王婭，李榮，姜子濤,2*，譚津，王穎，湯書華

(1.天津商業(yè)大學 生物技術(shù)與食品科學學院，天津 300134；2.天津天獅學院 食品工程學院，天津 301700)

凹唇姜(Boesenbergiarotunda(L.) Mansf.)，姜科凹唇姜屬[1]，其食用方法同我們所熟悉的鮮姜。凹唇姜又名泰國沙姜、甲猜，其根莖的外觀和手指很相像，因此也被稱作指姜，凹唇姜分布于泰國和印度尼西亞，我國云南、廣西等地也有大量種植。凹唇姜作為天然調(diào)味香辛料中的一種，在泰國、印度和中國等地的菜肴中很常見[2]，其藥用價值也非常高，在傳統(tǒng)藥物中用于治療胃病、風濕和皮炎等[3]。近年來，關(guān)于凹唇姜中的黃酮類[4-5]和多酚[6-7]已有部分報道。然而關(guān)于凹唇姜中的重要生物活性成分——凹唇姜精油(Boesenbergiarotunda(L.) Mansf. essential oil， BEO)，僅見作者在前文中報道了其對鮮切草魚肉氧化穩(wěn)定性的影響[8]。目前關(guān)于調(diào)味香辛料的研究報道較多，尤其是對香辛料精油的研究更為廣泛[9]。例如同為姜科的姜精油[10-12]、常用香辛料花椒精油[13]、草豆蔻精油[14]、肉桂精油和八角茴香精油[15]等。

為充分利用凹唇姜植物資源及為天然抗氧化劑的開發(fā)提供更多的可能，本研究首次利用超聲-微波輔助提取法探索了BEO的最佳提取工藝，利用單因素實驗及響應(yīng)面法探索和優(yōu)化其提取條件，以得到高得率的精油；以PG、BHT為陽性對照，通過化學法測定了BEO對DPPH、ABTS+、OH自由基的清除能力；進一步通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對BEO的化學成分進行了鑒定，并推測了BEO清除游離基活性的反應(yīng)機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮凹唇姜：購于廣州市；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS+)、過硫酸鉀：Sigma試劑公司；無水乙醇：天津市津東天正精細化學試劑廠；沒食子酸丙酯(PG)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)：天津市光復精細化學研究所；實驗用水均為利用上海Heal Force公司的超純水機制得的純凈水。

CW2000超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀 上海新拓微波公司；Trace 1310、TSQ 8000 Evo氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher公司；Lambda 25紫外可見分光光度計 珀金埃爾默儀器有限公司；AUY120萬分之一電子天平 日本島津公司；FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BEO的超聲-微波協(xié)同提取工藝

實驗原理：超聲-微波提取儀的發(fā)生器輸入一定功率的微波能量，超聲換能器輸入的超聲能量固定功率為50 W/40 kHz。與其他提取方法不同，該提取程序分為兩個階段：(1)微波破碎階段。該階段可在短時間內(nèi)使得溶劑和物料細胞內(nèi)水分吸收微波能后溫度迅速升高，連續(xù)的高溫會使物料內(nèi)部壓力超過植物細胞壁膨脹的能力，從而導致細胞破裂，使得精油從細胞內(nèi)流出。(2)提取階段。該階段在功率達到最大限度后，微波功率以維持恒定溫度(約100 ℃)，促使精油隨水蒸氣持續(xù)蒸出。由于水油結(jié)合，其沸點降低，在不到100 ℃便沸騰，使得高沸點的精油成分也能快速隨水蒸氣蒸發(fā)出來。超聲-微波輔助提取法相比于傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法，大大地縮短了提取時間，增加了精油的得率。

1.2.2 樣品的制備

將新鮮的凹唇姜根莖洗凈，晾干后切片，置于70 ℃烘箱烘干。用FW100高速萬能粉碎機粉碎后過40目篩，放入棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BEO微波破碎過程單因素實驗

1.2.3.1 實驗步驟

準確稱取0.050 g凹唇姜粉末，放入裝有300 mL蒸餾水的提取瓶中，轉(zhuǎn)移至微波提取器中。設(shè)置破碎過程的溫度、時間、功率進行實驗，該過程使得精油流出，量少而易溶于水中，然后將溶液過濾，得到水油混合物，冷卻至室溫后測定精油溶液的吸光度(n=3)。

