張彥驊 李怡林 朱學喆 劉博

【關鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥;肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1;表達;疾病發(fā)生;機制

【中圖分類號】R711.22 【文獻標識碼】A 【文章編號】2026-5328（2022）03--03

子宮內(nèi)膜異位癥（EM）是婦科常見疾病之一，發(fā)病率10%～15%，其中76%在25～45歲[1]。主要指子宮內(nèi)膜組織種植于或者浸潤于宮體之外的地方，異位內(nèi)膜可以出現(xiàn)在全身任何部位，一般位于卵巢、宮骶韌帶等，其特征是雌激素依賴和炎性介導，其生物學行為與癌癥類似，如其細胞具有遷移、侵襲、再發(fā)甚至惡變等。EM主要分為三種類型，卵巢型、腹膜型及深部結節(jié)型，目前，發(fā)病機制尚未完全闡明，主要有以下學說，種植學說、體腔上皮化生學說、誘導學說[2]。子宮內(nèi)膜異位癥的治療方案，因病情的輕重，患者的年齡和生育情況而有所不同。近年來腹腔鏡的廣泛應用，已使子宮內(nèi)膜異位癥的治療有了一種新的選擇，但是仍然有內(nèi)異癥治療效果不佳，反復復發(fā)的問題。所有治療效果不理想的原因主要在于EM的發(fā)病原因不清楚[3]。因此，探討EM的發(fā)病機制是目前研究中最亟待解決的問題。lncRNA在婦科疾病中發(fā)揮著重要的作用，但是關于其在EM中的承擔的具體作用不清楚，另外AFAP1-AS1通過下調(diào)，結果發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生顯著的變化，并且得知此變化與EMT時出現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生變化具有一致性，但是關于AFAP1-AS1和EMT之間關系研究，其機理并不明確，另外，AFAP1-AS1的下調(diào)在體內(nèi)及體外的結果是否具有一致性[4]，因此，本研究為了驗證EM中l(wèi)ncRNA以及探討EM中的EMT現(xiàn)象，探討AFAP1-AS1和EMT之間的關系，研究其機理發(fā)生的過程，為EM提出新的標記物及EM的治療提供新的思路。

1. 資料與方法

1.1一般資料

項目通過我院倫理委員會審查，以我院2020.9-2021.2月期間因卵巢子宮內(nèi)膜異位癥在婦一科接受手術治療的患者30例為研究對象（實驗組），收集其異位內(nèi)膜組織及在位內(nèi)膜組織，以術后病理科石蠟病檢作為判斷標準。同時收集同期非子宮內(nèi)膜異位癥患者30例正常內(nèi)膜組織（對照組）。實驗組30例患者年齡36～76歲，平均（55.32±9.41）歲，在病理分級方面，Ⅰ+Ⅱ級17例，Ⅲ級13例;在病理分期方面，Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期10例。對照組30例患者年齡33～71歲，平均（53.65±8.65）歲。兩組患者的一般資料比較差異均不顯著（P>0.05）。納入標準：①一般病例資料完善;②入院實驗組初步診斷均考慮卵巢子宮內(nèi)膜異位癥且均為初次治療，對照組為非子宮內(nèi)膜異位癥，且無子宮內(nèi)膜良性病變或子宮內(nèi)膜惡性病變的患者[5];③入院后患者均行手術治療且術后有明確的石蠟病理診斷結果。排除標準：①實驗組既有卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，同時合并有卵巢其他囊腫的患者。對照組患者有子宮異常出血或有分泌雌激素的卵巢腫瘤或長期服用雌、孕激素史的患者;②術后病理診斷結果缺失。

1.2方法

1.2.1 AFAP1-AS1在異位組織、在位組織及正常組織中的表達

1.2.1.1組織的獲取

收集我院30例確診為EM的患者的異位內(nèi)膜組織及在位內(nèi)膜組織，另外取30例正常內(nèi)膜組織。標本采集以后立即保存在RNAlater保存液，另外收集患者臨床資料。

1.2.1.2細胞培養(yǎng)

正常內(nèi)膜細胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，EM患者內(nèi)膜細胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均5%CO2，37℃。

1.2.1.3細胞總RNA抽提

（1）待細胞處于對數(shù)生長期時進行抽提;（2）棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入2ml Trizol，吹打，混勻，靜置孵育;（3）取1ml轉移至1.5ml的EP管，加入0.2ml氯仿，震蕩，靜置;（4）離心，取上層水相約600μl至新的EP管;（5）加0.5ml異丙醇，靜置，離心，棄上清;（6）用1ml 75%的乙醇洗滌;（7）離心，棄上清，干燥;（8）加入ddH2O 30μl溶解，水浴10min;（9）根據(jù)1OD260相當于40μg/ml，確定RNA量，根據(jù)OD260/OD280判斷RNA純度，RNA樣品置于-80℃保存。

