王 震，張香路，李 陽(yáng)，阮銘暄，黃 斐

目前脊髓損傷的治療仍然面臨著很大的挑戰(zhàn)，主要原因是脊髓損傷內(nèi)部的神經(jīng)干細(xì)胞分化效率低[1]，神經(jīng)生長(zhǎng)因子的缺乏以及損傷部位產(chǎn)生炎癥的微環(huán)境[2-3]。組織工程技術(shù)將神經(jīng)干細(xì)胞支架與藥物或生長(zhǎng)因子結(jié)合來(lái)克服這些問(wèn)題。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)因具有非免疫原性，良好的生物相容性[4]，而廣泛用作脊髓損傷修復(fù)的生物材料。但HA降解速度過(guò)快，不支持細(xì)胞黏附[5-6]，因此需對(duì)HA進(jìn)行改良，用己二酸二酰肼(adipic dihydrazide，ADH)對(duì)HA修飾，然后與葡聚糖(dextran，Dex)接枝。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是脊髓損傷實(shí)驗(yàn)中最常用的生長(zhǎng)因子，它可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元[7]，然而，BDNF半衰期短，很難保持長(zhǎng)期的活性[8]。聚乳酸乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]作為受控細(xì)胞因子的釋放載體，能有效維持細(xì)胞因子的活性，延長(zhǎng)其作用時(shí)間[9]。該研究制備了改良HA水凝膠控釋BDNF的微環(huán)境，首先，將BNDF包覆在PLGA微球中制備BDNF-PLGA微球，然后用改良的HA與微球進(jìn)行混合，形成BDNF-PLGA/Dex-HA微環(huán)境，最后探討大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(rat fetal neural stem cells, rFNSCs)與BDNF-PLGA/Dex-HA微環(huán)境共培養(yǎng)對(duì)rFNSCs的生長(zhǎng)、分化及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組孕14 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠3只，清潔級(jí)，300～320 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)以大鼠胚胎干細(xì)胞為研究對(duì)象，將實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組為rFNSCs與PLGA和HA共培養(yǎng)；條件對(duì)照組為rFNSCs與BDNF-PLGA和HA共培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組為rFNSCs與BDNF-PLGA和改良的透明質(zhì)酸水凝膠即Dex-HA共培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器HA鈉鹽(分子量：1.5～2.0 Mu，化妝品級(jí)，≥99.5%)購(gòu)自山東福瑞達(dá)生物科技有限公司；除非另有說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)中使用的BDNF和高碘酸鈉(NaIO4，≥99%)和氯化鐵六水合物(FeCl3·6H2O，≥98%)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、B27和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)(美國(guó)Pepro-Tech公司)；巢蛋白(Nestin)多克隆抗體、羊抗兔 Alexa fluor 488(英國(guó)Abcam公司)；βⅢ微管蛋白(βⅢ-tubulin)單克隆抗體、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(GFAP)多克隆抗體和少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(CNPase)單克隆抗體(美國(guó)Chemicon公司)；驢抗兔Alexa fluor 594(美國(guó)Sigma-Aldric公司)；大鼠ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8)(日本同仁化學(xué)研究所)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermofisher公司)；倒置熒光顯微鏡、BX-51免疫熒光顯微鏡(日本Olympus Corporation公司)。

1.3 BDNF-PLGA微球的合成將200 mg PLGA(75/25，分子量：4～15 ku)溶解在2 ml的二氯甲烷中，10 μg的BDNF溶于1 ml牛血清白蛋白，將兩種溶液混合。然后，將10 ml聚乙烯醇(PVA，1%)緩慢加入到混合物中超聲混勻，加入80 ml PVA(0.3%)，攪拌12 h以去除二氯甲烷。最終的乳狀液用蒸餾水洗滌，離心，冷凍干燥，得到負(fù)載BDNF的PLGA微球。

1.4 氧化葡聚糖(ODex)的產(chǎn)生和HA-ADH的合成ODex的產(chǎn)生：將1 g Dex溶于20 ml蒸餾水中，加入2 ml NaIO4(100 mg/ml)，于室溫避光攪拌反應(yīng)12 h。然后加入乙二醇終止反應(yīng)。將所得溶液用纖維素管(截留分子量為7～12 ku)在去離子水中透析3 d，之后冷凍干燥處理。

HA-ADH的合成：將100 mg HA溶解于25 ml蒸餾水中，再加入8倍量的ADH，磁力攪拌4 h。將100 mg EDC和132 mg HoBt溶解在2 ml的50%DMSO溶液中，形成羧基活性基團(tuán)，后用酰肼基團(tuán)對(duì)HA進(jìn)行修飾，調(diào)節(jié)HA-NHNH2溶液的pH至6.8持續(xù)反應(yīng)4 h，將pH調(diào)至7.0完成反應(yīng)。最后在100 mmol/L NaCl、25%EtOH/H2O和去離子水中透析3 d，-50 ℃條件下冷凍干燥，獲得凍干的HA-ADH粉。