1.2.3.2 單因素實驗

按照1.2.3.1的方法進行實驗，固定破碎溫度為96 ℃，破碎時間為3 min，比較不同微波破碎功率(400，500，600，700，800 W)對提取BEO破碎過程的影響；固定破碎功率為600 W，破碎溫度為96 ℃，比較不同微波破碎時間(1，2，3，4，5 min)對提取BEO破碎過程的影響；固定破碎功率為600 W，破碎時間為3 min，比較不同微波破碎溫度(90，92，94，96，98 ℃)對提取BEO破碎過程的影響。通過單因素實驗來探究破碎階段各因素對BEO吸光度的影響。

1.2.4 BEO響應(yīng)面優(yōu)化破碎過程工藝

根據(jù)1.2.3.2單因素實驗結(jié)果及Box-Behnken中心實驗設(shè)計原理，選取破碎功率、破碎時間和破碎溫度為考察因素并對其條件進行優(yōu)化設(shè)計，以BEO吸光度為響應(yīng)值，利用Box-Behnken進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平設(shè)計Table 1 The design of factors and levels of response surface test

1.2.5 BEO微波協(xié)同提取過程單因素實驗

1.2.5.1 實驗步驟

根據(jù)文獻[16]的方法，準確稱取10 g的凹唇姜粉末，將其置于500 mL的提取瓶中，按照不同料液比加入蒸餾水。并在以上所得到的最佳微波破碎的程序條件下，設(shè)置一定提取功率并固定提取溫度為100 ℃進行實驗，將所得精油用無水硫酸鈉干燥后，再用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，置于棕色瓶中，稱量并按公式(1)計算BEO得率。

(1)

1.2.5.2 單因素實驗

按照1.2.5.1的方法進行實驗，固定料液比為1∶15(g/mL)，比較不同功率(400，500，600，700，800 W)隨著提取時間的延長對BEO得率的影響；固定提取功率為600 W，提取時間為25 min，比較不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL)對BEO得率的影響。每5 min收集一次BEO，計算BEO得率，直至BEO得率不再變化為止。

1.2.6 化學法測定BEO清除游離基活性

BEO分別與DPPH·、ABTS+·、·OH反應(yīng)，以PG、BHT為陽性對照，參考郝文鳳等[17]的實驗方法，通過計算IC50值比較BEO清除自由基能力的強弱。

1.2.6.1 清除DPPH·檢測

用乙醇配制濃度為1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 g/L的BEO溶液及2.0 g/L的BHT、PG溶液分別稀釋到5個合適梯度作為樣品溶液。向一系列25 mL比色管中分別加入2.0 mL不同濃度的樣品溶液和等體積1.0×10-4mol/L的DPPH·溶液，混勻后于暗處放置30 min，以95%乙醇溶液作參比溶液，測定517 nm處的吸光值A(chǔ)。采用同樣的方法測定樣品溶液2.0 mL與2.0 mL 95%乙醇溶液混合后在517 nm處的吸光值A(chǔ)0。再測定2.0 mL DPPH·溶液與2.0 mL 95%乙醇混合液在517 nm處的吸光值A(chǔ)1。實驗各平行3次，按公式(2)計算其清除率。最后通過線性回歸方程得出BEO、PG、BHT清除DPPH·的IC50值。

(2)

1.2.6.2 清除ABTS+·檢測

配制7.4 mmol/L的ABTS+溶液與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，搖勻后于室溫下避光保存16 h。用無水乙醇稀釋至吸光度在0.68～0.72之間(734 nm處)即為ABTS+·工作液。

用乙醇配制濃度為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g/L的BEO溶液及2.0 g/L的BHT、PG溶液分別稀釋到5個合適梯度為樣品溶液。準確移取6.0 mL ABTS+·工作液和 2.0 mL不同濃度的樣品液至一系列25 mL比色管中，搖勻后避光反應(yīng)2.5 h，于734 nm處測定各管的吸光度A。采用同樣的方法測定樣品溶液2.0 mL與5.88 mL 95%乙醇溶液及0.12 mL蒸餾水混合后在517 nm處的吸光值A(chǔ)0。再測定6.0 mL ABTS+·溶液與2 mL 95%乙醇混合后在517 nm處的吸光值A(chǔ)1。實驗各平行3次，按公式(2)計算其清除率。最后通過線性回歸方程得出BEO、PG、BHT清除ABTS+·的IC50值。

