何饒麗， 林楠， 方麗君， 黃天文，

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常見于老年人。調(diào)查顯示，目前全球約有5 000萬AD患者，我國老年人的AD患病率為3%～7%[1]，給家庭和社會(huì)帶來了巨大負(fù)擔(dān)。寡聚態(tài)β-淀粉樣蛋白1-42(amyloidβ-protein 1-42, Aβ1-42)作為AD發(fā)病機(jī)制的Aβ瀑布學(xué)說中毒性最大的片段，在AD的發(fā)病中起重要的作用。在AD患者的腦組織及Aβ的毒性機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)的功能異常激活是其重要的病理生理機(jī)制。因此，p38 MAPK被認(rèn)為是治療AD的重要潛在靶點(diǎn)之一[2]。

近年來，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在AD防治中的作用備受關(guān)注。人參作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥，具有悠久的應(yīng)用歷史，包含多種成分，其主要成分之一是人參皂苷Rg1，屬三醇苷，具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性。本課題組前期研究證實(shí)，人參皂苷Rg1可能通過多種途徑減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，從而達(dá)到防治AD的作用[3-4]。在此基礎(chǔ)上，本研究在Aβ1-42誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1對p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子作用機(jī)制，以期為人參皂苷Rg1防治AD提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)C57BL/6孕鼠(孕齡15～16 d，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。

1.1.2 主要試劑和儀器 寡聚態(tài)Aβ1-42(美國康薩斯大學(xué)嚴(yán)世都教授惠贈(zèng))；人參皂苷Rg1(純度>98%，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室)；β-actin單克隆抗體(美國NeoMarkers公司)；磷酸化神經(jīng)絲多克隆抗體(MAB1592，美國Millipore公司)；多克隆抗體p38 MAPK、鼠單克隆抗體phospho-p38 MAPK(Thr180/182)(美國Cell Signaling Technology公司)；胎牛血清(杭州江濱生物技術(shù)有限公司)；Neurobasal培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Western-blot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國KPL公司)；TUNEL測定試劑盒(美國Trevigen公司)；caspase-3活性檢測試劑盒(美國Clontech Laboratories公司)。細(xì)胞裂解液：Tris(pH值7.4，10 μmol/L)+ Na4P2O7(20 μmol/L)+ Na3VO4(2 μmol/L)+ NaCl (100 μmol/L)+乙二胺四乙酸 (EDTA)(1 μmol/L)+乙二醇雙四乙酸(EGTA)(1 μmol/L)+NaF(1 μmol/L)+SDS(0.1%)+PMSF(1 μmol/L)+Sodium deoxycholate(0.5%)+Triton-X 100(1%)+抑酶肽(60 μmol/L)+亮抑酶肽(10 μmol/L)+胃蛋白酶抑制劑(1 μmol/L)。解剖小鼠腦組織的溶液：Neurobasal培養(yǎng)基+2 mol/L的L-谷氨酰胺+2%的B27+4.4 mmol/L的NaHCO3；皮質(zhì)神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Neurobasal培養(yǎng)基+0.1 IU/L的青霉素G+0.1 IU/L的鏈霉素+1.19 g/L的HEPES+2 g/L的NaHCO3；皮質(zhì)神經(jīng)元生長培養(yǎng)基：Neurobasal培養(yǎng)基+50 U/mL的青霉素+50 U/mL的鏈霉素+2 mol/L的L-谷氨酰胺+2%的B27。倒置顯微鏡(CK40型，日本Olympus公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(3110型，美國Forma Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng) 具體方法參考文獻(xiàn)[5]，簡要步驟如下：取孕齡為15～16 d的C57BL/6小鼠，無菌條件下取出胎鼠，分離出全腦，去除腦組織中的腦干、小腦、橋腦及腦膜，分離出皮質(zhì)，再用胰蛋白酶進(jìn)行適時(shí)消化后，以含20%胎牛血清的解剖液終止消化，分離出小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，進(jìn)行計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)，體外培養(yǎng)3～5 d后，分離出來的皮質(zhì)神經(jīng)元穩(wěn)定生長，以此進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組 (1)空白對照組：未給予任何干預(yù)處理。(2)Aβ1-42單獨(dú)作用組(模型組)：僅給予5.0 μmol/L的寡聚態(tài)Aβ1-42作用于體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元。(3)人參皂苷Rg1處理組：體外培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，給予不同濃度的人參皂苷Rg1預(yù)先孵育24 h，然后加入5.0 μmol/L的寡聚態(tài)Aβ1-42共同孵育48 h。(4)SB203580(p38抑制劑)處理組：予20 μmol/L的SB203580以及5.0 μmol/L寡聚態(tài)Aβ1-42共同孵育。(5)人參皂苷Rg1單獨(dú)作用組：僅給予10.0 μmol/L的人參皂苷Rg1作用于體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元。