1.5 構(gòu)建BDNF-PLGA/Dex-HA及BDNF-PLGA/HA水凝膠將20 mg BDNF-PLGA微球加入1 ml 2%HA-ADH和0.5 ml 6%ODex混合溶液中，輕輕攪拌混合物，以24孔板作為圓柱形模具，制成BDNF-PLGA/Dex-HA水凝膠微環(huán)境。同樣的辦法構(gòu)建BDNF-PLGA/HA水凝膠。

1.6 rFNSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定rFNSCs的分離：將Sprague-Dawley(SD)大鼠用10%水合氯醛麻醉后，無(wú)菌條件下取出大鼠大腦皮質(zhì)放入預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液中，用剪刀將組織塊剪成1 mm3大小，收集于離心管中，D-Hank’s液清洗2次。然后加入0.25%的trypsin-EDTA和DNAase 100 μl于37 ℃下消化10 min，加入胎牛血清終止消化，并用吸管反復(fù)吹打，然后通過(guò)200目濾網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，將懸液在1 000 r/min離心5 min，獲得rFNSCs后進(jìn)行原代及繼代培養(yǎng)。

rFNSCs培養(yǎng)：將分離的rFNSCs接種在低吸附培養(yǎng)皿上，加入含有2% B27、 20 ng/ml EGF和b-FGF的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d以上，傳代3～4次后，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

rFNSCs鑒定：將神經(jīng)球放置在涂有0.1%多聚賴氨酸和Nestin(神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物)的玻片上，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法進(jìn)行rFNSCs的鑒定。體外分化時(shí)，加入DMEM/F12與2% B27的分化培養(yǎng)基分化3 d，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定神經(jīng)元。

1.7 水凝膠中BDNF的釋放用ELISA法測(cè)定BDNF的釋放量。將rFNSCs接種于BDNF-PLGA/Dex-HA水凝膠支架中作為實(shí)驗(yàn)組，將100 ml BDNF-PLGA/Dex-HA水凝膠加入到10 ml無(wú)菌PBS中，按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。在每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)(1～14 d)每天收集樣本的上清液，計(jì)算累積釋放率。將rFNSCs接種于BDNF-PLGA/HA水凝膠支架中作為條件對(duì)照組，并在相同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)BDNF濃度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的3個(gè)數(shù)值求平均值。

1.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將三組的水凝膠放在超凈工作臺(tái)中，紫外滅菌過(guò)夜。取96孔板，分別加入空白對(duì)照組、條件對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的水凝膠50 μl至96孔板中，將rFNSCs細(xì)胞按1×105個(gè)/ml的密度接種于96孔板中。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、7 d后，將CCK-8試劑按照10 μl/孔加入到培養(yǎng)板中并在37 ℃、5%CO2條件下孵育4 h。酶標(biāo)儀測(cè)量孔板中的溶液在450 nm處的吸光度(A)值。

1.9 Live/Dead實(shí)驗(yàn)采用Live/Dead實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同水凝膠中rFNSCs的活力。首先將每組的凝膠樣品分別放置于培養(yǎng)板底部，然后將1×103個(gè)rFNSCs種植于凝膠上，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h，用2 μmol/L Calcein-AM和4 μmol/L EthD-1于黑暗環(huán)境中常溫下染色30 min，然后PBS洗滌2次，在共聚焦顯微鏡下觀察各組凝膠接觸的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。

1.10 水凝膠對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能的影響為探討rFNSCs在三組水凝膠中的分化程度，將在三組水凝膠中培養(yǎng)7 d的rFNSCs用4%甲醛室溫固定30 min，再用含0.1%Triton X-100的PBS中滲透15 min，在含1%BSA室溫封閉2 h。加入一抗rFNSCs標(biāo)志物Nestin抗體(1 ∶250)、神經(jīng)元標(biāo)志物βⅢ-tubulin抗體(1 ∶100)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP抗體(1 ∶400)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CNPase(1 ∶200)，于4 ℃孵育過(guò)夜。樣品用PBS洗滌3次后，分別用二抗山羊抗鼠IgG偶聯(lián)Alexa-Fluor488(1 ∶500)和驢抗兔IgG(1 ∶800)偶聯(lián)Alexa-Fluor594(1 ∶500)二抗室溫避光孵育2 h后，用DAPI染色細(xì)胞核后，用共聚焦顯微鏡采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠中BDNF的釋放水凝膠中BDNF的釋放如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組改良的水凝膠與條件對(duì)照組水凝膠有相似的14 d控釋和持續(xù)釋放的特性，這兩種水凝膠的BDNF釋放曲線可分為三個(gè)階段。實(shí)驗(yàn)組水凝膠中的BDNF釋放曲線在前6 d呈線性緩釋，釋放率達(dá)到20.07%。第7～12天，樣品的釋放速率均勻增加，第12天樣品中BDNF的累積釋放率達(dá)到86.97%。在第13天與第14天，BDNF的積累釋放速率平均為88.52%和88.57%，趨于平穩(wěn)。至于條件對(duì)照組水凝膠，BDNF在前4 d相對(duì)穩(wěn)定，第5～11天，BDNF的釋放率增加，第11天BDNF的釋放率達(dá)到85.31%，第12～14天，BDNF的積累釋放量達(dá)到平衡。

