王穎，邱勇，王隆，肖揚(yáng)，黃浩特，羅愛民

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065)

醬香型白酒，是用高溫大曲作為糖化發(fā)酵劑經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵釀制而成[1]。高溫大曲的原料是小麥，經(jīng)粉碎后加水和曲母踩成曲坯，在室內(nèi)保溫培養(yǎng)使微生物生長繁殖，以產(chǎn)生釀酒中所需要的多種酶類風(fēng)味成分，再經(jīng)風(fēng)干、儲存，即成高溫大曲[2-3]。由于發(fā)酵倉內(nèi)位置、溫度、水分的差異，使得大曲形成了3種不同顏色和風(fēng)格的高溫大曲：黑、白和黃曲，3種類型的大曲一般通過水分、顏色、氣味等感官評估來區(qū)分[4-5]。成品大曲是由這3種大曲按照一定的比例混合而成。

大曲富含多種酶類，大曲中的微生物利用水解酶系將蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉和纖維素等原料分解成小分子物質(zhì)，供微生物生長利用[6-7]。另外，有一些代謝產(chǎn)物是白酒中香味物質(zhì)或者為香味物質(zhì)提供前驅(qū)物質(zhì)，這些代謝產(chǎn)物是醬香型白酒風(fēng)格特征的來源[8]。從醬香型大曲中共確定了259種揮發(fā)性成分，其中酯類和醇類最多，其次包括吡嗪類、醛類、酮類、酸類、酚類、呋喃類、其他雜環(huán)類、內(nèi)酯類、醚類、含硫類、芳香烴類、脂肪烴等[9]。目前，醬香型成品大曲的理化、代謝產(chǎn)物、微生物群落等報道很多，但對黑、白和黃曲的理化性質(zhì)、揮發(fā)性成分特征研究較少。因此，本實驗測定了兩個產(chǎn)區(qū)3種大曲的理化指標(biāo)和主要酶系，明確3種大曲的基本性質(zhì)差異，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對兩個醬香型產(chǎn)區(qū)的黃、黑、白曲中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測，對揮發(fā)性成分進(jìn)行初步鑒定，探討3種大曲之間的成分差異，為高溫大曲的制備提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

高溫大曲：取自赤水河上游核心產(chǎn)區(qū)和赤水河中下游核心產(chǎn)區(qū)，分別命名為M和L，產(chǎn)區(qū)對應(yīng)的高溫黃曲、黑曲、白曲，分別編號為MY、MB、MW和LY、LB、LW。

1.2 試劑

鹽酸、硫酸銅、氫氧化鈉、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、無水乙酸鈉、溴甲酚綠、甲基紅、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、福林試劑、干酪素、L-酪氨酸、乙酸鈉、可溶性淀粉、DNS、碘、碘化鉀、無水乙醇、己酸、硫酸和甲醛：均為國產(chǎn)分析純；2-庚酮：色譜純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；UV56紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；DSQ9000氣質(zhì)聯(lián)用儀 Thermo Scientific公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 大曲理化指標(biāo)測定

大曲的水分、酸度、還原糖、氨基酸態(tài)氮、酯化力、糖化力和液化力的測定參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《釀酒大曲通用分析方法》[10]。水分采用恒重法測量，數(shù)據(jù)以百分含量表示；酸度采用酸堿中和，以pH值指示終點(diǎn)的點(diǎn)位滴定法，測定大曲的酸度，以mmol/10 g為單位計；氨基酸態(tài)氮利用氨基酸的兩性作用的原理來計算，單位為g/kg；酯化力是按每50 g大曲在35 ℃經(jīng)過7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個單位，符號為U，以mg/(50 g·7 d)為單位表示；糖化力在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g大曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個單位，符號為U，單位是mg/(g·h)；液化力在35 ℃，pH 4.6條件下，1 g絕干曲l h能液化淀粉的克數(shù)為一個單位，符號為U，以g/(g·h)表示。

