趙曉佳，袁裕超，孫玉鳳，葉建仁，談家金

南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037

松材線蟲?。╬ine wilt disease，PWD）作為松樹“癌癥”對森林經(jīng)濟(jì)以及生態(tài)造成了極大的影響。一直以來，人們對于松材線蟲病防治的重點都在殺線劑上，防治狀況雖有所改善，但是仍然面臨嚴(yán)峻的病害形勢。自 1980年 Oku 等［1］提出細(xì)菌與松材線蟲病相關(guān)后，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在松材線蟲病中具有重要作用［2-4］。有學(xué)者認(rèn)為該病是松材線蟲和致病細(xì)菌共同作用引起的復(fù)合侵染病害，二者互惠共生，在誘發(fā)寄主萎蔫方面缺一不可，且認(rèn)為運用抗生素控制細(xì)菌的方法可以控制松材線蟲病的發(fā)生［5］。在此基礎(chǔ)上，一些學(xué)者開始研究用抗生素［6-7］或抗生素與殺線劑混合使用［8-9］的方法防治松材線蟲病，都取得了一定的防效?？梢姡瑢λ刹木€蟲和病害相關(guān)細(xì)菌雙向抑制，可能成為今后解決松材線蟲病的重要方向。

甲維鹽是在發(fā)酵產(chǎn)品阿維菌素B1 基礎(chǔ)上合成的一種半合成抗生素殺蟲劑，對許多害蟲具有較高的毒殺活性，且對益蟲影響較小，能夠在保護(hù)人畜安全的情況下，對害蟲進(jìn)行精準(zhǔn)防治［10］。甲維鹽作為低毒、高效農(nóng)藥多次被證實具有較好的殺線活性，能有效地降低松材線蟲病的發(fā)病率，一定程度上限制了松材線蟲病的擴(kuò)散［11-13］，但關(guān)于甲維鹽和抗生素混合防治松材線蟲病鮮有報道。本研究將對松材線蟲病相關(guān)細(xì)菌有較強(qiáng)抑菌活性的抗生素與甲維鹽混合，測定其混合液對松材線蟲的毒殺作用以及松材線蟲病溫室防治效果，旨在為尋求更好的松材線蟲病防治方法奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

松材線蟲AMA3 強(qiáng)毒蟲株分離自安徽省感病黑松（Pinus thunbergii）。2年生馬尾松盆栽苗由江蘇沂北園林苗木有限公司提供。98%米諾環(huán)素（二甲胺四環(huán)素鹽酸鹽）和98%鹽酸環(huán)丙沙星購自上海麥克林生化科技有限公司。抗生素藥敏片均購自杭州微生物試劑有限公司，直徑為7 mm，包括：米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、麥迪霉素、頭孢哌酮、萬古霉素、頭孢曲松、哌拉西林、氯霉素、多西環(huán)素、頭孢唑林、氨芐西林、阿米卡星、苯唑西林、復(fù)方新諾明（SMZ/TMP）、青霉素、紅霉素、諾氟沙星、羧芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、丁胺卡那、克林霉素、多粘菌素、慶大霉素。72%甲維鹽原藥購自河北威遠(yuǎn)生物化工股份有限公司。

NA 固體培養(yǎng)基為蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 為 7.2～7.4。NB 液體培養(yǎng)基為蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 為 7.2～7.4。MH 固體培養(yǎng)基為牛肉膏2 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酸水解酪蛋白17.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH為7.2～7.4。

1.2 細(xì)菌處理下松材線蟲存活率、繁殖量的測定以及病害發(fā)生情況統(tǒng)計

1）松材線蟲攜帶細(xì)菌 AMA3-1、AMA3-2 和AMA3-3 的獲得。將松材線蟲AMA3 接種在長滿灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的PDA 平板上，25 ℃培養(yǎng)5～6 d后，采用貝爾曼漏斗法分離收集線蟲。將收集到的線蟲懸液3 500 r/min 離心3 min，棄上清，用無菌水清洗3 遍以上。吸取0.5 mL 松材線蟲水懸液于1.5 mL 滅菌的離心管里，用滅菌的研磨棒充分研磨，稀釋涂布NA 固體培養(yǎng)基，25 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落進(jìn)行純化、培養(yǎng)和保存，即為松材線蟲攜帶的細(xì)菌。