1.2.1.4組織標本總RNA抽提

（1）取出保存的組織，研磨;（2）移至含1mlTRIzol RNA的EP管，震蕩，靜置;（3）加入0.2ml氯仿，震蕩，靜置;（4）離心，吸上清至新的EP管;（5）加0.5ml異丙醇，顛倒，靜置;離心，去上清;（6）加入lml 75%乙醇洗滌;離心，棄上清，干燥;（7）加入30μlddH2O進行講解，水浴;（8）根據(jù)1OD260相當于40μg/ml，確定RNA量，根據(jù)OD260/OD280判斷RNA純度，RNA樣品置于-80℃保存。

1.2.1.5反轉錄

利用逆轉錄試劑操作。取0.5μgRNA融于2ul DEPC中，加入轉錄引物1μl，用DEPC補至5μl，變性，冷卻。再加2μl的5XReaction Buffer，0.5μl的RNAse抑制劑，1μ1的dNTP，0.5μ1逆轉錄酶RTase，1μlDEPC，使總體積為10μ1，混勻。水浴10min，之后42℃，60min，最后70℃，10min，冷卻。置于-20℃保存。

1.2.1.6實時熒光定量PCR

（1）引物序列：UCA1（F：CCCGAGGACCGAAGATCAAA;R：GGCATGAGTGCAGTTGAGGA）;HNF1A-AS1（F：TTACAGACCCGGGATAGGTC;R：CTGTTCTCTCAGGTGTCCGG）;MALAT-1（F：AAGTGTGTCCCTTTGCGTCT;R：TATCCTAGCCTGTCTTGAGC）;KLKP1（F：TCACACTTCCATGGTCCAAA;R：CGCCTAATTCCACTCCAAAGG）;AFAP1-AS1（F：TCCTCAGGTGGGCAAGTGACA;R：CGACCGGCTACTGAGAAGGCTT）AFAP1（F：CGATTGAACCCCGCTCGGTC;R：TTAACACCAGCCGGGCGATCC）;ZEB1（F：ATGCGGAGGGTATATAGAGTGT;R：AAGGATAAAGGTCCGATGAGAT）;（2）配置相應反應體系：試劑盒（2×）：5μl;上游引物（10μM）：0.4μl;反向PCR引物（10μM）：0.4μl;cDNA：1μl;ddH2O：3.2μl;（3）反應條件：95℃變形30s，1cycle;95℃變形3s;60℃退火3s，40cycles。

1.2.1.7免疫組化法

（1）取出保存的組織進行固定，制作蠟塊，再切片，貼片。（2）烤片：于60℃烤箱中烘烤60min左右。（3）脫蠟、復水：二甲苯Ⅰ（5min），二甲苯Ⅱ（5mim），無水酒精Ⅰ（2mim），無水酒精Ⅱ（2min），95%酒精（2min），85%酒精（2min），70%酒精（2min），50%酒精（2min），30%酒精（2min）。（4）用PBS洗3次，3min/次。（5）修復抗原：切片于pH7.2的檸檬酸鈉修復液，高壓冒氣2min，冷卻。（6）所有切片均加入過氧化酶阻斷劑，孵育，PBS洗3次，5min/次。（7）除去PBS，所有切片均加入BSA，孵育，PBS洗3次，5min/次。（8）加一抗：除去PBS，所有切片均加入一抗，4℃過夜。孵育，除去多余液體，PBS洗3次，5min/次。（9）加二抗：除去PBS，所有切片均加入二抗，孵育，PBS洗3次，5min/次。（10）加DAB：除去PBS，所有切片均加入DAB顯色液，根據(jù)顯色的情況判斷顯色的時間，最后用蒸餾水終止。⑾復染：棄蒸餾水，所有切片均加入蘇木素，最后用蒸餾水終止顯色。⑿脫水：按照以下順序進行浸泡，無水乙醇30%，50%、70%、80%、95%、100%、100%，均2min，最后放二甲苯溶液中。⒀晾干，加中性樹脂，蓋玻片封好。⒁拍照。

1.2.2 AFAP1-AS1下調(diào)與EMT的關系研究

1.2.2.1細胞分離和培養(yǎng)

