鄭響，陳小亭，蔡啟良，魏芳（.上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 盛毓綬細胞與免疫學(xué)研究中心，上海 0040；.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 0003）

原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）是一種罕見的霍奇金淋巴瘤，主要表現(xiàn)為腹水、胸腔積液和心包積液等[1-2]。PEL的惡性程度高，常規(guī)化療藥物治療效果不佳，預(yù)后極差，患者中位生存期少于6 個月[3-4]，因此亟待研發(fā)安全有效的治療手段。PEL 通常與卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染相關(guān)[5-9]。本課題組前期的研究結(jié)果[10-11]顯示，處于KSHV 感染潛伏期的PEL 細胞均不同程度地過表達IL-4Rα，而KSHV 陰性細胞則不表達或低表達IL-4Rα；過表達IL-4Rα引起JAK1-PI3K-Akt信號通路的組成型激活，從而促進潛伏期腫瘤的生長。研究結(jié)果[12-13]發(fā)現(xiàn)，IL-4R高表達與多種類型惡性腫瘤相關(guān)，并在以其為治療靶點的研究中觀察到藥物對腫瘤長期、持續(xù)的療效。上述研究結(jié)果均提示，IL-4Rα可能是KSHV陽性PEL的潛在治療靶點。利用帶負電的膜磷脂酰絲氨酸在多數(shù)腫瘤與正常細胞細胞膜上表達水平的差異，PAPO等[14]合成非對映體裂解肽（包含D-和L-形式的亮氨酸和賴氨酸等15個氨基酸），并發(fā)現(xiàn)此裂解肽能夠因癌細胞表面酸性成分的靜電吸引而具有一定的細胞選擇性，隨后通過類似陽離子抗菌肽的工作原理裂解細胞膜。KOHNO等[15]在此基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化氨基酸序列設(shè)計了裂解肽Lytic，減少了對正常細胞的殺傷。之后，YANG 等[16]設(shè)計的靶向融合肽IL-4Rα-lytic 含有靶向IL-4Rα 的靶向肽和裂解肽Lytic 兩個片段，可特異地靶向多種類型表達IL-4Rα 受體的腫瘤細胞（如胰腺癌、乳腺癌等細胞）。本研究旨在檢測靶向融合肽IL-4Rα-lytic對KSHV陽性PEL細胞的體內(nèi)外殺傷效果，并分析其安全性，為PEL的治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

人B細胞淋巴瘤細胞系BCBL-1、BCP-1和BJAB由本室保存，熒光素酶標(biāo)記的BCBL-1細胞為本實驗室前期構(gòu)建[17]。所有細胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6周齡、體質(zhì)量20 g左右的雌性NOD/SCID小鼠購自維通達生物技術(shù)有限公司（實驗動物合格證號：20210402Abzz0619000685）。CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，AnnexinⅤ-APC/PI試劑盒購自BD Biosciences 公司。IVIS Spectrum 活體光學(xué)成像系統(tǒng)購自美國珀金埃爾默公司，熒光素底物購自翌圣生物科技股份有限公司，正倒置一體熒光顯微鏡購自美國ECHO 公司，pocH-100i 全自動血液分析儀購自日本希森美康公司。組織切片和H-E 染色由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。

1.2 多肽合成

IL-4Rα-lytic 和Lytic 由上海強耀生物科技有限公司合成。多肽均用固態(tài)合成法合成（純度＞95%），并經(jīng)過質(zhì)譜分析驗證。多肽溶解在PBS（pH=7.4）中。IL-4Rα-lytic:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLL KKLLKLLKKK（有下劃線的氨基酸為D型氨基酸）；Lytic:KLLLKLLKKLLKLLKKK（有下劃線的氨基酸為D型氨基酸）。

1.3 MTT 法檢測IL-4Rα-lytic 對KSHV 陽性PEL 細胞的殺傷效果

將密度為5×105個/mL 的KSHV 相關(guān)細胞（包括KSHV陽性PEL細胞BCBL-1、BCP-1和KSHV 陰性細胞BJAB）懸液接種于96孔板（50μL/孔），然后加入2.5、5、10或20μmol/L的IL-4Rα-lytic或Lytic溶液（50μL/孔），于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h后，每孔加入CCK-8試劑10μL，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔細胞的光密度（D）值，并計算細胞存活率（細胞存活率=實驗組D450/對照組D450×100%）。實驗重復(fù)3次。