2）松材線蟲預(yù)處理。將收集到的線蟲水懸液與3%的過氧化氫1∶1混合，靜置10 min，3 500 r/min離心3 min，棄上清，用無菌水清洗3 遍后用等體積0.1%的硫酸鏈霉素混合處理1 h，隨后用無菌水洗3遍以上。

3）細(xì)菌水懸液的制備。挑取NA 固體培養(yǎng)基上的1 個單菌落于 NB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min黑暗條件下震蕩培養(yǎng)10 h，在8 000 r/min 下離心10 min，棄上清，沉淀用無菌水清洗3 次后重新懸浮，制成1×108、1×107、1×106cfu/mL細(xì)菌水懸液，備用。

4）松材線蟲存活率的測定。將線蟲濃度調(diào)整為5 000條/mL，分別與3種濃度的細(xì)菌水懸液1∶1混合于1.5 mL 的滅菌離心管中，此時細(xì)菌的濃度為5×107、5×106、5×105cfu/mL。將蟲菌混合液放置于25 ℃培養(yǎng)箱中，每隔3 d 在光學(xué)顯微鏡下觀察線蟲的存活情況，統(tǒng)計和比較不同濃度、不同細(xì)菌處理下松材線蟲的存活率。每個處理重復(fù)5次，以松材線蟲和無菌水等體積混合為對照。線蟲蟲體僵直無光澤，用大頭針刺激不活動者，視為死亡。

線蟲存活率=活蟲數(shù)/線蟲總數(shù)×100%

5）松材線蟲繁殖量的測定。將線蟲濃度調(diào)整為3 000 條/mL，分別與 3 種濃度的細(xì)菌水懸液 1∶1 混合，吸取200 μL 蟲菌混合液（約300 條松材線蟲）放置于長滿灰葡萄孢的PDA 固體培養(yǎng)基中央，于25 ℃下培養(yǎng)，待其中1 個培養(yǎng)皿灰葡萄孢菌絲消失時，分離線蟲并計數(shù)，以松材線蟲和無菌水等體積混合的處理為對照，每處理5個重復(fù)。

6）松材線蟲病病害發(fā)生情況的統(tǒng)計。將線蟲濃度調(diào)整為10 000 條/mL，與濃度為1×108cfu/mL 的細(xì)菌水懸液等體積混合2 h后，采用皮接法［14］接種于2年生馬尾松苗莖干中部偏下位置，在25 ℃的室溫下進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)計8 個處理，每個處理接種6 株馬尾松：（1）AMA3-1+ AMA3；（2）AMA3-2+ AMA3；（3）AMA3-3 + AMA3；（4）AMA3-1 +無菌水；（5）AMA3-2 + 無菌水；（6）AMA3-3 + 無菌水；（7）CK1：AMA3 +無菌水；（8）CK2：無菌水。每株馬尾松接種500 μL 松材線蟲水懸液，每5 d觀察馬尾松苗的感病癥狀，統(tǒng)計感病率和感病指數(shù)。馬尾松病情分級和病情指數(shù)的計算參照談家金等［15］的方法，略加修改：0級正常，針葉綠色，代表值為0；1級為1/2 以下針葉褪綠、1/4 以下葉發(fā)黃，代表值為 1；2 級為1/2 以上葉褪綠、1/4～3/4 葉發(fā)黃，代表值為2；3級為3/4 以上葉發(fā)黃、1/2 以下葉變紅，代表值為3；4級為1/2 以上葉變紅、植株瀕死或死亡，代表值為4。計算公式如下：

1.3 抗生素藥敏試驗

吸取100 μL 的細(xì)菌水懸液放置于MH 固體培養(yǎng)基中，用涂布器推勻整個平板，稍晾干后，取30 種抗生素藥敏片置于細(xì)菌平板上，于25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈大小。每個處理3 個重復(fù)。篩選出高效抗生素，備用。