2.2 rFNSCs的鑒定在圖2A中，大多數(shù)分離的細(xì)胞主要以神經(jīng)球的形式生長(zhǎng)，其形態(tài)符合rFNSCs鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示神經(jīng)球?qū)estin呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖2B)，因此懸浮神經(jīng)球可以認(rèn)為是rFNSCs。

2.3 rFNSCs與水凝膠共培養(yǎng)將rFNSCs按1×105/ml接種入三組的水凝膠上共培養(yǎng)。如圖3，培養(yǎng)3 d后在掃描電鏡下觀察rFNSCs的微觀形態(tài)，可見實(shí)驗(yàn)組水凝膠中rFNSCs相對(duì)于空白對(duì)照組和條件對(duì)照組中rFNSCs增殖較多，且rFNSCs在水凝膠中細(xì)胞維持了良好的形態(tài)，提示rFNSCs與水凝膠具有良好的相容性。

圖3 rFNSCs在不同環(huán)境中的培養(yǎng) A：rFNSCs與空白對(duì)照組水凝膠培養(yǎng)3 d；B:rFNSCs與條件對(duì)照組水凝膠共培養(yǎng)3 d；C:rFNSCs與實(shí)驗(yàn)組水凝膠共培養(yǎng)3 d；1：×200；2：×1 000

2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為了評(píng)價(jià)改良的HA水凝膠形成微環(huán)境能否支持rFNSC的生長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)的第1、3、7天用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果如圖4所示，在相同的培養(yǎng)時(shí)間條件下， 實(shí)驗(yàn)組第3天的細(xì)胞增殖活性高于空白對(duì)照組(F=4.282,P<0.05)，第7天時(shí)， 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性高于空白對(duì)照組和條件對(duì)照組(F=15.240,P<0.05)，且條件對(duì)照組也高于空白對(duì)照組(P<0.05)，表明實(shí)驗(yàn)組改良的HA水凝膠對(duì)rFNSC細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

圖4 CCK-8法檢測(cè)不同培養(yǎng)組中rFNSCs的增殖活性與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與條件對(duì)照組比較：#P<0.05

2.5 細(xì)胞活力分析不同組的細(xì)胞活性在第3天用Live/Dead實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估,其中活細(xì)胞染成綠色，死細(xì)胞染成紅色。共聚焦結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯降低，且實(shí)驗(yàn)組死亡數(shù)目最少(圖5C)。由此可見，實(shí)驗(yàn)組水凝膠可以降低rFNSCs的凋亡。

圖5 不同培養(yǎng)環(huán)境中rFNSCs細(xì)胞的活/死熒光染色 ×200A：rFNSCs與空白對(duì)照組水凝膠培養(yǎng)3 d；B:rFNSCs與條件對(duì)照組水凝膠共培養(yǎng)3 d；C:rFNSCs與實(shí)驗(yàn)組水凝膠共培養(yǎng)3 d

2.6 rFNSCs在水凝膠中的的分化情況通過(guò)免疫組織化學(xué)研究制備改良HA水凝膠控釋BDNF對(duì)rFNSCs分化的影響，并統(tǒng)計(jì)其中各種細(xì)胞所占比例。其中，神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞類型細(xì)胞數(shù)目分別通過(guò)神經(jīng)元特異性蛋白βⅢ-tubulin、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白CNPase和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)目來(lái)評(píng)估。與空白對(duì)照組及條件對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組βⅢ-tubulin陽(yáng)性率升高(F=30.418,P<0.05)、GFAP陽(yáng)性率降低(F=28.381,P<0.05)，且條件對(duì)照組較空白對(duì)照組GFAP陽(yáng)性率降低(P<0.05)。三組CNPase陽(yáng)性率變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見圖6、7。由此可見，實(shí)驗(yàn)組改良HA水凝膠控釋BDNF可以提高rFNSCs向神經(jīng)元的分化，降低向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，對(duì)于向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化效果無(wú)明顯差異。

