付燕秋 呂志敏 王智 于佳

摘 要：本文對(duì)啤酒中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的生長(zhǎng)和存活進(jìn)行了研究。在啤酒中分別接種定量的兩種致病菌，靜態(tài)培養(yǎng)，對(duì)其在培養(yǎng)期間的菌落數(shù)進(jìn)行檢測(cè)分析，并研究了pH值和儲(chǔ)存溫度對(duì)沙門氏菌的影響。結(jié)果表明，在中酒精度（2.5%vol～3.6%vol）和高酒精度（≥4.0%vol）啤酒中，兩者均不能生長(zhǎng);在無(wú)酒精啤酒（<0.5%vol）中，金黃色葡萄球菌迅速失活，沙門氏菌迅速生長(zhǎng)，當(dāng)pH值降低至4.0時(shí)，其生長(zhǎng)停止;在5～25 ℃貯存條件下，溫度升高，沙門氏菌在無(wú)酒精啤酒中生長(zhǎng)加快。

關(guān)鍵詞：啤酒;沙門氏菌;金黃色葡萄球菌;生存

Study on the Survival of Staphylococcus aureus and Salmonella in Beer

FU Yanqiu， LV Zhimin， WANG Zhi， YU Jia

（Qingdao Product Quality Inspection Research Institute， Qingdao Product Quality Inspection Technology Research Institute， Qingdao 266000， China）

Abstract： The growth and survival of Staphylococcus aureus and Salmonella in beer were studied in this paper. Two quantitative pathogens were inoculated into beer and cultured statically. The colony count during the culture period was detected and analyzed， and the effects of pH value and storage temperature on Salmonella were studied. The results showed that both of them could not grow in medium alcohol precision （2.5%vol～3.6%vol） and high alcohol precision （≥4.0%vol）; In non-alcoholic beer （<0.5%vol）， Staphylococcus aureus inactivated rapidly and Salmonella grew rapidly. When the pH value decreased to 4.0， its growth stopped; Under the storage condition of 5～25 ℃， the growth of Salmonella in non-alcoholic beer was accelerated with the increase of temperature.

Keywords： beer; Salmonella; Staphylococcus aureus; survive

啤酒被認(rèn)為是一種微生物安全性較高的飲料，因其含有許多內(nèi)在的抗菌因素，包括酒精（2.5%vol～

5.0%vol）、啤酒花苦味酸（約為17～55 IBU）、低pH（3.9～4.4）、高濃度二氧化碳（約為0.5%）、低溶氧量（<0.1 mg/L）和缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。此外，啤酒生產(chǎn)加工過(guò)程，如糖化、麥芽汁煮沸、巴氏殺菌、無(wú)菌過(guò)濾和冷藏等對(duì)維持微生物穩(wěn)定性起到保護(hù)作用[1]。2012年，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012），取消了啤酒菌落總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)，僅需檢測(cè)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。筆者從2019年負(fù)責(zé)成品啤酒微生物檢測(cè)以來(lái)，共檢測(cè)1 000余批次樣品，均未檢出兩種致病菌。這與一些研究結(jié)果一致，在啤酒中食品致病菌的存活率通常很低[2-5]。但HOMPESCH[6]的研究表明，沙門氏菌可在啤酒中存活長(zhǎng)達(dá)63 d。L'ANTHO?N等[7]報(bào)告部分食品致病菌可在無(wú)酒精啤酒中生長(zhǎng)。高松[8]的衛(wèi)生監(jiān)督監(jiān)測(cè)報(bào)告結(jié)果顯示，162批次市售啤酒，共檢出致病菌3株，檢出率為1.85%。本文通過(guò)在啤酒中接種等量的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，在不同的抑菌條件下，靜態(tài)培養(yǎng)，研究其生長(zhǎng)情況，以期為今后啤酒的微生物檢測(cè)工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538;鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028。培養(yǎng)基：7.5%NaCl肉湯、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、Baird-Parker瓊脂、XLD瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1304ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHH-150L生化培養(yǎng)箱，重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;2RH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SPX-250BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;FE20梅特勒酸度計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;DensiCHEK plus比濁儀，BioMerieux。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物接種物制備

金黃色葡萄球菌和沙門氏菌菌株分別接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上活化培養(yǎng)。24 h后，挑取單一菌落用無(wú)菌生理鹽水通過(guò)比濁儀，配制比濁度為0.5的菌懸液，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋目標(biāo)接種物約為

105 CFU/mL，備用。金黃色葡萄球菌目標(biāo)接種物標(biāo)記為J菌液;沙門氏菌目標(biāo)接種物標(biāo)記為S菌液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)用啤酒準(zhǔn)備

啤酒根據(jù)酒精含量分為無(wú)酒精（<0.5%vol）、中酒精度（2.5%vol～3.6%vol）和高酒精度（≥4.0%vol）啤酒。實(shí)驗(yàn)用啤酒均為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)剩余樣品，具體見(jiàn)表1。

1.3.3 金黃色葡萄球菌在啤酒中的存活

將表1中的B1、B2、B3、B4和B5用無(wú)菌量筒各取250 mL置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，一式兩份。一份取0.5 mL J菌液加入各均質(zhì)袋，標(biāo)記為Pn;另一份，不加菌液，作為陰性對(duì)照，標(biāo)記為CK-。同時(shí)，再取0.5 mL J菌液加入250 mL 7.5% NaCl肉湯中，作為陽(yáng)性對(duì)照，標(biāo)記為CK+。從Pn、CK-和CK+各均質(zhì)袋中吸取1 mL，選擇適宜的稀釋度，涂布BP平板，36 ℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)。將Pn、CK-和CK+各均質(zhì)袋，置于25 ℃，靜態(tài)培養(yǎng)，每天同一時(shí)間計(jì)數(shù)。