（1）組織的獲?。喝〗】翟谖粌?nèi)膜組織及EM患者異位內(nèi)膜組織，均培養(yǎng)于含有2%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中。（2）消化：將組織移至無菌的培養(yǎng)皿，用PBS洗3次，接著放入含有2%雙抗的PBS中，剪碎，用PBS洗3次，沉淀，取上清，加入Ⅳ型膠原酶消化液，封管，水浴，消化1h，震搖，直至呈現(xiàn)粘稠狀，加DNaseⅠ，消化。（3）分離和純化：取出上述消化液，依次經(jīng)過100目和400目篩網(wǎng)過濾。（4）傳代培養(yǎng)：觀察細胞匯合度，達到80%即可進行傳代培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基，加PBS洗2次，去除PBS，加胰蛋白酶，消化，顯微鏡觀察，觀察細胞的形態(tài)是否出現(xiàn)變化，若變化，立即加血清終止，吹打，離心，去除上清，沉淀，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2.2細胞凍存和復蘇

（1）細胞凍存：觀察細胞匯合度情況，達到80%時即可凍存細胞，棄培養(yǎng)基，加PBS洗2次，加胰蛋白酶，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化，觀察細胞的形態(tài)，若出現(xiàn)變化，加血清立即終止消化，吹打，離心，去除上清，加細胞凍存液，封口，保存，于-80℃冰箱過夜。（2）細胞復蘇：取出凍存的細胞，水浴，離心，棄上清，于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h更換培養(yǎng)基。

1.2.2.3電鏡觀察

（1）取材。（2）固定：用2.5%戊二醛進行固定，再用緩沖液清洗3次，10min/次。（3）脫水：用乙醇進行脫水，按照以下順序操作，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，再用叔丁醇進行脫水3次，10min/次，過夜。（4）冷凍干燥。（5）電鏡觀察。

1.2.2.4 ELISA

（1）樣品制備：取患者外周血，離心，保存;取上述保存的組織。（2）取出條板。（3）孔中加入稀釋液，封反應孔，孵育。（4）去除反應液。（5）加入生物素化抗體，封住反應孔，孵育。（6）洗板，加入酶結合物稀釋液，封反應孔，避光孵育。（7）洗板5次，加入顯色底物，避光孵育。（8）加入終止液，混勻，測OD值。

1.2.2.5 Edu

（1）取對數(shù)生長期細胞，接種，應用雌激素進行處理。（2）稀釋Edu溶液，制作Edu培養(yǎng)基。（3）孵育，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，5min/次。（4）加入多聚甲醛進行固定，去除固定液。（5）加入甘氨酸，孵育，棄甘氨酸，PBS清洗1次，5min。（6）加入含有TritonX-100的PBS，孵育，再用PBS清洗1次，5min。（7）加入染色反應液，避光孵育，棄染色液。（8）加入含有TritonX-100的PBS，搖床，清洗2次，5min/次。（9）加入甲醇洗2次，5min/次，再用PBS清洗1次，5min。（10）加入Hoechst33342反應液，避光孵育，棄染色液，再用PBS清洗1次，5min。（11）用顯微鏡觀察，拍照。

1.2.2.6MTT

（1）細胞接種，于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，（2）加入MTT，培養(yǎng)。（3）吸出培養(yǎng)液，加入DMSO液，振蕩，溶解。（4）測OD值，記錄，繪制。

1.2.2.7細胞劃痕實驗

（1）劃線，保證沒孔最低經(jīng)過3條線。（2）將對數(shù)增長期的細胞接種于6孔板中。（3）劃線。（4）用PBS清洗3次，5min/次，加入無血清的培養(yǎng)基，進行藥物處理。（5）于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，按照0h、24h、48h取樣，拍照。

1.2.2.8 Transwell

（1）種懸細胞，調(diào)整細胞密度。（2）每個小孔加入細胞懸液。（3）加入胎牛血清，培養(yǎng)24h。（4）取出Transwell小室，用PBS清洗，用95%乙醇固定，取上層，下層進行染色，再用PBS進行清洗。（5）計數(shù)：再顯微鏡下進行計數(shù)，計數(shù)10個視野，取平均數(shù)。

1.2.2.9細胞侵襲實驗

（1）取出解凍好的基質(zhì)膠，振蕩，混勻。（2）預冷。（3）包被基底膜：加入Matrigel溶液，風干。（4）水化基底膜：加入BSA的無血清培養(yǎng)基，孵育。（5）結晶紫染色同上述步驟。

