

同時有研究[14]表明PA致病的毒力因子主要來自Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)，分泌exoT、exoY、exoS和exoU四種細(xì)胞毒素，exoY、exoT在大多數(shù)菌株中都會表達(dá)，且毒性相對較弱；PA一般只表達(dá)exoS或exoU其中的一種，且絕大多數(shù)以exoS+/exoU-的形式存在[15]，本研究結(jié)果與之也較為一致。且本研究表明exoS+/exoU-相比于exoS-/exoU+對多數(shù)抗菌藥物的耐藥性更強(qiáng)，與張秀彩 等[16]的研究結(jié)果不同，推測可能由兩種毒力因子效應(yīng)不同引起；exoU毒性是exoS的100倍，因此exoS+/exoU-可以讓宿主細(xì)胞維持更長的存活時間，讓其獲得更多接觸抗菌藥物的時間與機(jī)會，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。這也與前文推測的高毒力低耐藥現(xiàn)象相吻合。同時，本研究將PCN聯(lián)合exoS、exoU進(jìn)行分析，與單獨分析兩者時的結(jié)果相比，PA耐藥率發(fā)生改變且有統(tǒng)計學(xué)意義的藥物數(shù)量增加；說明各系統(tǒng)間不是彼此獨立的，而是一個相互影響的整體，這也提示對PA的探索研究應(yīng)努力做到全面細(xì)致。