陳昊川，郜趙偉，龍敏，劉沖，董軻，張惠中（空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安 710038）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率遠高于肺癌和結(jié)直腸癌，是女性癌癥死亡的首要原因[1]。乳腺癌的發(fā)病機制復(fù)雜，影響因素多，研究其發(fā)生和發(fā)展的分子機制對乳腺癌的早期診斷和治療具有重要意義。共抑制分子B7-H4是B7家族的重要成員，在腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病中異常表達[2-3]，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用。B7-H4 通過抑制T 細胞增殖和細胞因子分泌，負調(diào)控T 細胞免疫反應(yīng)，促進腫瘤細胞免疫逃逸[4]。研究結(jié)果[5]顯示，B7-H4 在多種類型腫瘤中高表達，可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物，與腫瘤的不良預(yù)后和高復(fù)發(fā)率密切相關(guān)。然而，目前B7-H4在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制尚未完全闡明。本研究以乳腺癌細胞T47D和MCF-7為研究對象，使用siRNA干擾B7-H4的表達，通過體外實驗探究B7-H4對兩種乳腺癌細胞增殖、凋亡、周期以及相關(guān)下游分子表達的影響，明確B7-H4與乳腺癌細胞惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，為揭示B7-H4在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

人乳腺癌細胞系T47D和MCF-7購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自Excell Bio公司，LipofectamineTM2000試劑盒購自Invitrogen公司，TRIzol試劑購自TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自奧科生物有限公司，qPCR試劑購自Abm生物科技有限公司，引物由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司合成，BCA蛋白定量試劑盒購自北京鼎國昌盛公司，SDS-PAGE凝膠試劑、RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，鼠抗人B7-H4單克隆抗體購自Proteintech公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋公司，兔抗cyclin D1抗體（ab16663）購自Abcam公司，CCK-8細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。siRNA由上海生工生物工程有限公司合成。siB7-H4 序列：正義鏈為5'-GCU CUACAAUGUUACGAUCAATT-3'，反義鏈為UUG AUCGUAACAUUGUAGAGCTT；siNC序列：正義鏈為5'-UUCUCCGAACGUG UCACGUTT-3'，反義鏈為5'-ACGUGACACG UUCGGAGAATT-3'。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

乳腺癌T47D和MCF-7細胞均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天按照3×105個/孔（MCF-7細胞）或4×105個/孔（T47D細胞）接種于6孔板。根據(jù)LipofectamineTM2000使用手冊將siRNA（siB7-H4）及其陰性對照（siNC）轉(zhuǎn)染至MCF-7和T47D細胞，分別命名為T47D-siNC、T47D-siB7-H4、MCF-7-siNC、MCF-7-siB7-H4 組。每孔脂質(zhì)體5 μL、siRNA 100 pmol/L（opti-MEM稀釋），繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)基。

1.3 qPCR法檢測乳腺癌細胞中B7-H4、cyclin D1和E2F家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達

收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細胞，用TRIzol 提取各組細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin 為內(nèi)參，進行qPCR實驗比較目的基因mRNA表達水平差異變化。引物序列見表1。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40個循環(huán)。以β-actin為參照，采用2-ΔΔCT法計算各目的基因mRNA的相對表達量。

表1 qPCR引物序列

1.4 WB法檢測乳腺癌細胞中B7-H4和cyclin D1蛋白的表達

收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細胞，PBS 清洗后，加入含1%PMSF 的RIPA 裂解液，提取細胞總蛋白，并用BCA 法測定蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC 膜上，在5%脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜。次日，加入鼠抗人B7-H4抗體（1∶500）、兔抗人cyclin D1 抗體（1∶200）、鼠抗人β-actin 抗體（1∶1 000），室溫中處理2 h。TBST洗滌3次（10 min/次），后用HRP 標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌后，加入電化學(xué)發(fā)光液通過自動呈像儀（Bio-Rad 公司）顯影，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.5 CCK-8法檢測乳腺癌細胞的增殖能力

將各組細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，其中MCF-7-siNC 和MCF-7-siB7-H4 為5×103個細胞/孔，T47D-siNC 和T47D-siB7-H4 為7.5×103個細胞/孔，每孔加100 μL培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48、72 h時將10 μL CCK-8溶液加入培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后上酶標(biāo)儀450 mm波長處檢測每孔的光密度（D）值，以D值代表細胞增殖水平。