1.2.2.10 Western Blot

（1）細胞或組織總蛋白抽提：將異位組織及在位組織標本研磨。每200mg組織或細胞，加入RIPA裂解液，震蕩，離心，取上清。利用蛋白定量試劑盒測蛋白質(zhì)濃度，用PBS調(diào)整為4mg/ml，再加入1/5體積緩沖液，煮沸，離心，-20℃保存。（2）電泳：取總蛋白樣品，每孔上樣15μ1，于12%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，濃縮膠80V，分離膠120V，出凝膠后結束電泳。（3）電轉移：依次按Scotch-Brite墊-Whatman濾紙-凝膠-NC膜-Whatman濾紙-Scotch-brite墊的順序放置，用特制的夾子夾緊，放入塑料支撐體中，然后浸入盛有緩沖液槽中。冰浴，電轉移45min，取出NC，以Pre-Stained Protein Ladder條帶為參考，切割PVDF膜。（4）封閉：室溫下，用5%脫脂奶粉在水平脫色搖床上封閉1h。（5）加一抗加二抗：按照抗體說明書稀釋相應抗體。將封閉后的NC膜放入塑料皿中，加入上述抗體，轉印，振蕩。次日，以TBST漂洗15min×3次。加入羊抗兔，二抗，孵育，用TBST洗膜，15min×3次。（6）發(fā)光底物反應：取luminol，A與B液按1：1混勻，滴于NC膜上，并將膜用透明塑料保鮮膜包裹，反應2min。（7）顯影曝光：暗室條件下，壓片盒中將感光膠片疊于膜上，用壓片夾夾緊曝光5min，取出膠片，依次顯影、定影，用水沖洗膠片。

1.3觀察指標

數(shù)據(jù)由華大基因?qū)λ龀龅臄?shù)據(jù)進行分析，獲得AFAP1-AS1在異位組織、在位組織中以及正常內(nèi)膜組織中的表達情況，EMT標志基因及蛋白、轉錄因子在異位組織及在位組織中的表達情況，結合收集的上述臨床資料及實驗數(shù)據(jù)分析AFAP1-AS1在EM患者中的表達情況。分析AFAP1-AS1下調(diào)與EMT的關系。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件，計數(shù)資料分別用%、X2表示、檢驗，計量資料分別用（x±s）、t表示、檢驗，用Cox比例風險模型分析影響因素，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2. 結果

2.1兩組lncRNA AFAP1-AS表達比較

觀察組患者的lncRNA AFAP1-AS表達高于對照組（t=37.619，P<0.05）。見表1。

2.2實驗組lncRNA AFAP1-AS表達與臨床病理特征的相關性分析

病理分級Ⅰ+Ⅱ級患者的lncRNA AFAP1-AS高表達率低于Ⅲ級患者（P<0.05），病理分期Ⅰ+Ⅱ期患者的lncRNA AFAP1-AS高表達率低于Ⅲ+Ⅳ期患者（P<0.05），肌層無或淺浸潤患者的lncRNA AFAP1-AS高表達率低于肌層深浸潤患者（P<0.05），但不同年齡、淋巴結轉移、合并糖尿病、高血壓患者的lncRNA AFAP1-AS高表達率之間的差異均不顯著（P>0.05）。見表2。

3. 討論

近幾年，EM的致病機制中提出了上皮-間質(zhì)轉化學說（EMT）引起人們的關注[6]。EMT的主要特征有細胞黏附分子表達的減少、細胞角蛋白細胞骨架轉化為波形蛋白為主的細胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征等[7]。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型，抑制細胞的衰老及凋亡的發(fā)生，免疫抑制能力提高。

LncRNA是一類長度大于200nt，缺乏顯著開放閱讀框（ORF）的ncRNA，lncRNA在婦科疾病中發(fā)揮著重要的作用，1ncRNA參與相關生物學行為，主要包括基因組印記、修飾染色質(zhì)等，另外主要在轉錄開始及終止，運輸?shù)冗^程中發(fā)揮著重要的作用。目前文獻報道LncRNA不僅與婦科惡性腫瘤的發(fā)生有著密切關系，在EM的病灶組織中也有表達。但是關于其在EM中的承擔的具體作用不清楚。肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1（actin fiber-associated protein 1-antisense RNA1）是新發(fā)現(xiàn)的一種1ncRNA，另外，文獻中表明[8]，AFAP1-AS1通過下調(diào)，結果發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生顯著的變化，并且得知此變化與EMT時出現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生變化具有一致性，但是關于AFAP1-AS1和EMT之間關系研究，其機理并不明確，另外，AFAP1-AS1的下調(diào)在體內(nèi)及體外的結果是否具有一致性。

本研究為了驗證EM中l(wèi)ncRNA以及探討EM中的EMT現(xiàn)象，探討AFAP1-AS1和EMT之間的關系，研究其機理發(fā)生的過程，并通過體內(nèi)實驗驗證以上得出的結論，結果表明，實驗組患者預后的影響因素包括lncRNA AFAP1-AS表達、病理分期（P<0.05）。這就為治療EM患者提高新的治療思路。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥中肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1的表達升高，與疾病發(fā)生的機制關系密切。

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基金項目：甘肅省自然科學基金（20JR10RA422）