朱霞 ，楊移斌 ，張蕾，胥寧，艾曉輝

1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223

白介素-22（Interleukin-22，IL-22）是一種Ⅱ型細胞因子［1］，與IL-19、IL-20、IL-24 和IL-26 同屬IL-10家族。在所有動物中，細胞因子作為一類重要的蛋白質(zhì)，通常在協(xié)調(diào)免疫反應中發(fā)揮作用［2］。哺乳動物中主要依靠CD4+效應淋巴細胞和其他淋巴細胞分泌［3］，經(jīng) JAK-STAT 信號通路或直接利用 Notch 信號途徑上調(diào)IL-22表達量從而抵御外界病原作用后產(chǎn)生的炎癥［4］。此外，IL-22 還具有多種作用，如誘導抗生物肽（AMPs）和促炎癥分子，激活屏障表面的上皮細胞，通過限制細菌的復制控制病原體入侵［5］；刺激靶細胞釋放粘附因子，加速細胞增殖，修復受損組織［6］。在應激狀態(tài)或IL-22過表達時誘導機體產(chǎn)生保護性免疫應答［7］。2005年IL-22基因首次在哺乳動物以外的斑馬魚（Danio rerio）［8］上被克隆，隨后分別在硬骨魚虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［9］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［10］、黃 顙 魚（Pelteobagrus filvidraco）［11］、鱖（Siniperca chuasti）［12］和 草 魚（Ctenopharyngodon idellus）［13］中被陸續(xù)報道。IL-22在斑馬魚、草魚、虹鱒等硬骨魚中能夠促進宿主抵抗外源病原的感染，因此，了解免疫因子的表達動態(tài)是提高魚類自身免疫限制疾病暴發(fā)的關鍵。

斑點叉尾鮰（Ictalunes punctatus）隸屬于鮎形目（Siluriformes），鮰科（Lctaluridae），真鮰屬，自1984年引入湖北以來頗受廣大消費者喜愛。近年來已成為鮰科的主要養(yǎng)殖對象，但養(yǎng)殖中受限的養(yǎng)殖環(huán)境常導致魚體自身健康受到威脅。因此，研究斑點叉尾鮰的免疫基因，探明斑點叉尾鮰應答過程中的機制十分必要。先前關于IL-22在硬骨魚中的研究已有不少，為進一步探究斑點叉尾鮰IL-22編碼區(qū)序列特征以及不同誘導模式下IL-22表達變化，本研究利用聚合酶鏈式反應技術(shù)（PCR）克隆了斑點叉尾鮰IL-22基因CDS 區(qū)，通過實時熒光定量 PCR 技術(shù)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測其在各組織中的表達分布以及不同免疫刺激誘導和病原菌感染后的表達情況，旨在豐富硬骨魚類IL-22研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

854 尾體質(zhì)量為（200±20）g 的健康斑點叉尾鮰購自武漢白沙洲水產(chǎn)品大市場，于養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)1周，水溫（25±1）℃，養(yǎng)殖用水充分曝氣，每天清污換水，試驗期間不投喂。魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）和海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）菌種均為西北農(nóng)林科技大學王二龍副教授贈送；斑點叉尾鮰病毒（channel catfish virus，CCV）由華中農(nóng)業(yè)大學袁軍法副教授贈送；腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI）購自上海生工生物工程有限公司。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly（I：C）），植物血球凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）、佛波酯（phorbol ester，PMA）和溴氰菊酯均購自上海源葉生物科技有限公司。斑點叉尾鮰腎細胞（channel catfish kidney cells，CCK）由上海海洋大學國家水生動物病原庫贈送。pMD19-T 和DH5α 購自TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司。TRIzol Reagent 購自 Invitrogen 公司，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量（qRT-PCR）試劑盒均購自上?；哿枭锛夹g(shù)有限公司。

1.2 白介素-22 CDS區(qū)克隆

根據(jù)NCBI中斑點叉尾鮰白細胞介素-22的預測序列（NCBI 登錄號為XM_017494747.1）設計特異性引物（表1）。以斑點叉尾鮰脾臟的cDNA 為模板，進行IL-22序列擴增。擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 80 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸15 min。擴增產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大小，割膠回收，將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中進行轉(zhuǎn)化，涂平板，挑取陽性克隆培養(yǎng)10 h 后送武漢天一輝遠生物公司進行測序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 氨基酸序列分析

