李雷，張晨嵩，潘成武，杜軍，陳玉忠，馬家馳

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科綜合病區(qū)，安徽 蚌埠 233004）

結(jié)腸癌為世界上第四大最常見的癌癥［1］，其中炎癥參與了結(jié)腸癌進(jìn)展的整個過程［2］。白細(xì)胞介素1（IL-1）信號傳導(dǎo)是炎癥性疾病調(diào)控的關(guān)鍵因素，并且是腫瘤生長、侵襲、血管生成和腫瘤與宿主相互作用的關(guān)鍵途徑［3］。IL-1 受體包括IL1R1 和IL1R2。IL1R1 參與外源IL-1 的 信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)；而IL1R2 是誘餌受體，缺乏胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域并阻斷IL-1信號傳導(dǎo)［4］。因此，IL1R2與IL-1受體拮抗劑相似，可作為IL-1 信號的負(fù)調(diào)節(jié)劑［5］。血管生成是許多生理和病理過程所需的基本過程，其受促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡調(diào)節(jié)［6］。血管生成是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，原發(fā)腫瘤的擴(kuò)展和轉(zhuǎn)移到其他器官的轉(zhuǎn)移都顯著依賴［7］。許多因素在血管生成中起著重要作用，例如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGF 受 體2 （VEGF receptor 2，VEGFR2）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）［8］。研究表明c-Myb 通過c-fos 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展［9］。本研究旨在明確IL1R2 與c-Fos 相互作用后如何進(jìn)一步影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和血管新生。

1 材料與方法

1.1 組織樣本和細(xì)胞來源 選擇2018年1月至2019年12月在我院行手術(shù)治療的60例結(jié)腸癌患者為研究對象，患者年齡35～82歲，平均（67.31±7.62）歲；男39例，女21例；部位：右半結(jié)腸26例，橫結(jié)腸6例，左半結(jié)腸18例，乙狀結(jié)腸10例；腫瘤最大徑：≤5 cm 39例，＞5 cm 21例；浸潤深度：T1 28例，T2 16例，T3 11例，T4 5例；分 化 程度：高分化26例，中分化24例，低分化10例；臨床分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期21例，Ⅲ期14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無21例，有39例。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)，同時60例被采集樣本組織的患者簽署了知情同意書。人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 購自中國科學(xué)院典型細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 Western blot 法檢測結(jié)腸癌組織及癌旁組織IL1R2 和c-Fos 的表達(dá) 收集結(jié)腸癌組織及癌旁組織的細(xì)胞裂解物，并使用放射免疫沉淀緩沖液提取蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（美國Thermo Fisher 科技公司）之前，使用10%或15% SDSPAGE分離總蛋白（50μg）。在室溫（25 ℃）下用脫脂牛奶將膜封閉1 h。隨后將膜與IL1R2 一抗（1∶500） 或c-Fos 一抗（1∶500）（美國Santa Cruz 公司）分別在25 ℃孵育2 h，與二抗（1∶2 000，美國Santa Cruz 公司）在37 ℃孵育1 h，隨后用帶有Tween 20 的Tris 緩沖鹽水洗滌3 次。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行可視化，并使用Quantum One軟件版本4.62，通過光密度法對信號進(jìn)行定量。β-actin作為內(nèi)參照。該實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620在含有10%胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司）、100 μg/ml 青霉素（德國Sigma-Aldrich 公司）的RPMI 1640 培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)。IL1R2 模擬物（IL1R2 mimic）和抑制劑（IL1R2 inhibitor）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。孵育20 h 后，根據(jù)說明書，使用LipofectamineTM 2000 （美國Thermo Fisher 科技公司），用IL1R2 mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞，制備完成的細(xì)胞株供后續(xù)實驗使用。