1.4.2 大曲水解酶測定

蛋白酶測定方法參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》[11]，一個單位蛋白酶活性(U)定義為在 40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量。糖化酶測定方法采用DNS法[12]，一個單位的糖化酶活性(U)定義為在40 ℃，pH 4.6條件下每小時水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量。

1.4.3 頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析代謝產(chǎn)物

分別取6種大曲樣品2 g與10 μL 2-庚酮(10 mg/L)混合作為內(nèi)標(biāo)，置于20 mL固相微萃取儀采樣瓶中，60 ℃水浴15 min，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex萃取頭的手動進(jìn)樣器，在60 ℃頂空萃取30 min取出，并立即進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230 ℃，熱解吸3 min。色譜柱：DB-Wax(60.0 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至145 ℃，然后以 15 ℃/min升至230 ℃，并保持5 min，氦氣以 1 mL/min的恒定流速用作載氣。質(zhì)譜儀以電子碰撞模式操作，電子能量設(shè)置為70 eV，掃描范圍為33～400 m/z。使用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST)和Wiley數(shù)據(jù)庫鑒定每種化合物。選擇正負(fù)匹配度大于800的化合物。根據(jù)內(nèi)標(biāo)峰面積與揮發(fā)性物質(zhì)峰面積的比值，計算出大曲揮發(fā)風(fēng)味的相對濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲的理化指標(biāo)主要酶系

黑曲、白曲和黃曲按照一定比例混合形成成熟高溫大曲，大曲作為糖化發(fā)酵劑包含多種酶類。高溫大曲的水分、酸度、氨基酸態(tài)氮、液化力、酯化力、糖化力等是評價大曲質(zhì)量好壞的常用理化指標(biāo)。黑曲、白曲和黃曲的理化指標(biāo)和主要酶系測定結(jié)果見表1。

表1 大曲理化指標(biāo)與主要酶系測定結(jié)果Table 1 The determination results of physical and chemical indexes and main enzymes of koji

水分在制曲過程中與菌的生長和酶的生成密切相關(guān)，成品曲水分一般不高于13%，如果大曲水分過高，大曲容易二次發(fā)霉，使質(zhì)量下降[13]；如果水分過低，很容易影響大曲中酶的活性和微生物的正常生長。實驗測定的兩產(chǎn)區(qū)的3種大曲中，水分都符合低于13%的標(biāo)準(zhǔn)，且黑曲水分含量都最低；此外，M產(chǎn)區(qū)大曲的水分普遍高于L產(chǎn)區(qū)大曲的水分，這可能與它們的地理環(huán)境差異有關(guān)。

大曲的酸度主要來源于生酸微生物降解蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等物質(zhì)和有機(jī)酸代謝產(chǎn)酸，是微生物綜合作用的結(jié)果[14]。實驗結(jié)果表明兩個產(chǎn)區(qū)的大曲中黑曲、白曲和黃曲酸度大小皆為：黑曲>白曲>黃曲，其中L產(chǎn)區(qū)黑曲的酸度最高，達(dá)到3.75 mmol/10 g。

大曲中氨基酸態(tài)氮的含量與產(chǎn)酸微生物的代謝和蛋白酶活力有著緊要聯(lián)系，它反映了大曲中蛋白酶的活力以及微生物的種類和數(shù)量。兩個產(chǎn)區(qū)的3種大曲中的氨基酸態(tài)氮皆為黑曲最低，其中MB和LB分別為1.26，2.59 g/kg。M產(chǎn)區(qū)的3種大曲中，黃曲的氨基酸態(tài)氮水平最高，達(dá)到2.22 g/kg；L產(chǎn)區(qū)為白曲最高，達(dá)到3.55 g/kg。蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為小分子多肽和氨基酸，使得大曲的酸度升高，但實際上兩個酒廠的白曲的蛋白酶活性較高，但酸度不高，說明生成的氨基酸參與了微生物的生長代謝反應(yīng)，生成其他物質(zhì)，如酯類物質(zhì)。