1.2.6.3 清除·OH檢測

用乙醇配制濃度為0.4×10-6，0.8×10-6，1.2×10-6，1.6×10-6，2.0×10-6g/L的精油樣品溶液和2.0 g/L的BHT、PG溶液并分別稀釋到5個合適梯度作為樣品溶液。按順序準確量取0.3 mL 0.4 mol/L的結(jié)晶紫溶液、1.2 mL 30 mmol/L硫酸亞鐵銨溶液、0.4～2.0 mL 1×10-6g/L樣品溶液和0.6 mL 40 mmol/L雙氧水至一系列25 mL離心管中，分別用檸檬酸緩沖液定容至10 mL，混勻后暗處放置30 min，分別在波長580 nm處測其吸光度As。以同樣的方法，測定不加入樣品溶液時的吸光度Ab。再測定不加入樣品溶液和雙氧水時的吸光度A0；實驗各平行3次，按公式(3)計算其清除率。最后通過線性回歸方程得出BEO、PG、BHT清除·OH的IC50值。

(3)

1.2.7 GC-MS分析

根據(jù)參考文獻[14]的方法并作一定修改對GC-MS的色譜及質(zhì)譜條件進行設(shè)置。色譜條件：采用程序升溫控制柱箱溫度，50～140 ℃(3 ℃/min)，140～185 ℃(10 ℃/min)，185～230 ℃(3 ℃/min)，230～280 ℃(20 ℃/min)，最后在280 ℃下恒溫10 min。載氣(He)流速1.0 mL/min，進樣量0.4 μL，分流比60∶1，質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)，電子束能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～450 m/z。以C8～C40烷烴標準溶液計算保留指數(shù)。分析結(jié)束后，利用系統(tǒng)自帶的Mainlib Library和Replib Library數(shù)據(jù)庫結(jié)合保留指數(shù)對精油成分定性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019軟件作圖，采用Design-Expert響應(yīng)面軟件對BEO提取的相關(guān)因素進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 BEO微波破碎過程單因素實驗

按照1.2.3的方法進行實驗，得到破碎功率、破碎時間和破碎溫度對BEO吸光度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 單因素對BEO破碎過程的影響Fig.1 The effect of each single factor on the crushing process of BEO

由圖1中a可知，BEO吸光度的變化趨勢是先增加后降低，當功率增加到600 W時，其吸光度達到最大值，再增加微波功率吸光度反而減小。這可能是由于較高的微波功率可使細胞內(nèi)部快速升溫，以致其迅速破裂，精油幾乎全部流出[18]。繼續(xù)增加微波功率，精油的溶出趨于平衡，且過高的提取功率使揮發(fā)性化合物更容易損失，并導致生物活性化合物降解[19-20]。因此，BEO微波破碎過程的最佳破碎功率為600 W。

由圖1中b可知，在1～3 min內(nèi)，隨著時間的增加，BEO溶液的吸光度快速增加，當破碎時間在3 min時，吸光度達到最大值，其原因可能是微波輻射導致植物細胞壁快速破裂，從而在更短的時間內(nèi)提高提取效率[21]，而隨著時間延長，精油幾乎全部流出，提取后期精油量不再增加。因此，BEO最適宜的微波破碎時間為3 min，而后期略有下降是由于精油易揮發(fā)的特點，也會存在一些損失[22]，使得吸光度有減小的趨勢。

由圖1中c可知，隨著破碎溫度的增加，吸光度逐漸增加，在溫度達到96 ℃時吸光度達到最大值，而再升高溫度，吸光度值幾乎不再增加。說明溫度的升高有利于細胞內(nèi)部的液體揮發(fā)，使得內(nèi)部壓強升高，從而使得精油大量流出。當精油完全流出后，吸光度值不再增加。

2.2 BEO響應(yīng)面優(yōu)化破碎過程設(shè)計及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計實驗結(jié)果

根據(jù)1.2.4的方法并結(jié)合單因素實驗結(jié)果設(shè)計響應(yīng)面實驗，以BEO吸光度為響應(yīng)值，以破碎功率(A)、破碎時間(B)、破碎溫度(C)為考察因素，依據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理生成17組實驗，精確實驗結(jié)果并分析誤差(n=3)。設(shè)計方案及實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸模型的方差分析

