李昱昊，李艷玲，尹雪莉，孫曉梅，張 軍，李名聰,2，劉 莉,3，張素梅，張勝權

學習記憶是多個腦功能區(qū)共同協(xié)調完成的高級腦電活動，也是神經(jīng)科學研究的熱點之一。目前研究最清楚的解剖部位是海馬體，它位于哺乳類動物顳葉深部外側，海馬齒狀回(DG)-CA1-CA3神經(jīng)環(huán)路是記憶形成的關鍵解剖區(qū)域[1-2]。不同性別的C57BL/6J小鼠行為學存在差異，在焦慮樣行為測試中，同年齡的雄性小鼠比雌性小鼠表現(xiàn)出更強的抗焦慮行為；在空間學習記憶測試中，如Morris水迷宮實驗，同等條件下，雄性小鼠比雌性小鼠能更快地完成學習任務，這種效應與年齡無關[3-4]。因此，在行為學實驗中，通過轉錄組測序技術篩選出不同性別差異基因并尋找差異信號通路進行比較，能夠為后續(xù)相應行為學測試優(yōu)化實驗方法和進行針對性研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡的C57BL/6J小鼠購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，所有的動物實驗均通過安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會的批準。

1.2 主要試劑10 ml 4%的戊巴比妥鈉由安徽省立醫(yī)院麻醉科提供；引物購自生工生物上海有限公司；總RNA提取試劑盒與逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)染料購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 主要儀器RT-qPCR分析儀購自瑞士Roche公司；脫色搖床購自上海滬析科技有限公司；恒溫水浴鍋購自上海冠森科技有限公司。

1.4 海馬總RNA提取及cDNA文庫的構建不同性別的8周齡的C57BL/6J小鼠各被分為2組(每組各3只)。使用4%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，心臟抽血后處死，迅速完整取出小鼠海馬體，使用液氮將組織研磨成粉末，然后借助試劑盒完成總RNA提取并按說明書完成mRNA的純化。隨后借助逆轉錄試劑盒完成cDNA文庫的構建。

1.5 有參轉錄組測序委托深圳華大基因科技有限公司對所得cDNA文庫進行測序。

1.6 RT-qPCR分析從小鼠海馬組織中提取總RNA，按照試劑盒說明書步驟進行操作。將提取的總RNA和特定引物作為逆轉錄原料，并使用逆轉錄試劑盒構建cDNA文庫。使用10 μl SYBR Green熒光染料、400 ng cDNA和0.4 mmol的特定引物，用超純水定容到體積為20 μl的混合體系。使用RT-qPCR儀進行RT-qPCR分析。該PCR步驟為：95 ℃預變性30 s，然后在90 ℃、20 s的條件下進行40個循環(huán)的擴增，隨后95 ℃變性5 s，在72 ℃退火15 s，最后在95 ℃延伸5 s及60 ℃、1 min的條件下分析熔解曲線。每個反應重復進行3次，使用2-ΔCt方法分析RT-qPCR結果，然后使用β-肌動蛋白(β-actin)作為標準對照對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.7 差異基因篩選與相互作用使用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫分析不同性別小鼠海馬體轉錄組中顯著上調與下調的基因，Q≤0.05為存在統(tǒng)計學意義的閾值。HISAT(Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts)是一款用于RNA-seq read比對參考基因組的軟件(http://www.ccb.jhu.edu/software/hisat)。它采用全基因組和局部基因組兩種索引形式，能迅速地篩選出基于設定條件下的差異基因。Cytoscape是將所得差異基因數(shù)據(jù)轉化成網(wǎng)絡相互作用圖的一個軟件，可以準確分析指定基因或基因組的相關性。每個節(jié)點代表一個基因，連線代表基因間相互作用，關鍵基因用紅色節(jié)點(KDA)標出,藍色節(jié)點表示初始基因。將測序所得的數(shù)據(jù)庫結果導入Cytoscape 軟件進行分析并挖掘聯(lián)系最為緊密的基因。

1.8 統(tǒng)計學處理使用SOAPnuke軟件過濾原始數(shù)據(jù)。使用Bowtie2軟件將篩選過的數(shù)據(jù)與參考編碼基因組對齊，然后通過RSEM軟件計算基因的表達水平。結合R語言中的phyper函數(shù)進行富集分析，計算P值，然后對P值進行矯正得到Q值，通過Bonferroni校正方法在Q≤0.05的條件下分析基因的差異表達情況。并基于超幾何測試方法對帶注釋的不同基因表達情況進行了分析。對RT-qPCR數(shù)據(jù),使用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，全部實驗數(shù)據(jù)以2-ΔCt表示，實驗組與對照組采用兩獨立樣本t檢驗進行結果分析，方差不齊者采用校正t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因將處理后的原始數(shù)據(jù)進行篩選后顯示，與雄性組相比，雌性組小鼠共有325個差異基因，其中上調基因233個，下調基因92個。見圖1。

