朱世杰 寇云芳 吳云 田維毅 周凌云 羅亞非 唐中生 陳萬浩 段學(xué)清

摘要 目的：探究黔產(chǎn)天麻通過調(diào)節(jié)腦-腸軸對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：選取成年雄性大鼠60只，采用血管內(nèi)刺破法建立SAH模型，并隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、天麻低、中、高濃度組，5組分別給予相應(yīng)處理1周后進(jìn)行造模，24 h后取材，利用HE染色觀察病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色、蛋白免疫印跡檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因連鎖多態(tài)區(qū)（5-HTTLPR）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）表達(dá)情況。結(jié)果：與模型組比較，天麻低、中、高濃度組大鼠腦和空腸的病理學(xué)變化較輕，但存在神經(jīng)細(xì)胞不同程度的核固縮、變性的情況，空腸絨毛存在脫落、上皮下間隙擴(kuò)大、毛細(xì)血管擴(kuò)張等病理學(xué)變化;與模型組比較，假手術(shù)組、天麻中濃度組和高濃度組大鼠海馬和空腸中5-HTTLPR、CGRP的表達(dá)顯著性提高，IL-4表達(dá)降低顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P <0.01），與假手術(shù)組比較，天麻高、中濃度組大鼠海馬和空腸中5-HTTLPR、CGRP的表達(dá)提高及IL-4表達(dá)降低顯著（均 P <0.01）。結(jié)論：天麻通過腦-腸軸調(diào)節(jié)5-HTTLPR、CGRP、IL-4因子的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)腦出血大鼠腦和腸道的保護(hù)作用，尤以天麻高濃度溶液的效果更為顯著。

關(guān)鍵詞 腦-腸軸;腦出血;天麻;中藥;炎癥;機(jī)制;損傷;大鼠

Mechanism of Gastrodiae Rhizoma in Protecting Rats with Cerebral Hemorrhage through Brain-Gut Axis

ZHU Shijie1，KOU Yunfang1，WU Yun2，TIAN Weiyi1，ZHOU Lingyun3，LUO Yafei1，TANG Zhongsheng1，CHEN Wanhao1，DUAN Xueqing1

（1 Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China; 2 Zunyi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zunyi 563000，China; 3 The Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China）

AbstractObjective： To explore the efficacy and mechanism of Gastrodiae Rhizoma produced in Guizhou Province in protecting the rats with cerebral hemorrhage by regulating brain-gut axis. Methods： Sixty adult male rats were randomly assigned into a sham operation group，a model group，and low-，medium-，and high-dose Gastrodiae Rhizoma groups.After corresponding treatments for a week，the model was established.After 24 h，the samples were collected for observation of the pathological changes by hematoxylin-eosin（HE） staining.Immunohistochemistry and Western blotting were employed to determine the expression of the neurotransmitters serotonin-transporter-linked promoter region（5-HTTLPR），calcitonin gene-related peptide（CGRP），and interleukin-4（IL-4）. Results： Compared with the model group，the Gastrodiae Rhizoma groups showed slight pathological changes of brain and jejunum，karyopyknosis and degeneration of nerve cells，and shedding，subepithelial space enlargement，and capillary dilatation of jejunal villi.Compared with the model group，the medium-and higher-dose Gastrodiae Rhizoma groups and sham operation group presented up-regulated expression of 5-HTTLPR and CGRP and down-regulated expression of IL-4 in hippocampus and jejunum（ P <0.01）.Furthermore，the medium-and higher-dose Gastrodiae Rhizoma groups showed higher expression of 5-HTTLPR and CGRP and lower expression of IL-4 in hippocampus and jejunum than the sham operation group（ P <0.01）. Conclusion： Gastrodiae Rhizoma can regulate the expression of 5-HTTLPR，CGRP，and IL-4 through brain-gut axis to protect rats from cerebral hemorrhage.In particular，high-dose Gastrodiae Rhizoma demonstrated remarkable effect.60B3D286-45BD-45E0-A708-8AFC591F72C3

Keywords Brain-gut axis; Cerebral hemorrhage; Gastrodiae Rhizoma; Chinese herb medicine; Inflammation; Mechanism; Injury; Rat