回歸模型方差分析結(jié)果及顯著性檢驗結(jié)果見表3。根據(jù)Design-Expert軟件分析，經(jīng)微波破碎功率、破碎時間、破碎溫度擬合得到的二次多項回歸方程式為：Y=0.47-0.022A+7.25×10-3B-0.021C+3.750×10-3AB-2.5×10-3AC-0.010BC-0.047A2-0.060B2-0.040C2。

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic model

由表3可知，回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9449，由方差分析可知，回歸方程模型極顯著(P<0.01)，而失擬項不顯著，表明該方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，擬合度較好，實驗設(shè)計合理。由F值可知，各因素對響應(yīng)值顯著的排序為破碎功率(A)>破碎溫度(C)>破碎時間(B)。

2.2.3 各因素之間的交互作用分析

通過Design-Expert軟件模擬得到各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖，見圖2。

a.破碎時間與破碎功率

b.破碎溫度與破碎功率

c.破碎溫度與破碎時間

由圖2可知，微波破碎功率(A)、破碎時間(B)、破碎溫度(C)三者響應(yīng)值的影響可以通過3D曲面圖直觀地看出。由圖2中a可知，破碎功率所影響的吸光度值變化更加陡峭，說明破碎功率對BEO吸光度的影響更為顯著，且根據(jù)方差分析結(jié)果中的顯著性分析和響應(yīng)曲面圖可以看出，破碎功率與破碎時間的交互作用對BEO吸光度的影響極顯著；由圖2中b可知，破碎功率與破碎溫度的交互作用對BEO吸光度的影響不顯著；由圖2中c可知，破碎溫度所影響的吸光度值變化更加陡峭，說明破碎溫度對BEO吸光度的影響更為顯著，破碎溫度與破碎時間的交互作用對BEO吸光度的影響極顯著。

2.2.4 BEO破碎過程最佳條件的確定

由響應(yīng)面優(yōu)化實驗?zāi)Ｐ偷玫紹EO的最優(yōu)破碎條件為：破碎功率600.32 W，破碎溫度96.42 ℃，破碎時間180.50 s。預(yù)測在此最優(yōu)條件下BEO溶液的吸光度為0.483。為驗證模型的可靠性，并考慮實驗可操作性，以修正后的破碎工藝參數(shù)：功率600 W，時間180 s，溫度96 ℃，進行3次重復實驗，測定結(jié)果BEO溶液的吸光度平均值為0.465，與響應(yīng)面回歸方程理論值結(jié)果接近，相對誤差為-3.73%，由此結(jié)果可知，響應(yīng)面優(yōu)化的BEO超聲-微波輔助水蒸氣蒸餾法破碎條件可靠，該破碎工藝具有科學價值。

2.3 化學法測定BEO的抗氧化能力

按照1.2.6的實驗方法進行實驗，結(jié)果見圖3～圖5和表4。

圖3 各樣品對DPPH自由基的清除率Fig.3 The scavenging rates of each sample on DPPH radicals

圖4 各樣品對ABTS+自由基的清除率Fig.4 The scavenging rates of each sample on ABTS+ radicals

圖5 各樣品對OH自由基的清除率Fig.5 The scavenging rates of each sample on OH radicals

由圖3～圖5可知，隨著BEO以及陽性對照組濃度的增大，其對DPPH、ABTS+、OH自由基的清除率增大，表明3組樣品的自由基清除能力也在逐漸增強。

通過對圖3～圖5中方程進行線性擬合得到BEO、PG、BHT對清除DPPH、ABTS+、OH自由基的IC50值，結(jié)果見表4。

表4 化學法評價BEO抗氧化能力Table 4 The antioxidant capacity of BEO evaluated by chemical method

由表4可知，BEO和陽性對照PG、BHT對清除DPPH自由基的IC50分別為1.82，1.8×10-3，3.83×10-2mg/mL，表明BEO具有一定的清除DPPH自由基能力，但其IC50遠大于PG、BHT，表明其清除能力較PG、BHT弱；BEO、PG、BHT對清除ABTS+自由基的IC50分別為12.89，2.09×10-3，6.9×10-3mg/mL，表明BEO具有一定的清除ABTS+自由基能力，但其IC50仍遠大于PG、BHT，表明其清除能力較PG、BHT弱；BEO、PG、BHT對清除OH自由基的IC50分別為0.92×10-6，0.72×10-3，1.10×10-3mg/mL，表明BEO具有較強的清除OH自由基能力，其IC50遠小于PG、BHT，表明其清除能力較PG、BHT強。由數(shù)據(jù)對比可知，BEO對自由基清除能力強弱比較為·OH>DPPH·>ABTS+·。