1.2.3 神經(jīng)元的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 把神經(jīng)元特異的磷酸化神經(jīng)絲抗體作為神經(jīng)元的特異性識(shí)別標(biāo)志，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ABC法)檢測培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)絲。主要步驟如下：培養(yǎng)成熟的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)3.7%甲醛固定30 min，加入過氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性的過氧化氫物酶，予PBS洗滌后，通過動(dòng)物血清封閉非特異性抗原，經(jīng)PBS洗滌后，加入磷酸化神經(jīng)絲抗體(MAB1592)孵育，經(jīng)PBS洗滌后，加入鏈親和素-過氧化物酶溶液孵育，經(jīng)PBS洗滌后，予新鮮配制的DAB溶液顯色、封片、顯微鏡下拍照。

1.2.4 Western-blot檢測 皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)處理后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液清洗殘余的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量的細(xì)胞裂解液，神經(jīng)元在冰上裂解 20 min，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞后進(jìn)行離心(14 000×g，4 ℃，10 min)，取上清液，用Bradford法對蛋白濃度進(jìn)行定量，并以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，在室溫下使用封閉液進(jìn)行封閉，一抗[p38/MAPK、p-p38/MAPK(Thr180/182)，1∶1 000稀釋]，4 ℃下孵育，洗滌，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的抗鼠IgG二抗(1∶1 000稀釋)作用2 h，采用化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光。以5、15、30和60 min為寡聚態(tài)Aβ1-42作用于皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的觀察時(shí)間點(diǎn)，采用Western-blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)p38在Thr180和Thr182位點(diǎn)的磷酸化水平，以p-p38/p38的比值表示p38活性的變化，以β-actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 TUNEL染色 參考文獻(xiàn)[6]，采用原位末端標(biāo)記法檢測培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡情況。簡要步驟如下：經(jīng)干預(yù)處理后的神經(jīng)元經(jīng)多聚甲醛等進(jìn)行固定，先后用NeuroPore試劑、淬鏈溶液(quenching solution)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)標(biāo)記緩沖液進(jìn)行處理，再用標(biāo)記反應(yīng)混合物進(jìn)行作用，使用1×TdT停止緩沖液停止反應(yīng)；接著使用Streptavidin-HRP處理、DAB顯色、細(xì)胞核復(fù)染、氨水返藍(lán)、中性樹脂封片處理。最后對染色區(qū)域內(nèi)5個(gè)視野下的TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6 caspase-3活性測定 參考文獻(xiàn)[6]，并根據(jù)說明書檢測caspase-3活性。簡要步驟如下：用人參皂苷Rg1或寡聚態(tài)Aβ1-42按不同的時(shí)間處理原代皮質(zhì)神經(jīng)元。將神經(jīng)元刮下、離心、棄上清，按照50 μL溶液含2×105個(gè)細(xì)胞的比例裂解細(xì)胞、分離上清液，加入2×反應(yīng)緩沖液/二硫蘇糖醇(DTT)混合物孵育1 h后，用熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波波長380 nm/發(fā)射波波長460 nm)檢測熒光強(qiáng)度以評估caspase-3的活性。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元純度 體外培養(yǎng)5 d的神經(jīng)元中絕大多數(shù)為磷酸化的神經(jīng)絲抗體染色陽性細(xì)胞，胞體多呈橢圓形，有≥2個(gè)的突起；胞質(zhì)和突起內(nèi)神經(jīng)絲呈棕黃色，胞核不著色(圖1)。