中圖分類號(hào)：R282;R743 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.017

蛛網(wǎng)膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage，SAH）是出血性腦血管疾病的一種，約占急性腦卒中的10%，具有發(fā)病迅速、病死率高、病情嚴(yán)重的特點(diǎn)[1]。該病不僅可以引起腦部損傷，還可以通過腦-腸軸引起胃腸道病變，如胃腸道炎癥、出血、腸梗阻等癥狀，嚴(yán)重影響后期的愈后康復(fù)，也給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)及心理壓力[2]。

天麻是中醫(yī)用于防治腦血管疾病常用的植物藥材之一，也是我國(guó)生活中常用的食材，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)等功效[3-4]， 其主要化學(xué)成分有天麻素、多糖類、腺苷類等，具有多靶點(diǎn)作用[5-6]。有實(shí)驗(yàn)研究表明，天麻可以通過調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路中關(guān)鍵因子，改善腦出血后對(duì)腦和腸道的損傷，但機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本團(tuán)隊(duì)對(duì)大鼠以不同濃度天麻溶液灌胃，探究天麻溶液對(duì)SAH大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物選用成年SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量280～300 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：【SCXK】2019-0014，無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)，經(jīng)學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院課題組動(dòng)物房，其溫度在20～24 ℃，相對(duì)濕度35% ～40%，噪聲控制80分貝以下，保持持續(xù)通風(fēng)換氣，定期投喂水和飼料。

1.1.2藥物黔產(chǎn)天麻購(gòu)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，用時(shí)將天麻流水洗凈，干燥粉碎后加大于天麻重量10倍的純水，煎煮1 h/次，煎煮3次，總時(shí)間不超過3 h，過濾，濃縮至約原藥材1 g/mL，稀釋成所需要濃度存放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3試劑5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因連鎖多態(tài)區(qū)（5-hydroxytryptamine Transporter Gene-linked Polymorphic Region，5-HTTLPR）（BOSTER，批號(hào)：BA3707-1），降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin Gene-related Peptide，CGRP）（碧云天，批號(hào)：AF6495），白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）（BOSTER，批號(hào)：BA0980-1）。

1.2方法

1.2.1分組與動(dòng)物模型制作將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組12只，即假手術(shù)（A）組、模型（B）組、天麻低濃度（C）組（50 mg/kg）、天麻中濃度（D）組（100 mg/kg）、天麻高濃度（E）組（150 mg/kg）[7]。采取頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH模型。應(yīng)用戊巴比妥鈉，濃度1%，劑量35 mg/kg，經(jīng)腹腔注射麻醉后，把SD大鼠仰臥固定，頸正中切口，逐層鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。在近心端電凝切斷頸外動(dòng)脈，分離并夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，避免夾持迷走神經(jīng)，游離并電凝頸內(nèi)動(dòng)脈的側(cè)支小動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈剪V形切口，將修制的4號(hào)尼龍線從切口導(dǎo)入，至出現(xiàn)落空感后，迅速抽出并結(jié)扎頸外動(dòng)脈。松開頸總動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾恢復(fù)血流，逐層縫合并消毒。整個(gè)手術(shù)過程用電熱毯將大鼠體溫保持為（37±1）℃。假手術(shù)組在線栓遇到阻力后停止插入。

1.2.2動(dòng)物給藥給藥各組大鼠在造模前1周，分別進(jìn)行天麻低、中、高濃度提取液灌胃，2次/d，3 mL/次，假手術(shù)組和模型組給予等量的0.9%生理鹽水。

1.2.3HE染色各組大鼠麻醉后，將0.9%生理鹽水約400 mL，用灌注針經(jīng)升主動(dòng)脈注入，沖洗至心臟溢出的液體為清澈，然后將4%多聚甲醛約300 mL/只，用灌注針經(jīng)升主動(dòng)脈注入，滴注時(shí)間約15 min/只，待標(biāo)本固定后，快速斷取腦和空腸，放入4%多聚甲醛中后固定過夜。常規(guī)石蠟包埋切片，按照HE染色的步驟進(jìn)行梯度染色，其中蘇木精染色時(shí)間為5 min，伊紅染色時(shí)間為1 min。