1.4 雙重?zé)晒馑孛笢y定IL1R2 與c-Fos 的3′-UTR間的靶向關(guān)系 將SW620 細(xì)胞接種在96 孔板中。溫育24 h后，將細(xì)胞與c-Fos-WT或c-Fos-MUT 和IL1R2 mimic 或陰性對照模擬物共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)說明書使用雙重?zé)晒馑孛笢y定系統(tǒng)測定細(xì)胞。獨立重復(fù)3次。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測IL1R2 不 同 轉(zhuǎn) 染 組IL1R2 和c-Fos的mRNA 表達(dá) RT-PCR 熱循環(huán)是在20 μl 反應(yīng)溶液中進(jìn)行的，其中包含2.5 μl cDNA，200 nm 每個引物和6.5 μl SYBR GreenⅠ主混合物，使用Roche Light Cycler 480 序列檢測系統(tǒng)。IL1R2、c-Fos、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物序列由生工生物工程（上海公司提供），IL1R2 上游引物：5′-GCAGCTTGTGTGTGTGACTG-3′，下游引物：5′-CAGTCACACACACAAGCTGC-3′；c-Fos上游引物：5′-AGCATGGGCTCCCCTGTCA-3′，下游引物：5′-GAGACCAGAGTGGGCTGCA-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，下游引物：5′-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3′。目的基因的表達(dá)水平相對于內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 CCK8 法測定細(xì)胞增殖 使用CCK8 試劑盒（美國Dojindo Molecular Technologies，Inc.）檢測人結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞的增殖作用。收獲處于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，并在96孔板中以100 μl的體積進(jìn)行培養(yǎng)。用對照、IL1R2 mimic和IL1R2 inhibitor 處理細(xì)胞，并在37 ℃孵育0、12、24 和48 h。使用Multiskan EX酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific，Inc.）測量450 nm 波長處的光密度。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF、VEGFR2、HIF-1α和bFGF的表達(dá)水平 ELISA試劑盒購自南京道斯夫生物科技有限公司。將人結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞（5×105個細(xì)胞/孔）接種到6 孔板中，用10% FBS培養(yǎng)24 h，在低血清培養(yǎng)基（0.5%，v/v）中再培養(yǎng)12 h。將100 μl 樣品添加到涂有抗體的96 孔板的每個孔中，在室溫下孵育2 h。將100 μl 的工作檢測器溶液加載到每個孔中，并將板在室溫下再孵育1 h，添加100 μl 的底物溶液。通過添加50 μl 終止溶液來終止反應(yīng)。在450 nm 波長下讀取光密度。

1.8 Transwell 法檢測細(xì)胞侵襲 將用對照、IL1R2 mimic 和IL1R2 inhibitor 處理的3 組細(xì)胞重懸于無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基中，將各組細(xì)胞懸浮液（100 μl包含1×104個細(xì)胞/孔）接種到24孔培養(yǎng)箱的過濾器中；將明膠（10 μg/ml）添加到Transwell 板的每個孔（美國Corning-Costar 產(chǎn)品，孔徑為8 μm）中，將膜在37 ℃下干燥1 h。此后，將懸浮在100 μl 無FBS 培養(yǎng)基中的5×103細(xì)胞接種到Transwell 板的上室中。下腔室充滿含5% FBS 的培養(yǎng)基。溫育8 h 后，用棉簽除去Transwell 上膜頂部的細(xì)胞。用甲醇固定在膜底側(cè)的細(xì)胞，并用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚溶液（10 μg/ml，美國Invitrogen公司）染色20 min。在熒光顯微鏡下計數(shù)來自每個膜的8 個不同視野的細(xì)胞數(shù)目。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2 組比較采用t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復(fù)測量資料比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL1R2 和c-Fos 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)升高 Western blot 結(jié)果顯示，IL1R2和c-Fos在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平分別為1.93±0.25、1.88±0.20，明顯高于癌旁組織（1.05±0.13和1.12±0.12）（t=6.318、4.255，P<0.05），見圖1。