1.6 FCM檢測乳腺癌細胞的凋亡水平和細胞周期

轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48 h后，經(jīng)胰酶消化并收集細胞，PBS 洗滌2 次，棄上清液。利用Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒處理細胞：用500 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，混勻，室溫下避光處理15 min，1 h 內(nèi)上流式細胞儀檢測。利用細胞周期檢測試劑盒處理細胞：用500 μL 75%乙醇固定細胞2 h，PBS 洗滌2 次后，加入450 μL PI 和50 μL RNaseA，混勻后室溫避光處理30～60 min，上流式細胞儀分析細胞的周期分布情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

qPCR 法、WB 法、CCK-8 法、FCM 等實驗均重復(fù)3 次。采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗和近似t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 或P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建干擾B7-H4表達的T47D和MCF-7細胞

qPCR 法和WB 法檢測結(jié)果（圖1）顯示，與T47D-siNC 和MCF-7-siNC 組相比，T47D-siB7-H4、MCF-7-siB7-H4 組細胞中B7-H4 mRNA 和蛋白表達水平均顯著下降（均P＜0.01）。結(jié)果表明，通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA，成功構(gòu)建干擾B7-H4 表達的乳腺癌T47D和MCF-7細胞系，可以進行后續(xù)實驗。

2.2 干擾B7-H4 表達顯著抑制T47D 和MCF-7 細胞的增殖能力

CCK-8法檢測結(jié)果（圖2）顯示，T47D-siB7-H4組細胞增殖能力顯著低于T47D-siNC 組（P＜0.01）；MCF-7-siB7-H4 組細胞增殖能力顯著低于MCF-7-siNC 組（P＜0.01）。結(jié)果表明，干擾B7-H4 表達顯著抑制了乳腺癌T47D 和MCF-7 細胞的增殖能力。

2.3 干擾B7-H4 表達可使T47D 和MCF-7 細胞發(fā)生G1/S期阻滯

FCM 檢測結(jié)果顯示，與T47D-siNC 組相比，T47D-siB7-H4 組細胞中處于G1 期細胞百分比顯著增加[（73.05±3.52）%vs（66.55±1.17）%，P＜0.01；圖3A]；與MCF-7-siNC 組相比，MCF-7-siB7-H4 組細胞中處于G1期細胞百分比顯著增加[（67.56±1.85）%vs（56.68±0.31）%，P＜0.01；圖3B]。結(jié)果表明，干擾B7-H4 表達可使乳腺癌T47D 和MCF-7 細胞發(fā)生G1/S期阻滯。

2.4 B7-H4表達下調(diào)抑制cyclin D1表達

WB實驗結(jié)果（圖4）顯示，與T47D-siNC 和MCF-7-siNC組相比，T47D-siB7-H4和MCF-7-siB7-H4組細胞中cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平均顯著下降（均P＜0.01）。以上結(jié)果表明，干擾B7-H4 表達能夠下調(diào)乳腺癌細胞cyclin D1的表達。

2.5 干擾B7-H4 表達對E2F 家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

qPCR 法檢測結(jié)果（圖5）顯示，與T47D-siNC組相比，T47D-siB7-H4組細胞中E2F1、E2F2、E2F7 和E2F8 mRNA 水平有不同程度的降低（均P＜0.01）；與MCF-siNC組相比，MCF-7-B7-H4組細胞中E2F1、E2F2、E2F3、E2F7和E2F8 mRNA 水平有不同程度的降低（P＜0.05 或P＜0.01）。其中，E2F1、E2F2、E2F7 和E2F8 為兩細胞系干擾B7-H4 后共同下調(diào)的E2F 家族轉(zhuǎn)錄因子。

2.6 干擾B7-H4 表達對T47D 和MCF-7 細胞的凋亡無影響

FCM檢測結(jié)果（圖6）顯示，與T47D-siNC 和MCF-7-siNC組相比，T47D-siB7-H4和MCF-7-siB7-H4組細胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)果表明，干擾B7-H4 表達對乳腺癌T47D 和MCF-7 細胞的凋亡無顯著影響。

3 討論

B7-H4與B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1/PD-L1（CD274）、ICOS-L/B7-H2（CD275）、B7-H3（CD276）等同屬B7家族成員，在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用。B7-H4在宮頸癌、食管癌、黑色素瘤、尿路上皮細胞癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌和肝癌等多種腫瘤中均有異常表達[6]，且在幾乎所有乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和小葉乳腺癌中高表達[7]。B7-H4與宮頸癌患者總生存期和無病生存期呈負相關(guān)，在卵巢癌患者血清中水平升高，是一種有應(yīng)用前景的卵巢癌標(biāo)志物[8-10]。HAO等[11]的研究結(jié)果顯示，抑制B7-H4通過激活PI3K信號通路促進肝細胞癌細胞凋亡和自噬。作為B7家族的成員，研究者常聚焦于其在腫瘤微環(huán)境中所扮演的免疫抑制角色。B7-H4的過表達通過上調(diào)CXCL8募集腫瘤相關(guān)嗜中性粒細胞促進腎細胞癌進展[12]，并且與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中免疫細胞浸潤和不良預(yù)后相關(guān)[13]。DANGAJ等[14]認為，阻斷B7-H4和受體相互作用是一種可行的腫瘤治療策略，然而B7-H4的受體分子仍不明確[3]。在腫瘤治療中，針對B7-H4 已經(jīng)開發(fā)了幾種策略，包括抗體、CAR-T細胞和藥物偶聯(lián)物等。由于在三陰性乳腺癌組織中存在較高水平的PD-L1[15]，因此抑制B7-H4糖基化可與化療和PD-L1阻斷相結(jié)合，從而控制腫瘤細胞增殖[16]；抗B7-H4協(xié)同曲妥珠單抗治療可促進巨噬細胞吞噬作用并根除乳腺癌[17]。據(jù)報道[18]，B7-H4是一種不穩(wěn)定的細胞表面抗原，可能不適合作為抗體依賴的細胞毒性或單克隆抗體藥物的靶點。因此，對B7-H4在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用及機制研究可以為免疫治療藥物的研發(fā)提供新的思路和途徑。