1.4 FCM檢測IL-4Rα-lytic和Lytic對KSHV 陽性PEL細胞凋亡的影響

將密度為1×106個/mL 的BCBL-1、BCP-1 和BJAB 細胞置于12 孔板中，分別加入IL-4Rα-lytic 和Lytic 溶液（終濃度均為5 μmol/L），同時對照組加入等體積培養(yǎng)基，37 ℃下處理2 h。離心、冷染色緩沖液洗滌后，用100 μL 結(jié)合緩沖液重懸細胞。每管依次加入0.5 μL Annexin Ⅴ-APC 和1μL PI，室溫下避光15 min，加400μL 結(jié)合緩沖液，混勻，上機檢測細胞的凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.5 BCBL-1細胞小鼠移植瘤模型的建立及觀察

將熒光素酶標(biāo)記的BCBL-1 細胞經(jīng)腹腔注射至NOD/SCID小鼠體內(nèi)（注射劑量為1×107個細胞/只），建立小鼠異種移植模型。細胞植入后第9天，小鼠腹腔注射熒光素底物（150 mg/kg），利用活體生物發(fā)光成像技術(shù)檢測小鼠體內(nèi)腫瘤的生長情況。隨后，將具有相似信號強度的荷瘤小鼠隨機分成PBS 組（對照組）和IL-4Rα-lytic 組（4 只/組），經(jīng)腹腔分別注射PBS 和IL-4Rα-lytic（5 mg/kg），每周3 次，連續(xù)3 周。在藥物治療過程中，每2～3 d 稱量一次小鼠體質(zhì)量。3 周后，再次進行活體光學(xué)成像檢測移植瘤的大小，然后經(jīng)尾靜脈取血，用全自動血液分析儀進行血液分析。第23 天時處死小鼠，切取肺、肝和腎組織標(biāo)本，經(jīng)固定、石蠟包埋、H-E 染色后，在正倒置一體熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，組間差異比較采用t檢驗，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-4Rα-lytic選擇性殺傷KSHV陽性PEL細胞

經(jīng)IL-4Rα-lytic 處理2 h 后，MTT法檢測結(jié)果（圖1A）顯示，與Lytic 組比較，IL-4Rα-lytic 組KSHV 陽性細胞BCBL-1、BCP-1 和KSHV 陰性細胞BJAB 存活率均呈現(xiàn)劑量依賴性梯度降低（均P＜0.01）。其中，5μmol/L 的IL-4Rα-lytic 可以殺傷60%以上的BCBL-1、BCP-1細胞，而對BJAB細胞的殺傷力較弱。IL-4Rα-lytic殺傷BCBL-1、BCP-1和BJAB細胞的IC50分別為2.37、2.81和7.97μmol/L，而Lytic殺傷BCBL-1、BCP-1 細胞的IC50分別為26.05和21.67 μmol/L。Lytic殺傷BCBL-1、BCP-1 細胞的IC50分別是IL-4Rα-lytic的11.0 和7.7 倍。在觀察濃度中未檢測到Lytic 處理對BJAB細胞的明顯殺傷作用。

隨后，檢測了IL-4Rα-lytic 不同處理時間的殺傷效果，結(jié)果（圖1B）顯示，5 μmol/L 的IL-4Rα-lytic 可在10 min 內(nèi)誘導(dǎo)60%以上的KSHV 陽性PEL 細胞BCBL-1 和BCP-1 死亡（均P＜0.01），而5 μmol/L 的Lytic處理相同時間未造成明顯的細胞死亡。這一殺傷水平未隨著時間增加而增強，提示IL-4Rα-lytic 對KSHV 陽性PEL 細胞的殺傷主要是通過IL-4Rα-lytic穿膜而導(dǎo)致的快速殺傷。

2.2 IL-4Rα-lytic可誘導(dǎo)KSHV陽性PEL細胞凋亡

用5μmol/L 的IL-4Rα-lytic 處理2 h 后，F(xiàn)CM檢測結(jié)果（圖2）顯示，與對照組和Lytic組比較，IL-4Rα-lytic組KSHV 陽性BCBL-1 和BCP-1 細胞凋亡率均顯著升高（均P＜0.05），而KSHV陰性BJAB細胞凋亡率未見明顯變化。說明，IL-4Rα-lytic 可在體外選擇性誘導(dǎo)KSHV陽性PEL細胞凋亡而殺傷腫瘤細胞。