圖1 Western blot法檢測IL1R2和c-Fos在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 熒光素酶測定IL1R2和c-Fos靶向作用 熒光素酶測定結(jié)果顯示，IL1R2 mimic組c-Fos-WT熒光素酶活性為0.39±0.08，明顯低于對照組（1.01±0.15）（t=6.823，P<0.05），而2組c-Fos-MUT熒光素酶活性分別為0.97±0.10和1.02±0.14，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.819，P>0.05）。

2.3 RT-PCR 法檢測IL1R2 不同轉(zhuǎn)染組IL1R2 和c-Fos的mRNA 表達(dá) RT-PCR 結(jié)果顯示，與對照組比較，IL1R2 mimic 組IL1R2 和c-FosmRNA 表達(dá)升高（P<0.01），而IL1R2 inhibitor 組IL1R2 和c-FosmRNA表達(dá)降低（P<0.05），見表1。

表1 IL1R2不同轉(zhuǎn)染組中IL1R2和c-Fos mRNA的表達(dá)水平（±s）

表1 IL1R2不同轉(zhuǎn)染組中IL1R2和c-Fos mRNA的表達(dá)水平（±s）

注：與對照組比較，1）P<0.01，2）P<0.05

組別對照組IL1R2 mimic組IL1R2 inhibitor組F P IL1R2 mRNA 1.81±0.22 3.81±0.341）1.09±0.112）15.271 0.021 c-Fos mRNA 1.91±0.27 5.37±0.311）1.09±0.182）16.588 0.007

2.4 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖 CCK8 檢測結(jié)果顯示，經(jīng)重復(fù)測量資料方差分析，組別（F=15.680，P<0.05）、時間（F=232.750，P<0.05）、組別與時間的交互作用（F=8.216，P<0.05）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，IL1R2 mimic組12 h、24 h和48 h的細(xì)胞增殖升高（P<0.05），而IL1R2 inhibitor組12 h、24 h 和48 h 的細(xì)胞增殖降低（P<0.05）。見表2。

表2 CCK8法檢測細(xì)胞增殖（±s）

表2 CCK8法檢測細(xì)胞增殖（±s）

注：與對照組比較，1）P<0.05，2）P<0.05

組別對照組IL1R2 mimic組IL1R2 inhibitor組F P 0 h 43.10±5.41 47.34±7.29 44.13±4.52 2.890 0.110 12 h 108.73±10.23 164.26±13.191）88.43±6.342）12.762 0.024 24 h 177.32±65.15 274.66±38.251）124.34±35.412）15.481 0.012 48 h 231.71±75.13 355.45±39.311）146.14±41.532）17.628 0.009

2.5 Transwell 侵襲分析 Transwell 結(jié)果顯示，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.134，P=0.020），與對照組（137.82±26.14）比較，IL1R2 mimic 組細(xì)胞侵襲數(shù)量（354.23±12.12）增加（P<0.01），而IL1R2 inhibitor 組細(xì)胞侵襲數(shù)量（93.26±21.44）降低（P<0.05），見圖2。

圖2 Transwell侵襲實驗檢測不同組別穿透濾過膜的細(xì)胞數(shù)量（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色×200）

2.6 ELISA 檢測血管生成因子的水平 ELISA 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，IL1R2 mimic組VEGF、VEGFR2、HIF-1α和bFGF表達(dá)水平升高（P<0.05），而IL1R2 inhibitor 組VEGF、VEGFR2、HIF-1α 和bFGF表達(dá)水平降低（P<0.05），見表3。

表3 ELISA檢測血管生成因子的表達(dá)水平（±s，pg/ml）

表3 ELISA檢測血管生成因子的表達(dá)水平（±s，pg/ml）

注：與對照組比較，1）P<0.05，2）P<0.05

組別對照組IL1R2 mimic組IL1R2 inhibitor組F P VEGF 64.73±12.56 92.39±11.491）38.08±8.422）15.334 0.009 VEGFR2 62.32±18.01 85.37±6.021）40.29±12.012）16.352 0.023 HIF-1α 54.37±14.30 76.83±4.241）32.03±10.892）11.341 0.012 bFGF 42.52±9.89 68.49±3.141）20.45±6.392）14.263 0.019

