丁燕玲,王鵬飛,楊朝云,張巖峰,周小南,史遠(yuǎn)剛,康曉龍

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

【研究意義】在肉牛產(chǎn)業(yè)中，生長(zhǎng)性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，直接影響?zhàn)B殖經(jīng)濟(jì)效益。生長(zhǎng)性狀屬于數(shù)量性狀，受飼料類型、飼養(yǎng)管理、溫度等環(huán)境因素影響，但遺傳因素起最重要作用。動(dòng)物個(gè)體生長(zhǎng)性狀的最終表現(xiàn)型主要受到與其相關(guān)的基因影響[1]。因此，利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)鑒定出與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，可節(jié)約養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)成本，為優(yōu)良性狀的選育提供遺傳素材?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】胰島素生長(zhǎng)因子(Insulin-like Growth Factors，IGFs)對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)起主要調(diào)控作用，最初被描述為生長(zhǎng)激素的體液介質(zhì)，這個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)節(jié)人及動(dòng)物的發(fā)育[2]、能量平衡及細(xì)胞功能[3-4]，在葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[5]。構(gòu)成IGF系統(tǒng)的蛋白質(zhì)IGF1/IGF2、表面受體和IGF結(jié)合蛋白通過(guò)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine-protein kinase 1，AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)調(diào)節(jié)與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)IGF家族成員之一的胰島素樣生長(zhǎng)因子2(Insulin-like Growth Factor 2，IGF2)在肌肉細(xì)胞發(fā)育中起主要作用，其作用機(jī)制為IGF2作為生長(zhǎng)激素發(fā)揮作用的中間信使，即生長(zhǎng)激素首先作用于IGF2基因，再由IGF2基因作用于靶器官，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的作用[7]。Van等[8]研究發(fā)現(xiàn)豬的IGF2基因內(nèi)含子3-G3072A突變是影響肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積的關(guān)鍵數(shù)量性狀位點(diǎn)；Yan等[9]研究認(rèn)為IGF2基因中2個(gè)SNP(g.281766 G>A 和 g.291322 C>T)與德州母驢的體長(zhǎng)和臀高顯著相關(guān)(P<0.05)；Huang等[10]研究認(rèn)為IGF2基因SNP1(內(nèi)含子8-G17A)、SNP2(內(nèi)含子8-C220T)、SNP3(內(nèi)含子8-A221G)及SNP4(內(nèi)含子8-A1393G)4個(gè)SNPs位點(diǎn)突變與秦川牛體重、體長(zhǎng)、胸圍、胸深顯著相關(guān)(P<0.05)；國(guó)外肉牛品種中，IGF2基因SNPs位點(diǎn)c.-292C>T、g.73A>g以及g.751A>g與西門(mén)塔爾牛胴體重和眼肌面積顯著相關(guān)(P<0.05)，且IGF2:c.-292C>T單核苷酸多態(tài)性與西門(mén)塔爾公牛群體中脂肪百分比的影響有關(guān)[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量的研究表明IGF2基因在不同物種中SNP位點(diǎn)的突變與脂肪沉積，體重、體長(zhǎng)、胸深等體尺性狀密切相關(guān)，說(shuō)明IGF2基因?qū)倚笊L(zhǎng)性狀和肌肉生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用PCR-RFLPs技術(shù)探究IGF2第2外顯子多態(tài)位點(diǎn)與秦川牛、西門(mén)塔爾牛、安格斯牛及新疆褐牛四種品種牛群體的多態(tài)性及與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，以期為肉牛的育種和遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及DNA提取

隨機(jī)抽取寧夏地區(qū)某牛場(chǎng)月齡相近(12月齡左右)的4個(gè)肉牛品種共91頭(秦川牛29牛，安格斯牛15頭，西門(mén)塔爾牛28頭，新疆褐牛19牛)，其中秦川牛分別在12、18、24及30月齡測(cè)定收集了體重、體尺相關(guān)數(shù)據(jù)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定牛體重、體斜長(zhǎng)、體高、胸圍、管圍、腰角寬等生長(zhǎng)性狀[12]。每頭牛尾根采血3～6 mL放入EDTA真空采血管中，搖勻后迅速放入冰盒中帶回試驗(yàn)室，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。牛血液基因組 DNA提取利用天根生化科技(北京)有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR反應(yīng)體系

本試驗(yàn)采用PCR-RFLPs技術(shù)，參考Goodall等[13]設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增IGF2基因第2外顯子全長(zhǎng)217 bp，然后用限制性內(nèi)切酶BsrⅠ(NEB，北京)酶切。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息為：上游，5′-CCTCAGCCTCATCCCCTCCTTTGC-3′；下游，5′-CTGTGCTCTATTTGCTGTGTTGTCT-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：其中2×Taq酶(5 U/μL)10 μL、血液DNA模板(50 ng/μL)2.5 μL、上下游引物各(10 pmol/μL)0.4 μL、ddH2O 6.7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，63.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 酶切