圖1 不同性別C57BL/6J小鼠差異基因柱狀統(tǒng)計圖a:高表達基因；b:低表達基因；與雄性組比較：**P<0.01

2.2 差異基因GO分析和KEGG分析通過GO數(shù)據(jù)庫篩選，按照從大到小的順序進行排列，分別從細胞功能(cell function)、細胞標志(cell marker)、生物功能(biological progress)、疾病相關性(KEGG disease)這幾個方面對差異基因進行分析并繪制表格；結果顯示，差異基因主要富集在離子通道形成、蛋白質結合、突觸與細胞膜穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)遞質傳遞、細胞黏附、神經(jīng)遞質傳遞、I-型膠原組成等生物學過程。見表1。基于KEGG數(shù)據(jù)庫繪制了不同性別組的差異基因富集氣泡圖，結果顯示，差異基因較為明顯的富集通路為尼古丁成癮、長時程增強、前額葉皮質突觸形成、谷氨酸能突觸形成、GABA氨基丁酸突觸形成、多巴胺突觸形成等過程。見圖2。

圖2 不同性別組差異基因參與的KEGG信號通路聚類熱圖紅色：高表達基因；藍色：低表達基因

表1 相關基因GO數(shù)據(jù)庫功能分析

2.3 差異基因相互作用網(wǎng)絡通過HISAT數(shù)據(jù)庫篩選出不同性別的小鼠海馬體中的差異基因，使用Cytoscape軟件算出每個基因的連接程度(degree)，結果顯示共有362個連接點和1 703個相互作用邊,見圖3。連接程度表示差異基因網(wǎng)絡中每個基因與周圍基因的關聯(lián)程度；連接程度越大，表示某一目的基因與之相關聯(lián)的基因數(shù)量就越多。因此，通過對比得出雌性組與雄性組排名前10的關鍵基因，分別為賴氨酸脫甲基酶5D(Kdm5d，degree=135)、細胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdkl5，degree=89)、細胞輸出介質(Cle1，degree=189)、多巴胺受體6a3(Slc6a3，degree=201)、盒式轉錄因子(Fox，degree=143)、前體mRNA加工因子4B(Prpf4b，degree=189)、甘氨酸受體4(Glur4，degree=243)、鈣離子受體2(Camk2，degree=143)、DNA和RNA結合蛋白家族(Son，degree=153)、5-羥色胺受體5b(Htr5b，degree=164)，見表2和圖4。

圖3 不同性別的C57BL/6J小鼠海馬體差異基因相互作用網(wǎng)絡圖

表2 實時熒光定量PCR目的基因的引物

圖4 雌雄C57BL/6J小鼠核心基因熒光定量PCR分析結果a:kdm5d；b:Cdkl5；c:Cle1；d:Slc6a3；e:Fox；f:Prpf4b；g:Glur4；h:Camk2；i:Son；j:Htr5b；與雄性組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究通過對不同性別的C57BL/6J小鼠海馬體進行轉錄組測序獲得相關差異基因，并通過對差異基因進行GO富集分析和KEGG富集分析，對使用不同性別的動物進行行為學測試優(yōu)化了方法，并為神經(jīng)科學的研究提供了新的研究思路。

本研究在雌雄小鼠中篩選出325個差異基因，其中上調基因233個，下調基因92個。由于差異基因相對過多，因此只列舉了GO富集分析中差異最為顯著的52個差異基因和KEGG中的20條通路；這些生物學過程主要參與了尼古丁成癮、長時程增強、前額葉皮質突觸形成、谷氨酸能突觸形成、GABA氨基丁酸突觸形成、多巴胺突觸形成等過程；在分子功能上這些差異基因主要增強了神經(jīng)遞質傳遞、突觸后電位等過程，減弱了細胞間連接、神經(jīng)遞質活性、鈣離子信號通路和蛋白質折疊、神經(jīng)元連接等過程；測序的結果還表明，這些差異基因減弱了細胞周期調控、外泌體分泌等過程，但確切的機制還需要進一步探索。

通過測序對上述基因進行分析，有3種編碼神經(jīng)遞質受體相關基因與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。首先是Slc6a3，它與多巴胺轉運密切相關；多巴胺是大腦中一種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質，參與調節(jié)大腦信息傳遞速度，提高神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞興奮性和高級哺乳動物情感活動；研究[4-5]表明，多巴胺減少不僅與帕金森綜合征有關，還與阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展密切相關。其次是Htr5b，5-羥色胺參與大腦接收、加工、整合外界信息過程[6-7]。最后是Glur2，該受體主要調控神經(jīng)元谷氨酸門控離子滲透型通道，能改變通道傳導性，尤其是電壓門控的鈣離子通道，該通道參與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與修復過程[8-10]。

近年來，隨著測序技術的發(fā)展，對于學習記憶的研究逐漸深入到基因水平[11-15]，但確切的分子機制及神經(jīng)元調控網(wǎng)絡仍然不明確；通過轉錄組測序找出差異基因和相關信號通路，目的在于尋找不同性別的動物大腦中與學習記憶有關的差異基因及通路。本研究得到的10個關鍵基因Kdm5d、Cdkl5、Cle1、Slc6a3、Fox、Prpf4b、Glur4、Camk2、Son、Htr5b或許可以成為新藥開發(fā)的位點，但由于神經(jīng)系統(tǒng)的復雜性，在神經(jīng)生物學研究的過程中如何將這些基因與疾病進行聯(lián)系，仍然需要進一步實驗探索。