醬香型大曲中富含淀粉、脂肪以及蛋白質(zhì)等成分，大曲中的微生物能夠利用這些原料降解成小分子進(jìn)而代謝產(chǎn)酸，為白酒產(chǎn)酯生香提供前體物質(zhì)，因此大曲中的蛋白酶、糖化酶等主要酶類的酶活力高低也影響了大曲的質(zhì)量。兩個產(chǎn)區(qū)3種大曲的中性蛋白酶活性都有白曲>黃曲>黑曲的趨勢，M產(chǎn)區(qū)大曲的蛋白酶活性普遍高于L產(chǎn)區(qū)蛋白酶活性，其中 M產(chǎn)區(qū)和L產(chǎn)區(qū)白曲的中性蛋白酶活力分別為34.99 U/g和33.5 U/g，這對蛋白質(zhì)的利用有著積極的作用，生成的大量氨基酸可以進(jìn)一步合成氨以及參加美拉德反應(yīng)，與柳習(xí)月報道的結(jié)果一致。兩產(chǎn)區(qū)的3種大曲的糖化酶都呈現(xiàn)白曲>黃曲>黑曲的趨勢，M產(chǎn)區(qū)和L產(chǎn)區(qū)白曲的糖化酶活力分別為1075.90 U/g和849.11 U/g，說明白曲有很強(qiáng)的糖化能力，能夠更好地實現(xiàn)淀粉的降解轉(zhuǎn)化。大曲中糖化酶、蛋白酶等活力高低以及產(chǎn)酸微生物與大曲酸度緊密相關(guān)，大曲中的產(chǎn)酸微生物代謝產(chǎn)酸會導(dǎo)致大曲酸度較高，酶活力高的大曲酸度會偏高，而實際上糖化酶、蛋白酶活力最高的MW和LW的酸度并不高，這說明生成的酸可能參與代謝反應(yīng)成其他物質(zhì)。

大曲的酯化力和糖化力是受工藝控制參數(shù)影響最大的兩個指標(biāo)，并且與產(chǎn)品風(fēng)格密切相關(guān)[15]。兩個產(chǎn)區(qū)的3種大曲的酯化力高低都有白曲>黃曲>黑曲的趨勢。M產(chǎn)區(qū)和L產(chǎn)區(qū)白曲的酯化力分別是253.88，110.73 mg/(50 g·7 d)，說明白曲轉(zhuǎn)化合成酯的能力更高，并且M產(chǎn)區(qū)3種大曲的酯化力均高于L產(chǎn)區(qū)的相對應(yīng)的3種大曲，這可能與兩個產(chǎn)區(qū)的地理位置差異有一定關(guān)系；兩個產(chǎn)區(qū)的糖化力都呈現(xiàn)白曲>黃曲>黑曲的趨勢。M產(chǎn)區(qū)和L產(chǎn)區(qū)白曲的糖化力分別是588.98 mg/(g·h)和408.00 mg/(g·h)；兩個產(chǎn)區(qū)的3種大曲的液化力都很低，在測定的時候差異并不明顯。

2.2 兩產(chǎn)區(qū)3種大曲的揮發(fā)性成分分析

2.2.1 不同大曲揮發(fā)性成分組成

將所有物質(zhì)分為吡嗪類、酸類、醛類、醇類、酮類、酯類六大類，根據(jù)化合物的濃度繪制熱圖，見圖1。

圖1 3種大曲揮發(fā)性成分組成熱圖Fig.1 Heat map of volatile compositions of three kinds of koji

由圖1可知，酯類、醇類、酸類占主導(dǎo)地位。酯類中，主要是棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、油酸乙酯、油酸甲酯等高沸點(diǎn)酯，白曲的酯類濃度最高。油酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯是對白酒的香味有一定的貢獻(xiàn)，但過量會引起酒體渾濁。