1.2.4免疫組織化學(xué)法將各組大鼠腦和空腸的石蠟切片梯度脫蠟后，0.3% H2O2室溫孵15 min，5%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）室溫孵育1 h;分別依次滴加5-HTTLPR、CGRP、IL-4抗體（1∶ 200），4 ℃過夜;次日滴加二抗工作液，37 ℃孵育1 h;二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色3 s，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。每步驟間均用0.01 mol/mL磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）洗滌5 min×3。最后，每張切片在顯微鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野，采用Image-Pro Plus 10.0軟件統(tǒng)計(jì)每張圖片的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5蛋白免疫印跡法各組取海馬和空腸組織加入適量RIPA（細(xì)胞裂解液）提取液提取蛋白離心，收集上清液，再按細(xì)胞蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行蛋白提取，檢測(cè)蛋白濃度。將制備好的蛋白樣品加入凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，取膜。5%BSA室溫封閉1 h，5-HTTLPR、CGRP、IL-4抗體（1∶ 300）和小鼠抗大鼠肌動(dòng)蛋白多克隆抗體（1∶ 3 000）過夜。復(fù)溫1 h后滴加相應(yīng)二抗，辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔抗體（1∶ 1 000），室溫孵育2 h。 洗滌后，在聚偏氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride，PVDF）膜上滴加ECL發(fā)光液，放于凝膠成像儀中，開始曝光，用發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像分析。60B3D286-45BD-45E0-A708-8AFC591F72C3

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Sigma Plot 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ ?±s ）表示。應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)免疫蛋白印跡檢測(cè)的條帶灰度值進(jìn)行組間比較，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1海馬和空腸組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠海馬和空腸組織細(xì)胞排列基本均勻規(guī)則，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色均勻，正常細(xì)胞較多;模型組大鼠海馬和空腸組織細(xì)胞排列雜亂松散，細(xì)胞腫脹、細(xì)胞空泡化較多，核固縮而核周體消失嚴(yán)重，空腸黏膜上皮下間隙擴(kuò)大，腸絨毛脫落，腸組織結(jié)構(gòu)破壞較重;天麻溶液不同濃度灌胃的大鼠海馬區(qū)正常細(xì)胞胞核圓形或橢圓形，核仁清晰，染色質(zhì)豐富，排列較密，存在相對(duì)少量因核固縮、胞質(zhì)空泡化而發(fā)生變性的神經(jīng)細(xì)胞，空腸黏膜上皮下間隙擴(kuò)大、毛細(xì)血管擴(kuò)張不明顯。見圖1。

2.25-HTTLPR在腦和空腸的表達(dá)情況

與模型組比較，其余4組大鼠海馬和空腸中5-HTTLPR表達(dá)顯著提高（ P <0.01）;與假手術(shù)組比較，天麻中、高劑量組大鼠海馬和空腸中5-HTTLPR表達(dá)顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P <0.01）;天麻低濃度組5-HTTLPR表達(dá)量雖有提高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05），與天麻中劑量組比較，天麻高劑量組更能提高大鼠海馬和空腸中5-HTTLPR表達(dá)（ P <0.01）。見圖2～3。2.3CGRP在腦和空腸的表達(dá)情況

與模型組比較，其余4組大鼠海馬和空腸中CGRP表達(dá)水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P <0.01）;與假手術(shù)組比較，天麻中、高劑量組大鼠海馬和空腸中CGRP表達(dá)水平上調(diào)顯著，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P <0.01）;天麻低濃度組CGRP表達(dá)水平有上升，但差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05），與天麻中劑量組比較，天麻高劑量組更能提高CGRP在大鼠海馬和空腸中的表達(dá)水平（ P <0.01）。見圖4～5。

2.4IL-4在腦和空腸的表達(dá)情況與假手術(shù)組比較，其余4組大鼠海馬和空腸中IL-4表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P <0.01）;與模型組比較，IL-4在天麻中、高劑量組大鼠海馬和空腸中表達(dá)水平下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P <0.01）;天麻低濃度組海馬和空腸中IL-4表達(dá)水平雖然有所下降，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05），與天麻中劑量組比較，天麻高劑量組大鼠海馬和空腸中IL-4表達(dá)水平下調(diào)更為顯著（ P <0.01）。見圖6～7。