2.4 BEO化學成分GC-MS分析結(jié)果

按照1.2.7 的程序條件進行實驗，全掃描得到的GC-MS總離子流圖見圖6，通過標準譜庫比對結(jié)合保留指數(shù)分析檢測BEO的化學成分，結(jié)果見表5。

圖6 BEO的GC-MS總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of BEO

表5 BEO化學成分的GC-MS檢測結(jié)果Table 5 The chemical compositions of BEO analyzed by GC-MS

由表5可知，從BEO中共分離檢測出29種化學成分，占總精油含量的97.48%，主要為萜類化合物，主要成分有樟腦(31.47%)、香葉醇(16.29%)、1,8-桉葉素(8.11%)、香葉醛(6.83%)、反式桂皮酸甲酯(5.82%)、異龍腦(4.15%)、β-羅勒烯(3.49%)、(Z)-檸檬醛(2.78%)、油醇(2.56%)、α-羅勒烯(2.50%)等。根據(jù)化學成分的結(jié)構(gòu)，可以初步分析清除3種自由基強弱的清除機理。Nie等[23]研究得出α-松油醇、香葉醇具有較強的清除DPPH自由基的能力，其機理是由于α-松油醇、香葉醇中含有羥基結(jié)構(gòu)，且環(huán)狀結(jié)構(gòu)對羥基清除DPPH自由基活性具有促進作用(反應(yīng)歷程見圖7中a)；對于BEO清除ABTS+自由基的能力，可能是由于1,8-桉葉素和α-蒎烯氧化物等具有特殊的環(huán)醚結(jié)構(gòu)的作用[24-25](反應(yīng)歷程見圖7中b)，而BEO對該自由基表現(xiàn)出最弱清除能力的原因可能是BEO中的大部分物質(zhì)遇到ABTS+自由基時，不容易提供氫而發(fā)生反應(yīng)[26]；對于清除OH自由基，由于成分主要為萜類物質(zhì)，且化學成分中萜烯類化合物較多，有α-蒎烯、莰烯、月桂烯、β-羅勒烯、α-羅勒烯、葎草烯、α-法呢烯等，其分子中都含有雙鍵以及碳碳雙鍵的共軛體系，因此易與OH自由基發(fā)生加成反應(yīng)形成二級基團而清除大量OH自由基[27-28](反應(yīng)歷程見圖7中c)。因此，從數(shù)量上以及結(jié)構(gòu)上均可以說明BEO清除OH自由基的能力最強。

圖7 BEO清除DPPH、ABTS+、OH自由基反應(yīng)歷程Fig.7 The reaction process of BEO scavenging DPPH, ABTS+ and OH radicals

3 結(jié)論

本實驗通過單因素實驗和響應(yīng)面法利用超聲-微波輔助提取法首次探索BEO的最佳提取工藝，建立了影響精油破碎過程的3個主要因素(微波破碎功率、破碎時間和破碎溫度)的回歸模型。同時，在此程序下，通過單因素實驗得到在料液比為1∶15(g/mL)、提取功率為500 W、提取時間為25 min時，精油得率最高，達2.86%。BEO通過化學法對比天然人工合成抗氧化劑PG、BHT得到其對3種自由基(DPPH、ABTS+、OH自由基)的清除能力，結(jié)果表明，BEO清除DPPH、ABTS+自由基能力較PG、BHT弱，而清除OH自由基能力較PG、BHT強，在抗氧化活性方面具有很高的研究價值。且通過GC-MS分析鑒定出29種化合物，其主要成分為樟腦(31.47%)、香葉醇(16.29%)、1,8-桉葉素(8.11%)、香葉醛(6.83%)、反式桂皮酸甲酯(5.82%)、異龍腦(4.15%)、β-羅勒烯(3.49%)。從化學成分可以初步分析BEO對3種自由基表現(xiàn)出不同活性的機理。文章首次探索BEO的提取工藝，此方法簡單方便、綠色且精油得率高，為今后BEO的相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，同時對其清除游離基活性進行評價以及成分分析，有益于凹唇姜這一藥食同源的天然植物資源的開發(fā)利用，并為天然抗氧化劑的開發(fā)提供了理論參考。