黃曲的醇類物質(zhì)濃度比黑曲和黃曲更高，醇類成分中2,3-丁二醇、苯乙醇，苯甲醇的含量較高，苯甲醇具有茉莉花油、風(fēng)信子的芳香味[16]；黃曲的酸類成分濃度略低于黑曲，酯類成分濃度低于白曲。白曲的酸類揮發(fā)性成分濃度相較于其他類別更高，酸類物質(zhì)中乙酸、異戊酸含量較高，乙酸可通過酯化反應(yīng)與醇進(jìn)一步合成為酯如乙酸乙酯等，對白酒的特殊風(fēng)味做出了巨大貢獻(xiàn)[17-19]。黑曲的醛類成分濃度比白曲和黃曲的更高些，其中壬醛、苯乙醛的濃度最高，壬醛稀釋時則呈現(xiàn)出玫瑰和柑橘樣的香氣；另外，黑曲的酸類成分也較高。

6個樣本的吡嗪檢測出三甲基吡嗪和四甲基吡嗪，這兩種物質(zhì)認(rèn)為是醬香型白酒主要的醬香味成分[20]。此外，四甲基吡嗪是白酒中的健康因子以及主要功能性成分之一，賦予白酒有益健康的功能[21-22]。在兩個產(chǎn)區(qū)的3種大曲中，都存在白曲的吡嗪濃度最高的現(xiàn)象，黃曲次之，黑曲最低，這與柳習(xí)月報道的結(jié)果一致。其中四甲基吡嗪濃度高于三甲基吡嗪。四甲基吡嗪的前體物質(zhì)乙偶姻是提高四甲基吡嗪含量的重要方式之一[23-24]，白曲中乙偶姻的濃度是3種大曲中濃度最高，3種大曲的乙偶姻濃度與四甲基吡嗪濃度的趨勢一致。樣品大曲還檢出很多其他微量物質(zhì)，這些物質(zhì)雖然濃度低，但對白酒的風(fēng)味前體物質(zhì)和白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成也至關(guān)重要。

2.2.2 大曲揮發(fā)性成分多樣性差異

圖2 不同大曲揮發(fā)性成分多樣性主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.2 The principal coordinate analysis results of diversity of volatile components of different kinds of koji

6種大曲一共檢測出48種揮發(fā)性成分，相同的揮發(fā)性成分有18種。兩個產(chǎn)區(qū)的白曲揮發(fā)性成分最多，其中LW有37種，MW有38種；黑曲最少，其中LB有28種，MB有31種。

由圖2可知，同一產(chǎn)區(qū)的3種大曲差異很大；不同產(chǎn)區(qū)的黑曲差異最大，白曲和黃曲差異較小。同產(chǎn)區(qū)的黃曲距離接近，說明雖然產(chǎn)區(qū)不同，但同種香型的高溫黃曲在揮發(fā)性成分多樣性上的差異遠(yuǎn)小于同一產(chǎn)區(qū)的黑、白、黃曲之間的差異；另外，不同產(chǎn)區(qū)的白曲距離也比較接近。此外，不同產(chǎn)區(qū)的黑曲距離很遠(yuǎn)，說明不同產(chǎn)區(qū)的黑曲在揮發(fā)性成分多樣性上存在較大差異。

2.2.3 兩產(chǎn)區(qū)的大曲揮發(fā)性成分類別差異

a.L產(chǎn)區(qū)與M產(chǎn)區(qū)的黑曲濃度

b.L產(chǎn)區(qū)與M產(chǎn)區(qū)的黃曲濃度

c.L產(chǎn)區(qū)與M產(chǎn)區(qū)的白曲濃度

d.L產(chǎn)區(qū)與M產(chǎn)區(qū)大曲揮發(fā)性成分類別主坐標(biāo)分析結(jié)果

將揮發(fā)性成分分為吡嗪類、酸類、醛類、醇類、酮類、酯類六大類，計算各類的濃度，以類別為橫坐標(biāo)繪制柱狀圖，分別對比不同產(chǎn)區(qū)的3種大曲的差異(見圖3中a，b，c)；對樣品揮發(fā)性成分的醇類、酸類、醛酮類、酯類和吡嗪類進(jìn)行主坐標(biāo)分析(見圖3中d)。