1.4 甲維鹽對細(xì)菌抑菌活性測定

將直徑7 mm 的圓形濾紙片滅菌烘干后浸泡于預(yù)先配制好的不同質(zhì)量濃度（5×104、104、103、102、10、1、0.1 和 0.01 mg/L）的甲維鹽溶液中，10 min 后取出，在超凈工作臺上晾干，制成含甲維鹽的藥敏紙片。在MH 固體培養(yǎng)基上，用涂布器充分推勻100 μL 的細(xì)菌水懸液，放置含有甲維鹽的藥敏紙片。25 ℃24 h后記錄抑菌圈大小，每個處理3個重復(fù)。

1.5 甲維鹽與高效抗生素混合液對松材線蟲的毒殺試驗

1）不同質(zhì)量濃度高效抗生素的配制。將本文“1.3”中篩選獲得的高效抗生素環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素分別稱取1 g，加入1 L 無菌水使其充分溶解，得到2 000 mg/L 的抗生素母液。再將抗生素母液取出一定量，用無菌水分別稀釋成 1 000、500、250、125 和31.25 mg/L的不同質(zhì)量濃度的抗生素溶液。

2）不同質(zhì)量濃度甲維鹽的配制。將72%甲維鹽原藥用助溶劑二甲基甲酰胺（DMF）和乳化劑OP-10溶解制成5%的甲維鹽乳油（EC），再用無菌水稀釋成 1 000、500、250、125 和 31.25 mg/L 不同質(zhì)量濃度的甲維鹽溶液。

3）不同質(zhì)量濃度甲維鹽和高效抗生素混合液的配制。將雙倍濃度的甲維鹽和高效抗生素1∶1 混合于離心管中，配成質(zhì)量濃度為1 000、500、250、125 和31.25 mg/L 的混合液。將上述不同質(zhì)量濃度的高效抗生素分別與松材線蟲水懸液1∶1 混合于1.5 mL 離心管中，此時得到終質(zhì)量濃度為500、250、125、62.5和15.625 mg/L 的含有抗生素的蟲藥混合物，同理得到終質(zhì)量濃度為500、250、125、62.5 和 15.625 mg/L含有甲維鹽的蟲藥混合物及含有甲維鹽和高效抗生素的蟲藥混合物。將蟲藥混合物放置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄線蟲的總數(shù)和死亡數(shù)，每個處理5 個重復(fù)，以線蟲和無菌水等體積混合為對照組。

1.6 甲維鹽和高效抗生素混合液對松材線蟲病的溫室防效測定

1）馬尾松苗預(yù)備。先將馬尾松種子用無菌水沖洗干凈，無菌水浸泡24 h 后，用30% H2O2處理30 min，用滅菌濾紙吸干水分，播種于121 ℃、120 min 滅菌的無菌營養(yǎng)土中，用少量的土覆蓋其上，培養(yǎng)2 周后移栽至一次性塑料水杯中，用無菌水定期澆水。當(dāng)馬尾松苗長至180 d 后，將表面消毒的松材線蟲AMA3 與濃度為 1×108cfu/mL 的 AMA3-1 菌株水懸液（松材線蟲的預(yù)處理和細(xì)菌水懸液的制備參照本文“1.2）”等體積混合2 h后，用滅菌的剪刀剪去馬尾松頂部部分針葉，在傷口上附少許滅菌脫脂棉球，向脫脂棉上滴加40 μL 蟲菌混合液（約含線蟲500 條），接種后24 h內(nèi)不定時地向脫脂棉球補(bǔ)充無菌水，使滅菌棉球始終保持水潤，以確保松材線蟲侵入馬尾松苗。

2）不同施用時間下甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病防治效果的測定。在接種前5 d、接種前2 d和接種當(dāng)天以灌根法［16］向馬尾松苗施藥，每個施用時間下將500 mg/L 甲維鹽、高效抗生素以及混合液分別施入馬尾松苗，每株馬尾松苗施藥10 mL。以灌根無菌水處理為對照，CK1、CK2、CK3 和 CK4 均作為對照組。處理組及CK1、CK2、CK3 均接種蟲菌混合液。CK1 接種前 5 d 施無菌水，CK2 接種前 2 d 施無菌水，CK3 接種當(dāng)天施無菌水，CK4 接種時加入無菌水。每個處理6株松苗，重復(fù)3次。