圖1 神經(jīng)元純度鑒定(免疫化學(xué)染色 ×400)Fig.1 Identification of neuron purity (immunochemical staining ×400)

2.2 寡聚態(tài)Aβ1-42作用不同時(shí)間對皮質(zhì)神經(jīng)元p-p38和p38蛋白水平的影響 與空白對照組比較，在寡聚態(tài)Aβ1-42作用于原代皮質(zhì)神經(jīng)元5和15 min時(shí)，p-p38蛋白水平及p-p38/p38比值均明顯升高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在作用5 min時(shí)最為明顯(P<0.005)。但皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)p-p38/p38的比值隨著時(shí)間延長在組間呈下降趨勢(圖2)。

p-p38：磷酸化p38。1：空白對照組；2～5分別為5、15、30和60 min Aβ1-42單獨(dú)作用組。A：Western-blot條帶；B：Western-blot定量分析圖。與空白對照組比較，☆：P<0.05；☆☆☆：P<0.005。圖2 寡聚態(tài)Aβ1-42不同作用時(shí)間點(diǎn)對皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞p-p38、p38及p-p38/p38水平的影響Fig.2 Protein level of p-p38, p38 and p-p38/p38 in cortical neurons treated with oligomeric Aβ1-42 at different time points

2.3 人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元p38磷酸化 與模型組比較，不同濃度(2.5、5.0和10.0 μmol/L)的人參皂苷Rg1處理組可不同程度降低p-p38/p38的比值水平，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中10.0 μmol/L處理組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中p-p38/p38水平低于2.5 μmol/L(P<0.005)及5.0 μmol/L處理組(P<0.01)。同時(shí)，SB203580處理組及10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨(dú)作用組的p-p38/p38的比值低于Aβ1-42單獨(dú)作用組(P<0.001)。10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨(dú)作用組p-p38/p38水平也低于空白對照組(P<0.001，圖3)。

p-p38：磷酸化p38；1：空白對照組；2：Aβ1-42單獨(dú)作用組；3：SB203580處理組；4～6：2.5、5.0和10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組；7：10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨(dú)作用組。A：Western-blot條帶；B：Western-blot定量分析圖。組間比較，☆☆☆☆：P<0.001；☆☆☆：P<0.005；☆☆：P<0.01。 圖3 不同濃度的人參皂苷Rg1對寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞p-p38及p38水平的影響Fig.3 Effects of ginsenoside Rg1 at different concentrations on p-p38 and p38 in cortical neurons induced by oligomeric Aβ1-42

2.4 人參皂苷Rg1減輕寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡 空白對照組的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)元間突觸形態(tài)及結(jié)構(gòu)正常、完整，呈均勻分布，突觸間聯(lián)系光滑、完整、流暢(圖4A)。Aβ1-42單獨(dú)作用組皮質(zhì)神經(jīng)元明顯減少，神經(jīng)元突觸形態(tài)屈曲、粗糙，結(jié)構(gòu)不完整(圖4B)。10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目和突觸完整性、流暢性較Aβ1-42單獨(dú)作用組明顯改善(圖4C)。TUNEL染色結(jié)果顯示，與空白對照組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞比較，Aβ1-42單獨(dú)作用組TUNEL陽性細(xì)胞/總細(xì)胞的比值明顯增高(P<0.001)；與Aβ1-42單獨(dú)作用組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞比較，10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組TUNEL陽性細(xì)胞/總細(xì)胞的比值明顯降低(P<0.001，圖5A)。皮質(zhì)神經(jīng)元的caspase-3的活性檢測結(jié)果顯示，在相同條件下，Aβ1-42單獨(dú)作用組皮質(zhì)神經(jīng)元的caspase-3活性較空白對照組顯著增加(P<0.001)；與Aβ1-42單獨(dú)作用組比較，10.0 μmol/L 人參皂苷Rg1處理組皮質(zhì)神經(jīng)元的caspase-3活性顯著降低(P<0.001，圖5B)。