本文利用特異性靶向B7-H4 的siRNA 成功干擾了乳腺癌MCF-7和T47D細胞中B7-H4的表達，研究結(jié)果顯示，干擾B7-H4 的表達后，MCF-7 和T47D 細胞的增殖受到顯著抑制，發(fā)生G1/S 期阻滯并伴有cyclin D1 表達的降低，這與在肝癌[19]、結(jié)直腸癌[20]、胃癌[21]中的研究報道一致。此外，本實驗中干擾B7-H4表達后對2種乳腺癌細胞的凋亡無顯著影響，這與之前其他研究報道不符，如干擾B7-H4表達可以促進胃癌MGC-803 細胞[21]和結(jié)直腸癌HT-29 細胞凋亡[20]。B7-H4作為腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因子，可通過抑制腫瘤微環(huán)境中的CD8+T細胞的抗腫瘤作用來幫助腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究中，干擾的是乳腺癌細胞自身B7-H4 的表達，在體外培養(yǎng)環(huán)境中無法體現(xiàn)干擾B7-H4 表達對乳腺癌細胞腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細胞的影響，如CD8+T 細胞誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，這可能是本實驗中干擾B7-H4對乳腺癌細胞凋亡無直接影響的原因，也表明B7-H4的作用存在腫瘤特異性，即在不同類型腫瘤中的作用不一致，因此針對B7-H4在乳腺癌中的作用及其機制需要更廣泛的研究。

細胞異常增殖是惡性腫瘤的重要特征之一，若無有效控制，腫瘤細胞會逐漸侵犯和破壞其周圍的組織和器官，并向遠處組織器官轉(zhuǎn)移[22]。乳腺癌是由乳腺上皮細胞發(fā)生增殖失控、進而惡變形成，是全世界女性最常見的惡性腫瘤。細胞增殖涉及受到高度調(diào)控的一系列事件，在此過程中細胞中的遺傳信息被復(fù)制并最終分裂成兩個子細胞。標(biāo)志著細胞從G1期向S 期過渡的最關(guān)鍵事件是E2F 家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序的激活[23]，在G1末期，E2F家族的成員會刺激數(shù)百個基因的表達，促進DNA復(fù)制，并促進細胞周期的不可逆進程[24]。E2F 家族由8 個成員（E2F1～8）組成，成員可分為轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子。E2F1和E2F2是轉(zhuǎn)錄激活因子，他們驅(qū)動基因表達促進細胞從G1 期有序過渡到S 期，從而促進細胞增殖；E2F7 和E2F8 雖被歸類為“抑制型”E2F 成員，但與經(jīng)典的E2F 家族抑制因子不同，他們的表達與細胞的高增殖率相關(guān)[25]。本實驗中干擾乳腺癌細胞B7-H4 的表達后，MCF-7 和T47D 細胞中E2F1、E2F2、E2F7、E2F8 mRNA 表達水平都有不同程度的下調(diào)。不論是E2F家族的轉(zhuǎn)錄激活因子成員E2F1和E2F2還是E2F家族非典型抑制成員E2F7和E2F8，他們表達水平的下降與干擾B7-H4 表達導(dǎo)致的細胞周期阻滯及細胞增殖抑制的現(xiàn)象相一致。該結(jié)果為進一步探索B7-H4 在乳腺癌發(fā)生與發(fā)展的具體機制提供了研究方向，為下一步研發(fā)針對B7-H4的新治療方式奠定了初步實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，B7-H4無論是通過間接參與免疫調(diào)控亦或是直接促進腫瘤細胞進展，都表明它是腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的重要分子，干擾B7-H4 表達可下調(diào)cyclin D1和E2F家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，導(dǎo)致乳腺癌細胞的細胞周期阻滯，并抑制細胞增殖，對其凋亡無顯著影響。此研究為后續(xù)B7-H4 在乳腺癌的診斷和治療中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。當(dāng)然，本實驗的研究結(jié)果仍需進一步進行體內(nèi)實驗驗證。