圖6 不同環(huán)境中rFNSCs分化的共聚焦顯微鏡圖像 ×400

3 討論

由于脊髓損傷區(qū)域周圍不利的微環(huán)境，空洞和纖維膠質(zhì)瘢痕的形成，神經(jīng)系統(tǒng)中分化成熟神經(jīng)元自我修復(fù)能力的缺乏，以及缺乏合適的生長(zhǎng)刺激因子，導(dǎo)致脊髓損傷的有效治療非常有限[10]。目前，針對(duì)脊髓損傷后功能恢復(fù)的方法有干細(xì)胞移植、生物材料及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的植入，但研究[11]表明，單純的干細(xì)胞、單純的生物材料及單純的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子移植并不能使脊髓損傷后神經(jīng)元恢復(fù)，但是由于干細(xì)胞具有多向分化潛能[12]，組織工程支架可以為其提供支持，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子則可以促進(jìn)干細(xì)胞的分化，因此三者聯(lián)合起來(lái)移植便成為了研究的熱點(diǎn)。

相關(guān)研究[13]表明HA經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾及與Dex接枝可以降低HA的降解速度，提高其機(jī)械性能及增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的黏附性能，為細(xì)胞提供了適宜細(xì)胞黏附及生長(zhǎng)的微環(huán)境。

圖7 不同組中rFNSCs分化的百分比與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與條件對(duì)照組比較： #P<0.05

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以提高神經(jīng)元的存活率，促進(jìn)軸突再生。BDNF是脊髓損傷實(shí)驗(yàn)中最常用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。研究[14]表明，外源性的BDNF可以促進(jìn)損傷部位軸突的再生，髓鞘的形成，以及誘導(dǎo)損傷部位神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。PLGA作為受控的細(xì)胞因子釋放載體，能有效維持細(xì)胞因子的活性。本研究中將改良的HA(Dex-HA)與控釋BDNF的微球結(jié)合，BDNF在水凝膠釋放結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)釋放率在開始階段和中期階段略低于條件對(duì)照組的，這是由于從PLGA微球中釋放BDNF后，BDNF從水凝膠基質(zhì)中向外釋放。由于實(shí)驗(yàn)組的Dex-HA相對(duì)于條件對(duì)照組的HA更穩(wěn)定，不易被水解，所以實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于條件對(duì)照組在前中期累計(jì)釋放率低，后期累計(jì)釋放率高。且實(shí)驗(yàn)組中BDNF的釋放，在前中期階段快速釋放，在后期的階段緩慢釋放，可以有效保護(hù)細(xì)胞因子的生物活性，這種釋放方式為神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化形成局部有效濃度。將rFNSCs接種到三組水凝膠共培養(yǎng)3 d后在掃描電鏡下觀察rFNSCs的微觀形態(tài)，可見實(shí)驗(yàn)中rFNSCs相對(duì)于空白對(duì)照組和條件對(duì)照組中rFNSCs增殖較多，主要原因是實(shí)驗(yàn)組水凝膠相對(duì)穩(wěn)定且利于細(xì)胞黏附，可以給rFNSCs提供一個(gè)良好的生長(zhǎng)微環(huán)境。同時(shí)可以看到rFNSCs在水凝膠中細(xì)胞維持了良好的形態(tài)，與水凝膠具有良好的相容性。在CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組與條件對(duì)照組吸光度增加(P<0.05)，表明本研究所制備的BDNF-PLGA/Dex-HA中rFNSCs的活性要高于在BDNF/HA水凝膠和BDNF-PLGA/HA水凝膠中的。Live/Dead實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組及條件對(duì)照組可以減少rFNSCs凋亡，提高其活力，主要原因是Dex-HA相對(duì)于HA的降解速度減緩了，機(jī)械性能及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的黏附性能增加了，為rFNSCs提供了穩(wěn)定的適宜生長(zhǎng)的微環(huán)境。在免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組和條件對(duì)照組能提高rFNSCs分化成神經(jīng)元的比例，減少rFNSCs分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例。

綜上所述，改良的HA水凝膠的多孔結(jié)構(gòu)為rFNSCs的生長(zhǎng)、增殖及細(xì)胞黏附提供了良好的三維微環(huán)境，且其控釋BDNF可以促進(jìn)rFNSCs向神經(jīng)元的分化，減少了向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，解決了脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)元缺乏及膠質(zhì)瘢痕形成的問(wèn)題。該研究為后期相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。