A：空白對照組；B：Aβ1-42單獨(dú)作用組；C：10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組。圖4 10.0 μmol/L人參皂苷Rg1對寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡具有神經(jīng)保護(hù)作用(倒置顯微鏡)Fig.4 10.0 μmol/L ginsenoside Rg1 has neuroprotective effect on apoptosis of cortical neuronsinduced by oligomeric Aβ1-42 (observed by inverted microscope)

1：空白對照組；2：Aβ1-42單獨(dú)作用組；3：10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組。A：TUNEL染色陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的比值；B：caspase-3活性檢測，指每毫克蛋白質(zhì)中含量。組間比較，☆☆☆☆：P<0.001。圖5 10.0 μmol/L人參皂苷Rg1減少Aβ1-42誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡Fig.5 10.0 μmol/L ginsenoside Rg1 has neuroprotective effect on apoptosis of cortical neurons induced by oligomeric Aβ1-42

3 討 論

AD是中老年人中最為常見的癡呆類型，但其病因至今尚不明確，其治療方法也有待進(jìn)一步研發(fā)。在AD的病理學(xué)進(jìn)展中，Aβ的瀑布學(xué)說仍為大多數(shù)學(xué)者所接受。該學(xué)說認(rèn)為，Aβ可通過氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等途徑引起神經(jīng)元損傷和死亡、突觸缺失、神經(jīng)炎癥和tau蛋白過度磷酸化，是觸發(fā)AD病理改變的一個(gè)中心環(huán)節(jié)。這些病理過程同時(shí)也促進(jìn)了Aβ沉積[7-8]，從而進(jìn)一步加速AD的病理損害和疾病的發(fā)展。在Aβ的毒性片段中，寡聚態(tài)Aβ1-42是細(xì)胞毒性最強(qiáng)的物質(zhì)，也是研究AD病理生理的重要物質(zhì)。本研究及課題組的前期研究[6，9]都通過神經(jīng)元形態(tài)觀察、TUNEL染色技術(shù)和caspase-3活性檢測驗(yàn)證了寡聚態(tài)Aβ1-42毒性對神經(jīng)元的損害作用。因此，本研究選擇寡聚態(tài)Aβ1-42作為模擬AD病理生化的物質(zhì)，并在前期以5.0 μmol/L Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷，成功制備了體外AD模型。