1.3.4 沙門氏菌在啤酒中的存活

實(shí)驗(yàn)操作同1.3.3。其中，J菌液換為S菌液;陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)基為250 mL緩沖蛋白胨水（BPW）;計(jì)數(shù)方法為20 mL冷卻至46 ℃的XLD瓊脂培養(yǎng)基傾注平板，36 ℃培養(yǎng)24 h后，計(jì)數(shù)。

1.3.5 在無(wú)酒精啤酒中儲(chǔ)存溫度和pH值對(duì)沙門氏菌存活的影響

啤酒標(biāo)簽上標(biāo)識(shí)貯存條件為5～25 ℃[9]。將接種S菌液的無(wú)酒精啤酒在5 ℃、15 ℃和25 ℃下，靜態(tài)培養(yǎng)，評(píng)估儲(chǔ)存溫度對(duì)沙門氏菌存活的影響。本文測(cè)得實(shí)驗(yàn)用無(wú)酒精啤酒pH值為4.19，在啤酒的典型pH值范圍內(nèi)[10]。沙門氏菌最適生長(zhǎng)pH值為6.8～7.8[11]。用無(wú)菌過(guò)濾的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值，15 ℃靜態(tài)培養(yǎng)，評(píng)估pH值為4.0、4.2、4.5和7.0時(shí)對(duì)沙門氏菌存活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌和沙門氏菌在啤酒中的存活情況

金黃色葡萄球菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情況如圖1所示。25℃時(shí)，在P1、P2、P3、P4和P5中只存活了3～5 d，即使在無(wú)酒精啤酒P1中也不能存活，說(shuō)明其在不同酒精度啤酒中均無(wú)法啟動(dòng)生長(zhǎng)。MENZ等[2]報(bào)道，麥芽汁中低水平的啤酒花苦味酸可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)。圖1進(jìn)一步佐證了這種保護(hù)作用，即使低水平的啤酒花苦味酸也會(huì)抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)并限制其存活。

沙門氏菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情況如圖2所示。25 ℃時(shí)，在P2、P3、P4和P5中6～9 d

失去活性，而在無(wú)酒精啤酒P1中1 d后迅速生長(zhǎng)。說(shuō)明沙門氏菌在中、高酒精度啤酒中無(wú)法啟動(dòng)生長(zhǎng)，但能在無(wú)酒精啤酒中劇烈生長(zhǎng)，這與L’ANTHO?N等[7]的研究一致。

2.2 在無(wú)酒精啤酒中儲(chǔ)存溫度和pH值對(duì)沙門氏菌存活的影響

儲(chǔ)存溫度對(duì)無(wú)酒精啤酒中沙門氏菌存活的影響如圖3所示。沙門氏菌在25 ℃時(shí)的生長(zhǎng)速度明顯快于15 ℃時(shí)，而在5 ℃時(shí)則無(wú)明顯增殖現(xiàn)象。25 ℃時(shí)，沙門氏菌在5 d內(nèi)從1.1×105 CFU/mL到8.8×107 CFU/mL，達(dá)到最大菌群數(shù)。15 ℃時(shí)，有一個(gè)較長(zhǎng)的滯后階段，14 d開(kāi)始生長(zhǎng)，且整個(gè)生長(zhǎng)趨勢(shì)緩慢。5 ℃時(shí)，沙門氏菌未生長(zhǎng)，也未在35 d后完全失活。

無(wú)酒精啤酒的pH值對(duì)沙門氏菌存活的影響如圖4所示。當(dāng)無(wú)酒精啤酒pH值增加時(shí)，沙門氏菌生長(zhǎng)得到增強(qiáng)，生長(zhǎng)滯后階段變短。pH為4.2時(shí)，沙門氏菌14 d開(kāi)始生長(zhǎng);pH為4.5時(shí)，13 d開(kāi)始生長(zhǎng);pH為7.0時(shí)，僅1 d就開(kāi)始劇烈生長(zhǎng)。而pH為4.0時(shí)，其從10 d開(kāi)始活性顯著下降，25 d后被滅活。由此可知，pH值是啤酒對(duì)沙門氏菌產(chǎn)生抑制作用的一個(gè)重要因素，將無(wú)酒精啤酒的pH值從初始的4.2增加至4.5和7.0導(dǎo)致繁殖速度加快和滯后階段減短，而pH值降低至4.0會(huì)使其失活。通常啤酒的pH值為3.9～4.4[7]。綜上所述，沙門氏菌在啤酒中難以生存。

3 結(jié)論

本文研究了啤酒中兩種致病菌的生長(zhǎng)和存活情況。在中、高酒精度啤酒中，兩種致病菌均無(wú)法生長(zhǎng)存活。在無(wú)酒精啤酒中，金黃色葡萄球菌失活，這是由于啤酒花苦味酸的存在;沙門氏菌能迅速生長(zhǎng)，但降低啤酒pH值生長(zhǎng)被抑制。由此可見(jiàn)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制要求檢驗(yàn)的兩種致病菌在啤酒中存在的可能性較低，尤其在中、高酒精度啤酒中幾乎沒(méi)有致病菌傳播的風(fēng)險(xiǎn)。但由于沙門氏菌在低溫下滅活速度減慢，在低溫保存的鮮啤酒中存在被檢出的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于無(wú)酒精（<0.5%vol）條件可以支持沙門氏菌的生長(zhǎng)（特別是在pH值略高的情況下），因此對(duì)未經(jīng)巴氏殺菌的無(wú)酒精啤酒產(chǎn)品，檢驗(yàn)人員應(yīng)在工作中加強(qiáng)對(duì)其的重視。

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