酶切總體積為20 μL，其中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，限制性內(nèi)切酶BsrⅠ(5 U/μL)0.4 μL、10×Buffer 2 μL、剩余體積加ddH2O 11.6 μL補(bǔ)充，混勻后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)指定的條件于65 ℃酶切30 min，待酶切完全后，用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2018軟件統(tǒng)計(jì)各基因型在群體中的基因型頻率和等位基因頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及多態(tài)信息含量(PIC)、群體純合度(Ho)、群體雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)分析。采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的一般線性模型(GLM)分析基因型效應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響，采用固定模型：Yij=u+Gi+Eij，式中Yij為個(gè)體表型記錄，u為群體均值，Gi為標(biāo)記基因型效應(yīng)，Eij為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF2基因的PCR-RFLPs結(jié)果

對(duì)不同群體牛IGF2基因第2外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為217 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。擴(kuò)增條帶明亮清晰，目標(biāo)片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，可用于PCR-RFLPs分析。

M:50 bp DNA ladder；1～6: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

在IGF2基因第2外顯子的185 bp 處, 有一個(gè)固有的BsrⅠ酶切位點(diǎn)，突變型在150 bp處又有一個(gè)酶切位點(diǎn)，從而得到3種基因型，分別為AA型、BB型、AB型。如圖2所示，用限制性內(nèi)切酶BsrⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AA基因型包括185、32 bp 2個(gè)片段，BB基因型包括150、35、32 bp 3個(gè)片段，AB基因型具有185、150、35、32 bp 4個(gè)片段，酶切產(chǎn)物電泳條帶清晰，片段大小與預(yù)期一致。

M: 50 bp DNA ladder; AA、AB和BB為不同的基因型

2.2 不同肉牛群體IGF2基因遺傳多態(tài)性分析

根據(jù)PCR-RFLPs電泳圖譜進(jìn)行基因分型，并計(jì)算各基因型頻率和等位基因頻率(表1)。結(jié)果顯示：秦川牛中AA基因型頻率為0.414，AB基因型頻率為0.517，BB基因型頻率為0.069，A等位基因頻率為0.672，B等位基因頻率為0.328；西門(mén)塔爾牛AA基因型頻率(0.500)高于AB、BB基因型頻率(0.464、0.036)，A等位基因頻率為0.732，B等位基因頻率為0.268；安格斯牛AA、AB、BB基因型頻率分別為0.600、0.333和0.067，A等位基因頻率為0.767，B等位基因頻率為0.233；新疆褐牛AA、AB、BB基因型頻率分別為0.421、0.474、0.105，A等位基因頻率為0.658，B等位基因頻率為0.342；在所有檢測(cè)品種中，A為優(yōu)勢(shì)等位基因。χ2檢驗(yàn)(表2)表明，在研究的所有牛品種中，IGF2基因第2外顯子SNP位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，該位點(diǎn)在秦川牛、西門(mén)塔爾牛及安格斯牛中的純合度高(分別為0.559、0.608、0.643)，雜合度低(分別為0.441、0.392、0.357)，而在新疆褐牛中則相反，其純合度低(0.450)，雜合度高(0.550)；IGF2基因第2外顯子SNP位點(diǎn)的PIC分別為：秦川牛0.344、西門(mén)塔爾牛0.315、安格斯牛0.294、新疆褐牛0.449，4個(gè)群體都具有多態(tài)性且均屬于中度多態(tài)(0.25

表1 不同牛品種IGF2基因頻率

表2 不同牛品種IGF2基因群體遺傳參數(shù)

2.3 IGF2基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

秦川牛IGF2基因第2外顯子多態(tài)性與生長(zhǎng)性能相關(guān)性分析表明(表3)，AA、AB型個(gè)體12月齡體斜長(zhǎng)顯著高于BB型(P<0.05)，其他月齡體斜長(zhǎng)無(wú)顯著影響(P>0.05)；12、18月齡AA、AB型個(gè)體胸圍顯著優(yōu)于BB型個(gè)體(P<0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)基因型間差異不顯著(P>0.05)。

表3 秦川牛IGF2基因第2外顯子SNP多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探究不同品種間IGF2基因第2外顯子對(duì)不同基因型個(gè)體生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，利用最小二乘法對(duì)IGF2基因第2外顯子不同基因型與不同品種生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。如表4所示，IGF2基因第2外顯子PCR-RFLPs多態(tài)位點(diǎn)對(duì)秦川牛和安格斯牛胸圍、西門(mén)塔爾牛和新疆褐牛體斜長(zhǎng)以及秦川牛和西門(mén)塔爾牛尻寬有顯著影響(P<0.05)，其中秦川牛AA、AB基因型個(gè)體體重、體高、管圍及尻寬顯著優(yōu)于其余品種BB型個(gè)體(P<0.05)；AA、AB型個(gè)體秦川牛和安格斯牛的胸圍顯著優(yōu)于西門(mén)塔爾牛及新疆褐牛(P<0.05)；而腰角寬和胸深在各品種間差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明該位點(diǎn)在肉用牛品種間基因型分布存在顯著差異，即各個(gè)肉牛品種的選育程度不同。