就黑曲而言，兩產(chǎn)區(qū)的酯類、酮類和吡嗪類沒有明顯差距，而M產(chǎn)區(qū)的醛類濃度遠(yuǎn)高于L產(chǎn)區(qū)黑曲，醛類成分以苯乙醛為代表，L產(chǎn)區(qū)黑曲的酸類成分濃度是M產(chǎn)區(qū)的2倍，其中乙酸、異戊酸為主要酸類成分。就黃曲而言，兩產(chǎn)區(qū)中L產(chǎn)區(qū)的吡嗪濃度稍高于M產(chǎn)區(qū)，M產(chǎn)區(qū)的酯類物質(zhì)濃度比L產(chǎn)區(qū)更多一些，其余類別的成分兩產(chǎn)區(qū)相近，無明顯差異。就白曲而言，L產(chǎn)區(qū)的吡嗪濃度近似是M產(chǎn)區(qū)的2倍，且L產(chǎn)區(qū)白曲的吡嗪含量是3種大曲濃度最高。

由圖3中d可知，不同產(chǎn)區(qū)的白曲距離最近，黑曲距離最遠(yuǎn)，說明不同產(chǎn)區(qū)的白曲的揮發(fā)性成分中不同類別物質(zhì)的含量比較相似，黑曲在類別上沒有明顯的相關(guān)性。同一產(chǎn)區(qū)的3種大曲的距離較遠(yuǎn)，說明同一產(chǎn)區(qū)的3種大曲在類別上差異明顯，可能是不同產(chǎn)區(qū)的制曲工藝不同以及3種大曲在制曲過程中發(fā)酵倉內(nèi)位置、溫度、水分的差異造成的。

3 結(jié)論

不同產(chǎn)區(qū)的同一大曲和同一產(chǎn)區(qū)的3種大曲在理化指標(biāo)、主要酶系和揮發(fā)性成分上都有一定差異。理化性質(zhì)表明，L產(chǎn)區(qū)的水分偏低，酸度較高，3種大曲的酸度都存在黑曲最高，黃曲最低的特征。對于不同產(chǎn)區(qū)同一大曲而言，M產(chǎn)區(qū)的中性蛋白酶活力、糖化酶活力比L產(chǎn)區(qū)的更高。白曲的中性蛋白酶和糖化酶活力最高，兩個產(chǎn)區(qū)的糖化力和酯化力都呈現(xiàn)白曲>黃曲>黑曲的趨勢。由于糖化力和酯化力受工藝參數(shù)影響最大，造成不同產(chǎn)區(qū)的3種大曲的糖化力和酯化力差異較大。揮發(fā)性成分結(jié)果表明，在大曲的揮發(fā)性成分多樣性中，不同產(chǎn)區(qū)的黃曲、白曲的差異都并不明顯，黑曲差異較大。在大曲的揮發(fā)性成分類別差異中，不同產(chǎn)區(qū)的黑曲和黃曲都有明顯的差異，白曲的差異相對較小。白曲的四甲基吡嗪、乙偶姻含量比黑曲和黃曲高。通過對不同產(chǎn)區(qū)的黑、白、黃曲的差異性進(jìn)行分析，有助于提高大曲的穩(wěn)定性，為高溫大曲的生產(chǎn)理論及工藝的制定提供理論依據(jù)，促進(jìn)成品大曲的穩(wěn)定生產(chǎn)，從而提升酒體的質(zhì)量。