3）不同施用濃度下甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病防治效果的測定。在接種前5 d 將500、250、62.5 mg/L 的甲維鹽，500、250、62.5 mg/L 的高效抗生素，500、250 以及62.5 mg/L 的混合液分別以灌根法施入馬尾松苗，每株馬尾松苗施藥10 mL。以無菌水處理為對照，CK1、CK2 均施無菌水。灌根5 d 后處理組及CK1 接種蟲菌混合液，CK2 接種時加入無菌水，每處理6株馬尾松苗，重復(fù)3次。

接種蟲菌混合液后每2 d 記錄馬尾松發(fā)病狀況并計算感病指數(shù)，接種第7 天計算馬尾松感病率、死亡率以及藥劑對松材線蟲病的防治效果。馬尾松病情分級和病情指數(shù)的計算參照Xue 等［17］的方法。感病率和感病指數(shù)計算公式參照本文“1.2”，死亡率和防治效果計算公式如下：

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 24.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（One-way ANOVA）分析（顯著水平為α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲攜帶細(xì)菌對松材線蟲存活率、繁殖量和病害發(fā)生的影響

如圖1 A-C 所示，不同濃度菌株AMA3-1、AMA3-2 和 AMA3-3 分別與松材線蟲 AMA3 混合后，與對照組一樣，隨著處理時間的延長，松材線蟲的存活率逐漸降低。菌株濃度為5×107cfu/mL 時，AMA3+AMA3-1、AMA3+AMA3-2 和 AMA3+AMA3-3 處理組線蟲存活率分別由第2 天的97.03%、95.02%和90.59%降至第18 天的55.08%、52.44%和41.98%。菌株濃度為5×106cfu/mL 時，AMA3+AMA3-1、AMA3+AMA3-2 和 AMA3+AMA3-3 處理組線蟲存活率分別由第2 天的93.15%、91.44%和88.78%降至第18 d 的48.19%、40.56%和37.76%。菌株濃度為5×105cfu/mL 時，AMA3+AMA3-1、AMA3+AMA3-2 和 AMA3+AMA3-3 處理組線蟲存活率分別由第2 天的88.96%、83.17%和83.10%降至第18 天的37.82%、35.17%和29.01%。而對照組松材線蟲存活率由第2天的85.68%降至第18天的30.97%。結(jié)果表明，在3 種濃度處理下，與對照相比，AMA3 + AMA3-1、AMA3 + AMA3-2 和 AMA3 + AMA3-3 處 理 組 松材線蟲存活率下降速度均小于對照組，且AMA3-1處理下的線蟲存活率下降速度小于AMA3-2 和AMA3-3。菌株濃度為5×107cfu/mL時，3株細(xì)菌中任何一株細(xì)菌處理過的線蟲存活率下降速度小于菌株濃度為5×106cfu/mL 和5×105cfu/mL。因此，相比AMA3-2和AMA3-3，AMA3-1更能延長松材線蟲的存活時間，提高其存活率。

由圖1 D 可知，當(dāng)細(xì)菌濃度分別為5×107、5×106cfu/mL 時，AMA3-1、AMA3-2 和 AMA3-3 處理的松材線蟲繁殖量均顯著高于對照組（P＜0.05），且AMA3-1 處理的松材線蟲繁殖量顯著高于AMA3-2和 AMA3-3 處 理 組（P＜0.05），而 AMA3-2 與AMA3-3 處理的松材線蟲繁殖量無顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)細(xì)菌濃度為5×105cfu/mL 時，AMA3-1處理的松材線蟲繁殖量顯著高于對照組（P＜0.05），而AMA3-2 和AMA3-3 處理的松材線蟲繁殖量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，與對照組相比，3 株細(xì)菌均能提高松材線蟲的繁殖量，其中，AMA3-1 處理下的線蟲繁殖量高于AMA3-2 和AMA3-3處理。

