邵明琨，侯夢(mèng)瑤，羅丹丹，祁文瑾

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的下生殖道感染性疾病。復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)是指1年內(nèi)有癥狀并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)的VVC發(fā)作4次或以上[1]。據(jù)全球調(diào)查，75%婦女一生中至少患過1次VVC，40%～50%的女性會(huì)反復(fù)感染，5%～8%的女性會(huì)患RVVC[2]。其中，致病菌的菌種、基因型、耐藥性、分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartate protease，Sap)和磷酯酶(phospholipase，Plb)在侵襲機(jī)制中起著重要作用[3]。陰道局部的Th細(xì)胞及其炎癥免疫因子也參與了疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。

目前尚無研究對(duì)VVC和RVVC致病菌株侵襲力進(jìn)行分析。該研究比較了VVC和RVVC致病菌株侵襲力的差異性；選取Sap活性有差異的白假絲酵母菌和人陰道上皮細(xì)胞共培養(yǎng),分析陰道上皮分泌細(xì)胞因子的情況；為VVC和RVVC的發(fā)病機(jī)制研究及臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料所有致病白假絲酵母菌均來自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診VVC、RVVC患者，收集時(shí)間為2018年9月—2019年3月。VVC、RVVC診斷標(biāo)準(zhǔn)以《婦產(chǎn)科學(xué)》(人民衛(wèi)生出版社，第九版)為依據(jù)。排除：妊娠期、哺乳期、患糖尿病、口服避孕藥、3個(gè)月內(nèi)接受過全身抗真菌治療或1個(gè)月內(nèi)接受過外用抗真菌藥物治療、患免疫性疾病或正在服用免疫抑制劑、混合陰道感染者。人陰道上皮組織取自在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院因“子宮肌瘤或子宮腺肌癥”行子宮全切術(shù)的患者，取切下的陰道組織約1 cm×1 cm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)取得患者知情同意、通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基(法國(guó)梅里埃公司)；念珠菌顯色平板(上海安圖生物公司)；角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM，美國(guó)Gibco公司)；中性蛋白酶(DispaseⅡ，美國(guó)Sigma公司)；無菌脫脂奶粉(上海生工公司)；50%卵黃乳液(青島海博生物公司)；人白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、 IL-8、IL-17 ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技公司)；酵母基因組DNA提取試劑盒(Yeast DNA Kit，離心柱型，北京天根科技公司)；PCR Mix(北京天根科技公司)；氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LU)標(biāo)準(zhǔn)粉、兩性霉素(amphotericin，AMB)標(biāo)準(zhǔn)粉、伊曲康唑(itraconazole，ITR)標(biāo)準(zhǔn)粉(北京中國(guó)食品藥品檢定研究所)；Alamar Blue(英國(guó)Bio-rad有限公司)

1.2 假絲酵母菌純化、菌種鑒定假絲酵母菌純化：用無菌棉拭子將VVC/RVVC患者陰道分泌物接種到沙堡羅培養(yǎng)皿上，再用四區(qū)劃線法分離單菌落。菌種鑒定：嚴(yán)格按照安圖念珠菌顯色平板說明書進(jìn)行鑒定。選取白假絲酵母菌進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

1.3 白假絲酵母菌的基因分型、藥敏實(shí)驗(yàn)及Sap、Plb活性檢測(cè)使用25S rDNA-PCR法對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型[5]。標(biāo)準(zhǔn)株為白假絲酵母菌ATCC90028，購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞典藏中心。

參照CLSI推薦的M27-A3方案中適用于酵母菌的微量稀釋法,對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行FLU、ITR、AMB的體外藥敏實(shí)驗(yàn)。使用Alamar Blue顯色劑來幫助判讀結(jié)果。Alamar Blue保持藍(lán)色表示真菌生長(zhǎng)受抑制,變?yōu)榧t色表示真菌生長(zhǎng)無抑制。根據(jù)CLSI建立的M27-A3中的MIC折點(diǎn)值,將所有菌株分為敏感、非敏感菌株。

用牛奶培養(yǎng)基和蛋黃培養(yǎng)基對(duì)鑒定出的白假絲酵母菌行Sap、Plb活性測(cè)定。以PA值表示Sap活性，PA =菌落直徑/總直徑(菌落直徑+透明圈)。用PZ值表示Plb活性，PZ=菌落直徑/總直徑(菌落直徑+沉淀圈)。PA或PZ值愈低，菌株的天冬氨酰蛋白酶或Plb的活性愈強(qiáng)[6]。

1.4 人陰道上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定人陰道上皮組織來自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，置于40 ml HANK′S液(3%雙抗)，低溫轉(zhuǎn)運(yùn)。組織用含3%雙抗的0.9%氯化鈉溶液洗滌3次(每次10 ml，1 000 r/min離心3 min)，無菌條件下在10 cm皿中剔除壞死組織,于DispaseⅡ中4 ℃過夜消化，第2天將分離出的陰道上皮組織在含15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中剪碎，PBS洗滌2次。加入兩倍體積的胰酶，37 ℃消化3 min，吸取消化液，用等體積的含血清的培養(yǎng)基中和，混勻消化后的細(xì)胞用70 μm的濾膜過濾，PBS洗滌2次。細(xì)胞用K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

人陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)至第2代，將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中待細(xì)胞培養(yǎng)至70%，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，按照角蛋白質(zhì)(廣譜)抗體試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞鑒定：采用免疫化學(xué)染色SP法，一抗為角蛋白質(zhì)(廣譜)抗體，按照1 ∶100稀釋，二抗采用通用二抗進(jìn)行孵育，采用DAB進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染后封片，顯微鏡200倍下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)后細(xì)胞因子測(cè)定按1×106個(gè)/ml濃度將細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細(xì)胞數(shù)達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代，第3代細(xì)胞貼壁數(shù)目達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。從VVC致病白假絲酵母菌中選取Sap活性最弱(Sap弱組)和最強(qiáng)(Sap強(qiáng)組)的菌株各4株，Sap強(qiáng)組Sap活性(PA值)分別為0.247 9、0.242 2、0.272 9和0.278 7，Sap弱組Sap活性(PA值)分別為0.731 4、0.688 3、0.665 5和0.597 4，分別用K-SFM培養(yǎng)液配置菌液濃度為1×106CFU/ml。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)以不加白假絲酵母菌的人陰道上皮細(xì)胞為對(duì)照組。分別在共培養(yǎng)后6、12、24、48 h收取上清液，使用ELISA方法測(cè)定IL-4、IL-8、IL-17表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 假絲酵母菌純化、菌種鑒定結(jié)果收集VVC菌株100株，RVVC菌株92株。VVC菌株中，白假絲酵母菌有95株，非白假絲酵母菌5株。RVVC菌株中，白假絲酵母菌有86株，非白假絲酵母菌有6株。無論VVC還是RVVC組，白假絲酵母菌所占比例均最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 白假絲酵母菌基因分型、藥敏實(shí)驗(yàn)及Sap、Plb活性結(jié)果基因分型：實(shí)驗(yàn)對(duì)95株VVC白假絲酵母菌株及86株RVVC白假絲酵母菌株進(jìn)行基因分型，根據(jù)條帶位置及數(shù)量可將致病白假絲酵母菌分為A、B、C 3型：僅有450 bp片段者為A型，僅有840 bp片段者為B型，兩條片段均有為C型(圖1A)。研究提示，A基因型在VVC和RVVC菌株中所占比例都最高，且VVC致病菌株及RVVC致病菌株的基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

藥敏實(shí)驗(yàn)：比較VVC和RVVC兩組白假絲酵母菌的48 h FLU、AMB及ITB藥敏性，分析敏感、非敏感菌株比例后顯示：FLU、AMB及ITB敏感菌株在VVC組和RVVC組中所占比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1D和表1)。

Sap活性及Plb活性檢測(cè)：對(duì)VVC及RVVC白假絲酵母菌株進(jìn)行Sap、Plb活性測(cè)定(圖1B、C)。VVC組菌株的Sap活性高于RVVC組(P<0.05)，但兩組菌株的Plb酶活性無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖1 白假絲酵母菌基因分型、藥敏實(shí)驗(yàn)及Sap、Plb活性A：白假絲酵母菌基因分型結(jié)果；B：牛奶培養(yǎng)基中檢測(cè)Sap活性；黑圈：真菌生長(zhǎng)區(qū)域；紅色外圈：Sap酶活性陽(yáng)性區(qū)域；C：蛋黃培養(yǎng)基中檢測(cè)Plb活性；黑圈：真菌生長(zhǎng)區(qū)域；紅色外圈：Plb活性陽(yáng)性區(qū)域；D：體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果；陰性對(duì)照：全部保持藍(lán)色不變；陽(yáng)性對(duì)照：全部變?yōu)榧t色

表1 VVC與RVVC菌株基因型、藥敏及Sap、Plb活性差異(株，n)

2.3 陰道上皮細(xì)胞培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞在分離后的第0～3代都呈鋪路石樣生長(zhǎng)，形態(tài)為多角形，輪廓清晰，折光性好。使用細(xì)胞角蛋白(廣譜)抗體(免疫組化)試劑盒檢測(cè)第2代陰道上皮細(xì)胞，陰道上皮細(xì)胞陽(yáng)性比率為100%。見圖2。

圖2 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及免疫組化染色 ×200A1～A4：人陰道上皮細(xì)胞分離后第0～3代；B：人陰道上皮細(xì)胞免疫組化鑒定

2.4 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果陰道上皮細(xì)胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)后細(xì)胞上清液采用ELISA方法檢測(cè)IL-4、IL-8、IL-17。人陰道上皮細(xì)胞能分泌IL-4、IL-8、IL-17。感染白假絲酵母菌后，陰道上皮細(xì)胞能分泌更多的IL-4,且在感染第12小時(shí)達(dá)到峰值，而后逐漸降低。相比Sap弱組，Sap強(qiáng)組陰道上皮細(xì)胞IL-4的表達(dá)量在感染6、12 h更高(P<0.05)(表2)。感染白假絲酵母菌后，陰道上皮細(xì)胞能分泌更高的IL-8，且在感染第6小時(shí)就達(dá)到峰值，而后保持相同水平。相比Sap弱組，Sap強(qiáng)組的分泌量更多(P<0.05)(表3)。陰道上皮細(xì)胞在感染白假絲酵母菌后分泌的IL-17也更高。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的IL-17在感染第6小時(shí)就達(dá)峰值，而后逐漸降低。相比Sap弱組，Sap強(qiáng)組IL-17的分泌量更高(P<0.05)(表4)。