3討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是由分布于腦的血管破裂引起的一種常見急性腦損傷疾病，分為自發(fā)和繼發(fā)2種類型。研究證明，蛛網(wǎng)膜下腔出血后的主要病理學(xué)變化以炎癥、血管痙攣、水腫、細(xì)胞凋亡等為主[8-12]，病理學(xué)變化之間相互交織影響發(fā)展，最終導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)性損傷引起死亡或伴發(fā)其他臟器的損傷如胃腸道出血、便秘等，在此過程中，炎癥起重要作用[12]。

蛛網(wǎng)膜下腔出血既可以引起腦損傷，還能通過腦-腸軸引起胃腸道諸多的病理學(xué)變化，目前多認(rèn)為是通過神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等途徑[13]，借助溝通腦腸信息的腦腸肽來進(jìn)行。而腦腸肽是分布于胃腸和神經(jīng)系統(tǒng)的肽類物質(zhì)，如5-HT、CGRP等[14-15]，具有連接和調(diào)控腦和腸道信息介質(zhì)交換通暢的功能。其中5-HT是腦腸通路中重要的單胺類遞質(zhì)，受其編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因啟動(dòng)因子5-HTTLPR和調(diào)控[16]，大部分由腸道的嗜鉻細(xì)胞合成，其受體多存在于嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞上，具有調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)表達(dá)、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)胃腸道的調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)在胃腸組織的水平及腸道絨毛、隱窩的變化等作用[17-18]。CGRP是利用基因重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)的由氨基酸組成的多肽物質(zhì)，廣泛存在于腦和腸道組織中，可以通過舒張其組織中的血管及直接作用于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，抑制上述細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)[19-20]。IL-4可由樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T/B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞分泌，是多功能細(xì)胞因子，在腦和胃腸道的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)中起重要作用[21-22]。

天麻是一種產(chǎn)于貴州、云南、四川等地的藥食兩用植物，具有息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)的功效，現(xiàn)代藥理證明其化學(xué)成分為天麻苷、多糖、維生素A、氨基酸等[23]，具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化及改善缺血等作用[24-26]，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的天麻液灌胃大鼠1周，觀察其對(duì)SAH大鼠引起的腦損傷和腸損傷的保護(hù)效果及其作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，給予7 d天麻中、高濃度溶液灌胃后，能顯著提高5-HTTLPR、CGRP在SAH大鼠海馬和空腸部位的表達(dá)，下調(diào)炎癥介質(zhì)IL-4的表達(dá)水平;而與假手術(shù)組比較，天麻低濃度溶液對(duì)5-HTTLPR、CGRP表達(dá)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明給予天麻中、高濃度溶液能明顯提高腦和空腸組織中提高5-HTTLPR、CGRP的表達(dá)，下調(diào)IL-4表達(dá)水平，起對(duì)SAH大鼠海馬和空腸組織的保護(hù)作用，降低SAH引起的大鼠腦和腸道的損傷。但該實(shí)驗(yàn)對(duì)SAH大鼠海馬和空腸中5-HTTLPR、CGRP、IL-4指標(biāo)的觀察時(shí)間較短，對(duì)于長(zhǎng)期的影響效果有待進(jìn)一步研究。

總之，天麻能通過腦-腸軸抑制蛛網(wǎng)膜網(wǎng)下腔出血引起的大鼠腦和腸道的損傷，其中以天麻高濃度溶液灌胃的效果最好，作用機(jī)制可能與提高5-HTTLPR、CGRP的表達(dá)下調(diào)IL-4表達(dá)水平有關(guān)。

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（2021-04-11收稿本文編輯：楊覺雄）

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（QZYY2018112）;貴州省科技廳科技合作項(xiàng)目（黔科合LH[2016]7121號(hào)）;貴州中醫(yī)藥大學(xué)校內(nèi)課題（貴中醫(yī)科院內(nèi)[2018]52號(hào);貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)（黔科合平臺(tái)人才[2020]5010）;貴州省發(fā)改委工程研究中心建設(shè)項(xiàng)目（黔發(fā)改高技[2020]896號(hào)）作者簡(jiǎn)介：朱世杰（1986.05—），男，碩士，講師，研究方向：中藥對(duì)腦血管及免疫系統(tǒng)的影響，E-mail：zhu3514@163.com通信作者：羅亞非（1965.07—），男，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：腦血管疾病的形態(tài)學(xué)研究，E-mail：944943527@qq.com60B3D286-45BD-45E0-A708-8AFC591F72C3