圖1 細(xì)菌處理下松材線蟲的存活率和繁殖量Fig.1 Survival rate and reproduction of B.xylophilus treated with bacteria

2年生馬尾松苗接種試驗表明，表面消毒的AMA3 以及 AMA3-1、AMA3-2 和 AMA3-3 處理過的松材線蟲均能使2年生馬尾松盆栽苗出現(xiàn)感病癥狀，均表現(xiàn)為針葉先失水褪綠、黃化，進(jìn)而枯萎、死亡。接種 10 d 時，AMA3 + AMA3-1、AMA3 +AMA3-2 和AMA3 + AMA3-3 混合處理組松苗先表現(xiàn)出感病癥狀，部分針葉失綠變黃；而單獨接種AMA3-1、AMA3-2、AMA3-3 和對照無菌水均未表現(xiàn)出感病癥狀，馬尾松保持健康，針葉始終為綠色。各處理具體的發(fā)病情況見表1。2年生馬尾松苗接種松材線蟲后25 d的發(fā)病癥狀如圖2所示。結(jié)果表明，接種 AMA3-1、AMA3-2 或 AMA3-3 的松材線蟲比單獨接種消毒的松材線蟲的馬尾松苗更早表現(xiàn)出感病癥狀，且與接種AMA3-2 或AMA3-3 的松材線蟲相比，接種AMA3-1 的松材線蟲能使馬尾松苗發(fā)病癥狀更嚴(yán)重。

圖2 2年生馬尾松苗接種松材線蟲后25 d的發(fā)病癥狀Fig.2 Symptoms of the pine wilt disease at 25 days after being inoculated by B.xylophilus on two-year-old P.massoniana

表1 接種不同菌株及松材線蟲的馬尾松苗感病率和感病指數(shù)Table 1 Disease incidence and disease index（DI）of P.massoniana inoculated with different bacteria and B.xylophilus

2.2 抗生素的抑菌效果

相比 AMA3-2 和 AMA3-3，AMA3-1 對松材線蟲的存活率、繁殖量和病害發(fā)生具有更好的促進(jìn)作用。因此，本研究以AMA3-1 為研究對象，對AMA3-1 進(jìn)行藥敏試驗。結(jié)果顯示，不同類型的抗生素對AMA3-1 的抑制作用不同。依據(jù)抑菌圈的直徑大小，判定米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星對細(xì)菌抑制作用最強(qiáng)；氧氟沙星、麥迪霉素、頭孢哌酮、萬古霉素、頭孢曲松、哌拉西林、氯霉素和多西環(huán)素8 種抗生素對菌株AMA3-1也具有不同程度的抑制作用（表2）。

表2 30種抗生素對菌株AMA3-1的抑制作用Table 2 Inhibition of 30 kinds of antibiotics on strain AMA3-1

2.3 甲維鹽對松材線蟲攜帶細(xì)菌的抑菌活性

用菌株AMA3-1 涂布平板后，加入不同濃度甲維鹽藥敏片，培養(yǎng)24 h，平板上均未產(chǎn)生抑菌圈，說明甲維鹽對AMA3-1沒有抑制作用。

2.4 甲維鹽與高效抗生素混合液對松材線蟲的毒殺效果

由表3可知，甲維鹽或混合液對松材線蟲的毒殺作用隨著濃度的升高不斷增強(qiáng)（P＜0.05），在藥劑質(zhì)量濃度為500 mg/L 時，甲維鹽或混合液對松材線蟲的致死率均達(dá)到80%以上，說明甲維鹽或混合液對松材線蟲具有較強(qiáng)的毒殺作用。高效抗生素對松材線蟲毒殺作用并沒有隨著濃度升高而有顯著的變化（P＞0.05），且不同濃度的高效抗生素處理下，松材線蟲的校正死亡率均維持在較低水平（0.74%～2.43%），表明高效抗生素對松材線蟲無明顯的毒殺作用。

表3 甲維鹽和高效抗生素混合對松材線蟲的毒殺作用Table 3 Toxicity of emamectin benzoate and high-efficiency antibiotics to B.xylophilus %