表2 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-4分泌的情況

表3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-8分泌的情況

表4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-17分泌的情況

3 討論

VVC和RVVC的發(fā)病機(jī)制包括菌株的侵襲性和局部宿主免疫兩個(gè)方面。白假絲酵母菌是VVC或者RVVC中主要的致病菌[7]，通過表達(dá)多種毒力因子幫助其入侵以及在宿主體內(nèi)定植，包括形態(tài)變化(酵母相-菌絲相的轉(zhuǎn)變)、表型轉(zhuǎn)換(白菌-灰菌的轉(zhuǎn)換)、耐藥性、基因型及分泌型毒力因子等[8]。本研究比較了VVC和RVVC致病菌株侵襲力的差異性，結(jié)果顯示，除外Sap活性，VVC和RVVC致病菌的菌種、25S rDNA-PCR基因分型、Plb活性、藥物敏感性均無差異。癥狀重、難治療的RVVC致病菌株的Sap活性反而比VVC致病菌株的更低。這些結(jié)果提示，相較于白假絲酵母菌的侵襲力，陰道宿主的免疫反應(yīng)可能才是VVC、RVVC發(fā)生的主要因素。這與Jabra-Rizk et al[9]的研究近似：白假絲酵母菌侵襲宿主后，疾病的傳播主要由宿主免疫系統(tǒng)介導(dǎo)。本研究中RVVC致病菌株Sap弱的原因估計(jì)也跟宿主免疫反應(yīng)有關(guān)。

Sap具有較高的蛋白水解酶活性，能降解黏膜表面的各種保護(hù)分子，為白假絲酵母菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)黏附和侵襲能力；它還可以切斷宿主的天然免疫應(yīng)答因子，在白假絲酵母菌的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[10]。此外，Sap還能在體內(nèi)誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子，如IL-1β和IL-18，而IL-1β激活的CD4T細(xì)胞能在VVC和RVVC發(fā)病機(jī)制中起重要作用[11]。本實(shí)驗(yàn)探討了人陰道上皮細(xì)胞分泌IL-4、IL-8、IL-17的情況。IL-4是Th2細(xì)胞的代表性細(xì)胞因子，其主要作用是誘發(fā)過敏反應(yīng)，增加對(duì)感染的易感性[12]。Th1細(xì)胞能激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬和殺菌，起到免疫保護(hù)作用。近年來，Th1的保護(hù)作用逐步被Th17取代[13]。IL-17作為Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，能動(dòng)員感染部位的中性粒細(xì)胞，維持黏膜上皮的完整性，促進(jìn)抗菌肽β-防御素的釋放，預(yù)防白念珠菌感染[14]。中性粒細(xì)胞對(duì)于宿主抵御侵襲性真菌疾病至關(guān)重要。IL-8是中性粒細(xì)胞趨化因子，本研究中以IL-8反映中性粒細(xì)胞的募集情況。

本研究顯示，人陰道上皮細(xì)胞具有分泌IL-4、IL-8、IL-17的能力，在受到白假絲酵母菌感染后，陰道上皮分泌的IL-4、IL-8、IL-17明顯升高。無論Sap強(qiáng)組還是Sap弱組，3種細(xì)胞因子的含量在感染早期就達(dá)到高峰，保護(hù)性因子IL-8和IL-17分泌的時(shí)間則更早，在感染后第6小時(shí)就達(dá)到高峰。隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，IL-4和IL-17出現(xiàn)了逐漸降低趨勢(shì)，而IL-8維持在相同水平。表明陰道上皮細(xì)胞在受到白假絲酵母菌侵襲時(shí)，宿主免疫能在短時(shí)間內(nèi)被激活，而且保護(hù)性因子出現(xiàn)的時(shí)間更早、維持時(shí)間更長(zhǎng)。課題組推測(cè)，陰道內(nèi)的免疫因子可能會(huì)影響白假絲酵母菌的Sap活性，而且也是臨床中只有部分VVC患者發(fā)展為RVVC的原因之一。但是，體外實(shí)驗(yàn)存在各種限制，如細(xì)胞死亡等，今后可以使用動(dòng)物模型進(jìn)行深入研究。

本研究還顯示Sap活性高的白假絲酵母菌刺激陰道上皮產(chǎn)生的細(xì)胞因子更高，證實(shí)了Sap有誘發(fā)宿主免疫的作用，而且這種作用與Sap的高低呈正比。實(shí)驗(yàn)引起一個(gè)假想：Sap高的白假絲酵母菌雖然侵襲力強(qiáng)，但是誘發(fā)的宿主免疫也強(qiáng)，因此更容易被宿主殺滅，從而不易復(fù)發(fā)。這個(gè)假想需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來確定。