測序結(jié)果通過Nucleotide BLAST：Search nucleotide databases using a nucleotide query（nih.gov）進行序列Blast 比對，通過ORF Finder（Home -ORFfinder-NCBI（nih.gov））查找開放閱讀框，采用ExPASy -ProtParam tool 預測氨基酸序列分子質(zhì)量和等電點，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測通過https：//predictprotein.org/完成，多序列比對和美化通過DNAMAN和 GeneDoc 軟件，用 http：//130.88.97.239/cgi-bin/dbbrowser/fingerPRINTScan/FPScan_fam.cgi 查找所歸屬家族特征，通過MEGA 5.0 構(gòu)建IL-22 的氨基酸序列N-J（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 IL-22組織表達分布

用MS-222 麻醉斑點叉尾鮰后，無菌條件下取后腸、中腎、頭腎、皮膚、肌肉、鰓、性腺、肝臟、脾臟和心臟10 個組織，迅速放于含1 mL TRIzol 溶液的無RNA酶EP管中，設置4個平行組，每組只包含1尾斑點叉尾鮰相應組織樣品。隨后將樣品用組織勻漿儀于4 ℃破碎，以氯仿抽提法獲取各組織總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，微量分光光度計進行純度檢測合格的RNA 樣品，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)成cDNA 后用于熒光定量PCR 實驗。采用QuantStudioTMDesign & Analysis Software 3.0 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)結(jié)合2×SYBR qPCR Mixture（HLINGENE）檢測不同組織樣品中IL-22的mRNA表達量。以斑點叉尾鮰EF-1α作為內(nèi)參基因，每個樣品進行3 個操作重復，引物見表1。實驗體系10 μL 包括 5 μL 2× SYBR qPCR Mixture，4.5 μL cDNA 模板，0.25 μL 引物。PCR 程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 12 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，共 40 個循環(huán)。結(jié)果采用2-△△Ct法分析。

1.5 不同免疫刺激劑誘導CCK 細胞后IL-22 表達分析

取出液氮中凍存的CCK 細胞，放置37 ℃水浴鍋中解凍90 s 后快速將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5 mL 10%FBS 和1%雙抗的M199 培養(yǎng)基（25 cm2細胞培養(yǎng)瓶）中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細胞數(shù)為5×106/mL 時，消化。用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度至每孔細胞約106個，每孔2 mL，鋪滿6 孔板。待細胞貼壁穩(wěn)定后，用LPS（50 μg/mL）、Poly（I：C）（50 μg/mL）、PHA（10 μg/mL）、PMA（0.5 μg/mL）分別刺激細胞，用同等劑量的PBS刺激CCK做對照，每個處理4個平行。每個取樣時間點都設置相應對照組，分別于刺激后0、24 和48 h 收集細胞。棄去培養(yǎng)基，加入1 mL TRIzol 反復吹打裂解細胞后，快速保存于-80 ℃，RNA 提取方法、質(zhì)量檢測及表達量檢測同本文材料與方法“1.4”。

1.6 細菌感染斑點叉尾鮰后IL-22表達分析

取出-80 ℃保存的魯氏耶爾森氏菌菌種，待其解凍后取200 μL 放入腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng) 18 h 后，3 000 r/min 離心 5 min，棄去培養(yǎng)液并用PBS 洗滌2 次。加入2 mL PBS 重懸細菌，以10-1為單位依次用PBS 稀釋。經(jīng)預實驗最終選取稀釋至10-3的菌液，終濃度為1.5×107CFU/mL，該濃度能導致斑點叉尾鮰感染且不致死。將180 尾規(guī)格一致且健康的斑點叉尾鮰隨機分為2組（對照組和魯氏耶爾森氏菌注射組）。實驗組斑點叉尾鮰腹腔注射200 μL 魯氏耶爾森氏菌（1.5×107CFU/mL），每個取樣時間點對應的對照組均注射等劑量PBS。注射后6、12、24和48 h取樣，每個時間點取樣時實驗組和對照組各取4個平行。MS-222將斑點叉尾鮰麻醉后分別取鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織，放于TRIzol溶液中，待組織充分破碎后，暫存于-80 ℃。RNA 提取方法、質(zhì)量檢測及表達量檢測同本文“1.4”。海豚鏈球菌注射實驗參照魯氏耶爾森氏菌注射實驗進行。