MAPK家族受廣泛的細(xì)胞外刺激影響，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列生理病理過程，其中c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)與p38 MAPK均是MAPK家族的主要成員[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，具有神經(jīng)毒性的寡聚態(tài)Aβ1-42(5 μmol/L)可誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)的JNK磷酸化，活化的JNK/SAPK可參與介導(dǎo)線粒體損傷[3，6]，與文獻(xiàn)[11]的報(bào)道一致。而另一重要通路p38 MAPK激活后，可通過調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)活性，從而對細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。在AD模型中，p38 MAPK可同時(shí)作為氧化應(yīng)激的下游因子被磷酸化激活，改變caspase-9的構(gòu)象，并啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的caspase-3，通過蛋白水解作用，誘發(fā)過度的氧化應(yīng)激，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，加快AD的發(fā)病進(jìn)程，其磷酸化程度與AD發(fā)病時(shí)間正相關(guān)[12]。同時(shí)，有研究認(rèn)為，在與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)中，高表達(dá)的p38 MAPK是海馬中代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGluR)和N-甲基-D-天冬氨酸受體依賴性長時(shí)程抑制(long-term depression，LTD)形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與了突觸可塑性調(diào)節(jié)[13-15]。在AD模型中，Aβ增多可通過p38 MAPK依賴性方式誘導(dǎo)mGluR-LTD，造成樹突棘損失，與記憶減退密切相關(guān)[16]。因此，p38 MAPK在AD的病理學(xué)進(jìn)展中具有重要作用。本研究對不同作用時(shí)間(5、15、30、60 min)下Aβ1-42誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元p38蛋白磷酸化的情況進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)5.0 μmol/L寡聚態(tài)Aβ1-42作用5和15 min后，p38 MAPK在Thr180和Thr182位點(diǎn)的磷酸化水平明顯增高，且p38磷酸化水平在作用5 min后升高最為明顯，提示Aβ1-42介導(dǎo)的p38蛋白磷酸化是AD的早期病理生理過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，p38可能是研究AD治療的重要靶點(diǎn)之一。

人參皂苷Rg1在抗炎、抗氧化、延緩衰老等方面具有重要作用[17]。因此，本研究在AD的細(xì)胞模型中，以人參皂苷Rg1為干預(yù)手段，通過p38 MAPK探討其在AD早期氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用，觀察人參皂苷Rg1對寡聚態(tài)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞p-p38和p38蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可下調(diào)p38磷酸化水平。相對于未經(jīng)Aβ1-42干預(yù)的空白對照組及10.0 μmol/L人參皂苷Rg1處理組，10.0 μmol/L人參皂苷Rg1單獨(dú)作用組的p-p38/p38水平明顯減低。一方面說明空白對照組(體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元)中也可能存在一定的應(yīng)激反應(yīng)和p38 MAPK信號(hào)通路，這與既往文獻(xiàn)[18-19]的相關(guān)研究結(jié)果一致，當(dāng)然其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，筆者也將在未來的研究中關(guān)注這一變化，探索其中的機(jī)制。另一方面論證了寡聚態(tài)Aβ1-42可增加p38磷酸化水平，組間差別也進(jìn)一步說明了人參皂苷Rg1對p38 MAPK信號(hào)通路具有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，p38磷酸化水平隨人參皂苷Rg1濃度的增加而降低，其中10.0 μmol/L處理組中的p-p38水平及p-p38/p38比值最低，推測人參皂苷Rg1可能通過劑量依賴性方式抑制p38 MAPK，減少Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性。本研究還從形態(tài)學(xué)和凋亡兩方面探索了人參皂苷Rg1對皮質(zhì)神經(jīng)元的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，10.0 μmol/L人參皂苷Rg1可有效保護(hù)神經(jīng)元、維護(hù)突觸結(jié)構(gòu)，檢測caspase-3的活性也得到相同的結(jié)果，進(jìn)一步論證了人參皂苷Rg1在AD早期的應(yīng)激反應(yīng)中對神經(jīng)元起保護(hù)作用。

本研究也存在一定局限性，雖然p38的異常磷酸化是AD早期病理生理過程中的重要環(huán)節(jié)，但AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，僅通過抑制p38活性并不能完全實(shí)現(xiàn)AD的治療目標(biāo)。此外，本課題組進(jìn)行的系列研究也發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可能具有多靶點(diǎn)作用，后期將繼續(xù)探討人參皂苷Rg1的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)寡聚態(tài)Aβ1-42可誘導(dǎo)p38磷酸化，激活p38活性；而人參皂苷Rg1可減輕p38磷酸化，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用。因此，p38 MAPK信號(hào)通路可能參與人參皂苷Rg1保護(hù)神經(jīng)元，減輕寡聚肽Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。