2.5 甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病的溫室防效

1）不同施用時間下甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病的防治效果。接種松材線蟲后第7天，對照組CK1、CK2 和CK3 的馬尾松苗全部死亡（表4），經(jīng)鏡檢，體內(nèi)均含有松材線蟲，而空白對照組CK4始終保持健康，針葉為綠色。此時，接種前5 d、接種前2 d和接種當(dāng)天用甲維鹽灌根處理對松材線蟲病的防治效果分別是50%、33%和17%，表明隨著施藥時間的提前，甲維鹽對松材線蟲病具有較好的防治效果。在接種前5 d 灌根，混合液對松材線蟲病防治效果為50%，與甲維鹽防效相當(dāng)，但高于高效抗生素（17%）（P＜0.05）。在接種前2 d 灌根，混合液對松材線蟲病的防治效果為50%，高于甲維鹽（33%）或高效抗生素（17%）（P＜0.05）。在接種當(dāng)天灌根，混合液對松材線蟲病的防治效果為25%，高于甲維鹽（17%）或高效抗生素（0%）（P＜0.05），表明在一定條件下，甲維鹽和高效抗生素混合，可提高松材線蟲病的防治效果。

表4 不同施用時間下甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病的防治效果Table 4 Control effects of emamectin benzoate and high-efficiency antibiotics on the pine wilt disease under different application time

2）不同施用濃度下甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病的防治效果。接種松材線蟲后第7天，對照組CK1 的馬尾松苗全部死亡，空白對照組CK2 仍然保持健康（表5）。此時，用質(zhì)量濃度為500、250 和62.5 mg/L 的甲維鹽處理對松材線蟲病的防治效果分別是 50%、29% 和 17%，用 500、250 和 62.5 mg/L 的混合液處理對松材線蟲病的防治效果分別為50%、33%和17%，表明隨著藥劑濃度的增加，甲維鹽或混合液對松材線蟲病具有較好的防治效果。3 種濃度處理下，混合液對松材線蟲病的防治效果與甲維鹽相比無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于高效抗生素處理（P＜0.05），表明與高效抗生素相比，甲維鹽或混合液對松材線蟲病具有較好的防治效果。

表5 不同施用濃度下甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病的防治效果Table 5 Control effects of emamectin benzoate and high-efficiency antibiotics on the pine wilt disease at different application concentrations

3 討 論

不同地區(qū)、不同寄主松樹上的松材線蟲攜帶的細(xì)菌種類和數(shù)量有所不同［18］。針對松材線蟲攜帶的細(xì)菌已有較多的研究［19-21］，但并沒有發(fā)現(xiàn)松材線蟲與細(xì)菌之間存在特異性和專一性，哪些細(xì)菌在松材線蟲病發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用沒有定論。本研究從安徽省感病黑松的松材線蟲（AMA3）蟲體上分離到3 株細(xì)菌：AMA3-1、AMA3-2 和AMA3-3，發(fā)現(xiàn)這3 株細(xì)菌均能促進(jìn)松材線蟲存活率和繁殖量，并且經(jīng)接種試驗發(fā)現(xiàn)混合接種松材線蟲和3 株細(xì)菌中的任何1 株均能使馬尾松苗發(fā)病速度快于單獨接種松材線蟲，說明松材線蟲攜帶的3株細(xì)菌均能加重松材線蟲病的發(fā)生，加速馬尾松的死亡。相比AMA3-2 和AMA3-3，AMA3-1 對松材線蟲的存活率、繁殖量和病害發(fā)生方面具有更好的促進(jìn)作用。有研究表明，在寄主體內(nèi)，致病細(xì)菌通過調(diào)節(jié)自身的代謝途徑，如降解苯甲酸和松萜類物質(zhì)，幫助線蟲降解松樹自身產(chǎn)生的保護(hù)物質(zhì)，提高線蟲的適應(yīng)性，從而使松材線蟲更能適應(yīng)松樹體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境［22-23］；松材線蟲感染松樹后，松樹體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)會增強(qiáng)［24］，而松材線蟲伴生細(xì)菌可以提高松材線蟲抗H2O2脅迫的能力，從而加重病害的發(fā)生［25］；松材線蟲伴生細(xì)菌能夠產(chǎn)生致萎毒素，如苯乙酸［26］、綠膿桿菌螯鐵蛋白［27］、環(huán)二肽［28］和鞭毛蛋白［29］等對寄主產(chǎn)生毒害作用，這些可能是細(xì)菌協(xié)助松材線蟲致萎寄主的原因。但松材線蟲病致病機(jī)制比較復(fù)雜，細(xì)菌在松材線蟲病發(fā)生和發(fā)展中所起到的作用有待明確。本研究中，AMA3-1 在提高松材線蟲存活率、繁殖量和加重病害方面表現(xiàn)出更好的作用，這可能是由于AMA3-1與松材線蟲之間具有更好的協(xié)同作用。