1.7 病毒感染斑點叉尾鮰后IL-22表達分析

斑點叉尾鮰腎細胞復蘇、培養(yǎng)詳見本文材料與方法“1.5”。顯微鏡下觀察到6孔板中平鋪單層對數(shù)生長期的CCK后，接種CCV。待其在28 ℃成功吸附2 h后，棄去未吸附病毒懸液，再用無菌PBS洗滌3次后，加入含5% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，待細胞培養(yǎng)瓶中90%細胞出現(xiàn)細胞病變（CPE）后收毒，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?94尾斑點叉尾鮰均分為2 組，實驗組腹腔注射80 μL CCV，對照組注射等體積DMEM 處理。每個采樣時間點對照組和實驗組各取4 個平行。感染后1、3 和5 d 分別取鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織并放于TRIzol 溶液中，待組織充分破碎后，暫存于-80 ℃。RNA 提取方法、質(zhì)量檢測及表達量檢測同本文“1.4”。

1.8 農(nóng)藥刺激斑點叉尾鮰后IL-22表達分析

將300 尾斑點叉尾鮰隨機均分為3 組，對照組養(yǎng)殖用水為充分曝氣自來水，試驗組為溴氰菊酯浸泡低質(zhì)量濃度組（0.5 μg/L）、高質(zhì)量濃度組（5 μg/L）。浸泡期間時刻觀察魚體狀態(tài)。取樣時實驗組和對應對照組隨機選4 尾進行取樣。取樣前先用MS-222麻醉魚體，剪刀無菌處理后剪斷鰓弓放血處死，迅速取鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織。置于含1 mL TRIzol溶液的無菌無酶EP管中，4 ℃充分破碎后，-80 ℃暫存，RNA 提取方法、質(zhì)量檢測及表達量檢測同本文“1.4”。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準誤”表示。采用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進行單因素分析以及t檢驗，采用Prism8.0 作圖，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)顯著相關，P＜0.01表示數(shù)據(jù)具極顯著相關性。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-22 CDS區(qū)克隆與多序列比對分析

對PCR 擴增產(chǎn)物進行測序，獲得IL-22CDS 區(qū)534 bp，前18 個氨基酸殘基為預測的信號肽（MNCAVLAVLVVLCCCCAL），編碼 177 個氨基酸，分子質(zhì)量20.07 ku，理論等電點7.06。該序列含有IL-10 家族的特征序列（NNTKAQNKAIGETDILF）（圖1）。

圖1 斑點叉尾鮰核苷酸及預測氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequence of channel catfish

斑點叉尾鮰IL-22和其他物種IL-22氨基酸多序列比對結(jié)果（圖 2）顯示，該序列含有 6 個α 螺旋，4 個保守的半胱氨酸殘基，分別位于118、119、166 和215位。118 位和 166 位，119 位和 215 位分別形成 2 個二硫鍵。

圖2 斑點叉尾鮰與其他物種IL-22氨基酸序列比對Fig.2 Multiple sequence alignments of I.punctatus with other known IL-22 amino acids sequences

2.2 序列相似性和進化分析

IL-22 氨基酸序列與硬骨魚類、哺乳動物、飛禽和兩棲類共14種脊椎動物的氨基酸序列比對結(jié)果顯示具有一定的保守性。斑點叉尾鮰與黑鮰（Ameiurus melas）IL-22 氨基酸序列一致性高達95.48%；與條紋鯰（Pangasianodon hypophthalmus）一致性為88.7%，與巨魾（Bagarius yarrelli）一致性為85.88%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，硬骨魚類的IL-22 各自聚為一支；飛禽、哺乳類、兩棲類各聚為一支（圖3）；其中斑點叉尾鮰IL-22 與條紋鯰和黑鮰親緣關系最近。如圖4所示，從進化結(jié)果看，IL-22 位于 IL-26 和 MDM1 之間，并與IFN-γ 共線。整體分析看來，從哺乳動物人（Homo sapiens）、禽類雞（Gallus gallus）、兩棲類中華鱉（Pelodiscus sinensis），一直到脊椎動物斑馬魚、斑點叉尾鮰，序列相似性和進化分析充分體現(xiàn)了不同物種的IL-22基因在進化過程中的保守性。

圖3 IL-22氨基酸系統(tǒng)進化樹（NJ）Fig.3 The phylogenetic trees of IL-22 amino acids sequences（Neighbor-joining）

圖4 基因同線性Fig.4 Genetic synteny

2.3 IL-22 的組織分布表達分析

qRT-PCR 檢測IL-22在斑點叉尾鮰各個組織中表達量的結(jié)果顯示，IL-22廣泛分布于后腸、中腎、皮膚、頭腎、肌肉、鰓、性腺、肝臟、脾臟和心臟中。其中后腸中IL-22表達量最高，其次是中腎，脾臟和心臟中表達量較低（圖5）。