3 討論

結(jié)腸癌病理生理過程涉及多種因素，其中炎癥在腫瘤血管生成中起著重要的作用。IL1R2表達(dá)在用IFN-γ或佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯處理的角質(zhì)形成細(xì)胞中得到增強(qiáng)，表明IL1R2 起到促炎因子的作用［10］。最近的研究表明，細(xì)胞內(nèi)IL1R2 的過表達(dá)增強(qiáng)了IL-6 的表達(dá)，因此，IL1R2在IL-1 信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)中具有明顯的雙重作用，即IL1R2抑制外源IL-1信號傳導(dǎo)，而細(xì)胞內(nèi)IL1R2刺激炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［11］。IL1R2 的促炎活性不僅限于結(jié)腸癌細(xì)胞，還可以在致瘤性人類角質(zhì)形成細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［12］。因為已在多種腫瘤中觀察到IL1R2表達(dá)增強(qiáng)，所以我們可以推斷IL1R2在驅(qū)動腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要功能。

c-Fos 能夠調(diào)控腫瘤增殖、侵襲、血管生成、分化和凋亡等多個方面。其中，在細(xì)胞增殖方面，c-Fos 的外源表達(dá)能夠使cyclinD 和cyclinE 的表達(dá)失調(diào)，加速凋亡S 期的進(jìn)入［13］。不同功能的發(fā)揮和c-Fos不同下游基因的調(diào)控有密切關(guān)系。相關(guān)文獻(xiàn)報道了與c-Fos 相互作用的蛋白。例如，c-Fos 與CBFA1 相互作用以激活膠原酶3 啟動子，而HBXIP（乙型肝炎X 相互作用蛋白）的核輸入依賴于HBXIP和c-Fos之間的相互作用以及這兩者的磷酸化乳腺癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)［13］。PRDM1過表達(dá)通過抑制c-Fos的表達(dá)減弱膀胱癌的進(jìn)程［14］。本研究結(jié)果表明，比較結(jié)腸癌與癌旁正常組織后發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中IL1R2 與c-Fos 蛋白表達(dá)水平較癌旁正常組織明顯升高，結(jié)合雙重?zé)晒馑孛笢y定結(jié)果，進(jìn)一步說明IL1R2 和c-Fos 之間存在相互作用關(guān)系。

VEGF 被認(rèn)為是介導(dǎo)血管生成的最重要因素，其水平可以反映血管生成的狀態(tài)［15］。因此，在過去的十年中，已經(jīng)通過抑制VEGF 的表達(dá)來抑制血管新生。VEGFR2作為VEGF的受體，通過結(jié)合VEGF而發(fā)揮功能［16］。HIF-1在促進(jìn)惡性細(xì)胞化療耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫抑制和細(xì)胞間相互作用中發(fā)揮重要作用，其可以調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而介導(dǎo)血管生成過程［17］。bFGF是另一種與VEGF 相互作用的血管生成誘導(dǎo)劑［18］。本研究通過ELISA 檢測結(jié)果顯示，抑制IL1R2 表達(dá)后下調(diào)了VEGF、VEGFR2、HIF-1α 和bFGF這些促血管生成因子的表達(dá)。

綜上所述，本研究明確了IL1R2 和c-Fos 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。通過調(diào)控IL1R2 的表達(dá)直接作用于c-Fos，進(jìn)而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和血管新生，影響結(jié)腸癌細(xì)胞的發(fā)生和進(jìn)展。由于結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞并不能完全代表其他類型的結(jié)腸癌細(xì)胞系，體外細(xì)胞實驗亦不能夠完全模擬體內(nèi)生理生化環(huán)境，因此該實驗也存在一定的局限性。