2.3 IL-4Rα-lytic顯著抑制BCBL-1細胞小鼠移植瘤的生長

鑒于IL-4Rα-lytic 體外對BCBL-1 細胞的強殺傷活性，進一步觀察了IL-4Rα-lytic 對BCBL-1 細胞小鼠移植瘤生長的作用及其安全性。結(jié)果如圖3所示，治療前IL-4Rα-lytic組與PBS組的平均熒光強度無顯著性差異（P＞0.05），治療3周后PBS組移植瘤生長迅速，而在IL-4Rα-lytic 組BCBL-1 細胞移植瘤的生長速率明顯減緩（P＜0.05），甚至有1只小鼠觀察到腫瘤負荷降低。

肺、肝、腎組織切片的H-E 染色結(jié)果（圖4A）顯示，IL-4Rα-lytic 組未見明顯轉(zhuǎn)移灶，同時組織細胞形態(tài)正常，表明IL-4Rα-lytic 對于肺、肝、腎無明顯器官毒性。IL-4Rα-lytic 組與PBS 組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖4B）。此外，全血常規(guī)檢測結(jié)果（表1）顯示，IL-4Rα-lytic組小鼠的白細胞總數(shù)（WBC）、紅細胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細胞平均體積（MCV）、小型白細胞占白細胞總數(shù)百分比（W-SCR）、中型白細胞占白細胞總數(shù)百分比（W-MCR）、大型白細胞占白細胞總數(shù)百分比（W-LCR）等指標(biāo)與PBS組小鼠比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 IL-4Rα-lytic對NOD/SCID小鼠血液指標(biāo)的影響（n=4）

實驗結(jié)果表明，IL-4Rα-lytic可顯著抑制BCBL-1細胞小鼠移植瘤的生長，且無明顯的毒副作用。

3 討論

PEL惡性程度高、預(yù)后較差、長期生存者少，目前主要采用CHOP 方案化療和逆轉(zhuǎn)錄病毒治療法聯(lián)用進行治療。但是，常規(guī)治療所用藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也會對正常細胞產(chǎn)生殺傷，同時腫瘤細胞的耐藥性也影響著治療效果。此外，PEL 不常見，臨床研究多局限于個案報道，可用的特效藥物少，因此研發(fā)新型的毒副作用小的靶向治療藥物并探究其作用機制對于治療PEL意義重大。

小分子短肽因其具有良好的腫瘤穿透能力、無耐藥性問題、易于合成修飾和低免疫原性[17-21]等優(yōu)點，逐漸成為腫瘤治療的熱點。本研究所使用的細胞裂解肽Lytic是由17個氨基酸組成的短肽，帶正電荷，而腫瘤細胞表面負電性的磷脂酰絲氨酸水平略高于正常細胞，因此該裂解肽Lytic 對于腫瘤細胞的殺傷略強于正常細胞。同時，由于裂解肽含有D型氨基酸，能有效防止其被蛋白水解酶水解，從而延長作用時間[21]。將能靶向IL-4Rα 的靶向肽與Lytic 結(jié)合，可選擇性殺傷PEL 細胞，同時減少對正常細胞的殺傷。靶向融合肽IL-4Rα-lytic 殺傷BJAB 細胞的IC50分別是殺傷BCBL-1、BCP-1細胞的3.4和2.8倍，同時裂解肽Lytic 殺傷BCBL-1、BCP-1 細胞的IC50分別是IL-4Rα-lytic 的11.0 和7.7 倍。這說明，相比較于KSHV 陰性細胞，IL-4Rα-lytic 對KSHV 潛伏感染的PEL細胞有選擇性殺傷作用。為分析其殺傷機制，本研究進行了短時間的殺傷活性以及促凋亡能力的測定，快速的殺傷及促凋亡提示靶向融合肽IL-4Rα-lytic通過穿膜和誘導(dǎo)凋亡兩種方式來達到殺傷PEL細胞的目的。小鼠移植瘤實驗結(jié)果表明，IL-4Rα-lytic 經(jīng)由腹腔注射能顯著抑制BCBL-1細胞移植瘤的生長，同時對于肺、肝、腎等器官均無明顯毒副作用，各項血液檢測指標(biāo)正常，提示IL-4Rα-lytic的安全性較高。

總之，本研究提供了一種針對PEL的特異性強、安全性高的靶向融合肽IL-4Rα-lytic，為進一步的動物實驗和PEL的治療提供了新的思路和實驗基礎(chǔ)。