圖5 斑點叉尾鮰IL-22的組織分布Fig.5 The distribution of IL-22 mRNA in I.punctatus

2.4 不同誘導模式下IL-22的表達狀況

1）IL-22在 CCK 中的表達。如圖6 所示，Poly（I：C）和LPS 刺激斑點叉尾鮰腎細胞后24～48 hIL-22持續(xù)上調(diào)，LPS刺激后IL-22mRNA 表達量呈逐漸上升趨勢。斑點叉尾鮰腎細胞在PHA 和PMA 刺激下24～48 h表達量持續(xù)下調(diào)，顯著低于正常表達水平。

圖6 不同誘導下IL-22在CCK中相對表達圖譜Fig.6 The relative expression profile of IL-22 in CCK under different induction

2）微生物脅迫下IL-22的表達變化。（1）魯氏耶爾森氏菌感染魚體后IL-22的表達變化。隨著感染時間的變化，魯氏耶爾森氏菌感染斑點叉尾鮰后6～48 h內(nèi)在鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織中IL-22mRNA 表達量整體呈上調(diào)狀態(tài)，鰓中IL-22表達量下調(diào)。鰓中表達量于24 h 達峰值，隨后下降。后腸中IL-22整體呈升高趨勢，48 h 檢測到表達量最高。脾臟表現(xiàn)為急性期6 h 瞬時上調(diào)應答，但整體呈下降趨勢。中腎和頭腎中IL-22整體呈上調(diào)變化，12 h達峰值（圖7 A（e）和（f））。

（2）海豚鏈球菌感染魚體后IL-22的表達變化。海豚鏈球菌感染斑點叉尾鮰48 h 內(nèi)IL-22動態(tài)表達譜如圖7B 所示。皮膚、后腸、脾臟和頭腎中IL-22表達量均于48 h 達最高值，整體呈持續(xù)上升。感染后24 h，中腎中表達量最高，整體呈先升高后下降趨勢。6～48 h內(nèi)鰓中IL-22表達量下調(diào)。

（3）CCV 感染魚體后IL-22的表達變化。對斑點叉尾鮰進行攻毒后第1 天，鰓、脾臟和頭腎中IL-22mRNA 表達量均達到峰值，且表現(xiàn)為逐漸下降，1～3 d 持續(xù)性上調(diào)變化。CCV 感染后，后腸中IL-22表達量變化趨勢先下降后上升，第5 天表達量最高。中腎中IL-22表達量第1 天上調(diào)后，隨攻毒時間發(fā)展（3～5 d）均下調(diào)（圖7 C（e））。

（4）溴氰菊酯浸泡魚體后IL-22的表達變化。如圖7 D 所示，溴氰菊酯浸泡后斑點叉尾鮰鰓中持續(xù)下調(diào)反應，皮膚、后腸、中腎和頭腎均表現(xiàn)為低濃度IL-22mRNA 表達量上升，高濃度下降，持續(xù)上調(diào)應答。脾臟則表現(xiàn)為逐漸上調(diào)變化，高濃度刺激后表達量為對照組2.2倍。

圖7 不同刺激下IL-22在魚體中mRNA表達分析Fig.7 The mRNA expression analysis of IL-22 in channel fish under different stimulate

3 討 論

IL-22 作為IL-10 家族的一員，在免疫反應中常發(fā)揮重要作用。qRT-PCR結(jié)果顯示，IL-22基因在斑點叉尾鮰多種組織中均有表達。這種表達模式存在物種間宿主差異。在草魚中，IL-22 主要分布于鰓和后腸［13］；在黃顙魚鰭條、鰓和皮膚黏液中表達較高［11］；而鱖中鰓、幽門盲囊分布較多［14］。虹鱒中腸道表達量最高，其次是尾鰭、鰓和性腺［9］。本研究顯示IL-22主要分布在斑點叉尾鮰的后腸和中腎，心臟中最少。這些結(jié)果表明IL-22 主要表達于黏膜免疫組織或一些系統(tǒng)性免疫器官中。