表4 IGF2基因位點(diǎn)對(duì)五個(gè)品種牛不同基因型生長(zhǎng)性狀差異性分析

3 討 論

IGF2基因參與調(diào)控膽固醇合成[14-15]、葡萄糖代謝[15]及體重的增長(zhǎng)[16]，沉默IGF2基因能顯著減緩出生胎兒的生長(zhǎng)速度[17]，且在2-型糖尿病患者中，IGF2基因的低表達(dá)與體重增加的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，因此IGF2已經(jīng)成為研究人類2-型糖尿病及肥胖等代謝性疾病的重要候選基因之一[18]；成年轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中過(guò)表達(dá)IGF2基因可增加胰島素刺激的葡萄糖攝取，降低脂肪沉積[19]，該基因也可作為肌肉特異性增強(qiáng)子，通過(guò)雷帕霉素信號(hào)通路調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖、分化、遷移等，最終影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育[20]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因第2外顯子SNP位點(diǎn)與秦川牛、南陽(yáng)牛、夏洛萊牛等部分生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)[21]。因此，研究IGF2基因遺傳變異對(duì)肉牛生長(zhǎng)發(fā)育的影響至關(guān)重要。

IGF2基因的多態(tài)性在不同畜禽中均有報(bào)道，如Wang等[22]發(fā)現(xiàn)IGF2基因第2外顯子存在G-C的突變，該SNP位點(diǎn)突變與雞生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)AA基因型雞與BB基因型雞的3周齡體重、胸寬差異顯著(P<0.05)，BB基因型雞的腹部脂肪顯著高于AA基因型雞(P<0.05)；利用高分辨率溶解曲線(HRM)技術(shù)檢測(cè)90頭天祝白牦牛IGF2基因外顯子10的基因型，并對(duì)基因型與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)AA基因型在體重、體斜長(zhǎng)、胸圍方面明顯高于BB基因型(P<0.05)[23]；Huang等[24]對(duì)秦川牛IGF2基因SNPs檢測(cè)及其與生長(zhǎng)性狀相關(guān)性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)SNP1 AA(內(nèi)含子8 G17A)基因型個(gè)體的體重、體斜長(zhǎng)及胸寬顯著高于BB基因型個(gè)體；本研究中，秦川牛AA基因型個(gè)體體高、體斜長(zhǎng)、胸圍也顯著高于BB基因型個(gè)體(P<0.05)，這與Huang等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。對(duì)IGF2基因第2外顯子基因型與不同品種牛生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行比較，得出秦川牛AA、AB基因型個(gè)體體重、體高、管圍及尻寬顯著優(yōu)于其余品種BB型個(gè)體(P<0.05)；AA、AB型個(gè)體秦川牛和安格斯牛的胸圍顯著優(yōu)于西門(mén)塔爾牛及新疆褐牛(P<0.05)，但與西門(mén)塔爾牛品種相比，秦川牛具有生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的特征，本實(shí)驗(yàn)結(jié)論卻與此不符，這可能是由于采樣時(shí)其他品種牛為新引進(jìn)個(gè)體，受到環(huán)境遷移、飼料改變等應(yīng)激，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，也可能是樣本量差異所致。Hardy-Weinberg平衡定律可揭示群體基因頻率和基因型頻率的遺傳規(guī)律，據(jù)此使群體的遺傳性能保持相對(duì)穩(wěn)定，這是畜禽保種的理論依據(jù)。本研究中，χ2檢驗(yàn)表明IGF2基因第2外顯子多態(tài)性在所研究的牛品種中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，說(shuō)明人工選育、遺傳漂變、遷移和自然選擇等各種干擾因素間相互抵消，使群體依然保持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。安格斯牛作為優(yōu)質(zhì)肉牛品種，受選擇強(qiáng)度較大，但從該角度考慮，其產(chǎn)肉性能未得到很好的選擇，說(shuō)明群體經(jīng)人工選育使這一基因座的選擇壓力較小，因此可以通過(guò)必要的人工選育來(lái)提高突變基因型在群體中的頻率。群體內(nèi)的遺傳變異程度通常用He、Ne和PIC來(lái)衡量，其值的高低體現(xiàn)出群體內(nèi)的均勻度，值越高，表明存在的遺傳變異和選擇潛力越大[24]。通過(guò)遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)在所研究群體中均屬于中度多態(tài)(0.25

4 結(jié) 論

IGF2基因第2外顯子具有中度多態(tài)性，秦川牛、安格斯牛、西門(mén)塔爾牛及新疆褐牛在該位點(diǎn)存在遺傳多態(tài)性。生長(zhǎng)性狀相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，所有品種中A為優(yōu)勢(shì)等位基因；秦川牛AA、AB基因型個(gè)體在體斜長(zhǎng)、胸圍上顯著優(yōu)于BB型個(gè)體(P<0.05)；不同品種相比，AA、AB基因型秦川牛和安格斯牛的胸圍顯著優(yōu)于西門(mén)塔爾牛及新疆褐牛(P<0.05)；A等位基因能增加肉牛的生長(zhǎng)速度，有利于肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，因此該位點(diǎn)可作為肉牛生長(zhǎng)性狀選育的潛在分子遺傳標(biāo)記，可將IGF2基因作為影響肉牛生長(zhǎng)性狀的候選基因。