鑒于AMA3-1 在加重松材線蟲病方面有較顯著作用，本研究以AMA3-1 為研究對象，對其進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果篩選出抑菌效果較好的環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素2 種高效抗生素。環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類抗生素，通過抑制細(xì)菌DNA 的復(fù)制來殺滅細(xì)菌。米諾環(huán)素屬于四環(huán)素類抗生素，通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成達(dá)到抑菌目的。如果將2種類型的抗生素混合使用，將取得更好的抑菌效果。通過甲維鹽抑菌試驗可知，甲維鹽對AMA3-1 沒有抑制作用。殺線試驗中，甲維鹽對松材線蟲具有較高的毒殺作用，高效抗生素對其無明顯的毒殺作用。通過甲維鹽和高效抗生素混合應(yīng)用于松材線蟲病防治試驗可知，當(dāng)藥劑質(zhì)量濃度為500 mg/L 時，在混合接種松材線蟲和AMA3-1 前2 d（當(dāng)天）根施混合液、甲維鹽和高效抗生素對松材線蟲病的防治效果分別是50%（25%）、33%（17%）和17%（0%）。說明在松材線蟲病防治方面，殺線劑（甲維鹽）發(fā)揮主效作用，高效抗生素雖無法直接對松材線蟲起到毒殺作用，但是通過控制松材線蟲攜帶細(xì)菌AMA3-1 的種群數(shù)量，可以提高殺線劑（甲維鹽）對松材線蟲病的防治效果，張志超等［6］和楊耀長等［8］也得到了相似的結(jié)論。因此，利用殺線劑和殺菌劑復(fù)配對松材線蟲病進(jìn)行防治可能不失為一個好的手段。

松材線蟲與其攜帶的相關(guān)細(xì)菌可能存在某種營養(yǎng)共生關(guān)系。談家金等［30-31］從松材線蟲體上分離到松材線蟲伴生細(xì)菌堅強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus）GD1，且GD1可延長松材線蟲的存活時間，促進(jìn)其繁殖，并且發(fā)現(xiàn)單獨接種松材線蟲或GD1松枝不發(fā)病，而攜帶GD1 的松材線蟲可使病害發(fā)生。趙博光等［32］發(fā)現(xiàn)松材線蟲優(yōu)勢伴生細(xì)菌熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）能夠促進(jìn)松材線蟲產(chǎn)卵、繁殖和蟲體生長發(fā)育。何龍喜等［33］發(fā)現(xiàn)松材線蟲攜帶細(xì)菌嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）在非寄生條件下對松材線蟲繁殖量具有一定的負(fù)調(diào)控作用，但可增強(qiáng)松材線蟲致病力，加速寄主松樹的死亡。本研究再次證明了細(xì)菌在松材線蟲病中的重要作用，展現(xiàn)了應(yīng)用抗生素和甲維鹽控制該病的良好前景。但本研究由于采用灌根法進(jìn)行松材線蟲病的防治試驗，藥劑被寄主的吸收情況可能影響到防治效果?？紤]到打孔注藥技術(shù)的高效性、經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保性，在今后的試驗中，可以采用打孔注藥向林間大樹注入甲維鹽和抗生素，進(jìn)一步研究其對林間松材線蟲病的防治效果。