IL-22 的有效誘導通常體現(xiàn)在細菌、病毒以及一些外源誘導下魚的黏膜組織和相關免疫器官中IL-22mRNA 表達水平的上調(diào)［11，14-15］。這與本試驗中魯氏耶爾森氏菌和海豚鏈球菌、CCV 感染斑點叉尾鮰以及溴氰菊酯浸泡斑點叉尾鮰后IL-22mRNA 表達量上調(diào)一致，不同的是海豚鏈球菌和CCV 感染后鰓和皮膚中呈現(xiàn)下調(diào)，究其原因可能是免疫細胞遷移的結(jié)果。魯氏爾森氏菌感染后斑點叉尾鮰脾臟6 h響應最激烈，隨后是鰓24 h，后腸48 h。符合其致病機制中早期階段先通過鰓和胃腸道上皮細胞侵入，隨后經(jīng)血液循環(huán)，加速病原擴散，進一步感染免疫器官，最后全面攻擊免疫系統(tǒng)的規(guī)律［16］。海豚鏈球菌攻擊斑點叉尾鮰后，皮膚、后腸、脾臟和頭腎IL-22mRNA 表達量于48 h 達到峰值，隨后恢復正常水平。中腎于24 h 達到峰值后下降。類似的結(jié)果出現(xiàn)在無乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）刺激鮻魚（Liza haematocheila）后，其腎臟、脾臟和腸中IL-22均上調(diào)約5 倍［17］。從某種角度反映出革蘭陽性菌刺激宿主后短時間內(nèi)細菌持續(xù)復制，機體強烈的反應導致IL-22分泌量大幅上調(diào)。這可能與海豚鏈球菌粘附侵入、破壞上皮細胞后經(jīng)巨噬細胞內(nèi)化快速傳播至整個魚體有關［18］。斑點叉尾鮰發(fā)病后期體表大面積彌漫性出血，內(nèi)臟明顯腫脹，推測IL-22分泌量與組織的健康狀況呈正相關，一定程度上IL-22 可成為健康狀態(tài)的評判指標。低濃度溴氰菊酯浸泡斑點叉尾鮰后大部分組織IL-22呈現(xiàn)高表達，高濃度下則相反。當斑點叉尾鮰暴露于合適濃度溴氰菊酯下時，游離氨基酸上升促進了應答時能量的供應［19-20］，故也很可能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生激活作用。此外，鰓中表達量的下調(diào)可能是免疫細胞特別是黏膜組織的損傷，抑制表達的結(jié)果。研究表明溴氰菊酯能導致魚鰓上皮細胞的病變［21-22］，溴氰菊酯作為一種殺蟲劑主要攻擊機體的呼吸系統(tǒng)，鰓中IL-22下調(diào)極可能是由此引發(fā)。

受 Poly（I：C）和 LPS 刺 激 后 CCK 中IL-22mRNA 表達量均呈現(xiàn)上升趨勢，能促使非特異性免疫得到一定程度的刺激［23］。已證實PHA和100 ng/mL PMA刺激大菱鲆頭腎細胞、虹鱒脾細胞3～24 h持續(xù)高表達［9-10］，而本研究中 0.5 μg/mL PMA 作用于斑點叉尾鮰腎細胞后表達下調(diào)。PMA 和PHA 都是T細胞誘導劑，同時PMA 也可作為細胞內(nèi)信號通路的刺激因子，刺激相關細胞因子間接促進IL-22的表達［10］。本研究中24～48 h 內(nèi)PHA 和PMA 刺激斑點叉尾鮰腎細胞后IL-22均顯示下調(diào)反應，這可能是觀察時間不同所造成的。此外不同濃度的PMA 對于細胞本身的誘導程度也有區(qū)別。

斑點叉尾鮰在不同誘導模式下，腸道、脾臟、中腎和頭腎中IL-22均上調(diào)表達。此外，由于本試驗中細菌和病毒是腹腔注射的，此感染模式下可能存在部分黏膜組織應答的延遲，亦導致鰓和皮膚不同刺激下IL-22表達的不穩(wěn)定。從免疫學的角度上看，T淋巴細胞和B 淋巴細胞存在于魚的腸道中［24］，腸道可能是病原體的入口［25］，通過白細胞浸潤促使IL-22的分泌，從而抑制腸道炎癥［26-27］。免疫器官脾臟、中腎和頭腎在細菌和病毒入侵后刺激免疫細胞遷移，調(diào)節(jié)免疫應答。

綜上，本試驗獲得的斑點叉尾鮰IL-22 氨基酸序列在進化上高度保守，IL-22在斑點叉尾鮰各檢測組織中均表達并且能夠參與不同誘導下鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織以及CCK 中的免疫響應，不同誘導下不同組織中表達模式存在差異，推測斑點叉尾鮰IL-22基因參與抗病原免疫反應。