馮婉嫻，黃漢英，陳翊平，王知龍，陳瑞

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

目前，重金屬污染不僅對(duì)生態(tài)環(huán)境和水產(chǎn)品的質(zhì)量安全會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，也會(huì)影響人類的身體健康，尤其當(dāng)水質(zhì)環(huán)境中銅離子濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)造成大量水產(chǎn)品死亡［1］，銅離子通過(guò)水產(chǎn)品進(jìn)入人體，當(dāng)攝入量超過(guò)人體所需正常值后，會(huì)損傷人體器官。因此，建立一種檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單和靈敏度高的重金屬銅離子檢測(cè)方法具有重要的意義。

重金屬常規(guī)檢測(cè)方法有電化學(xué)檢測(cè)法［2］、化學(xué)傳感器技術(shù)［3］和光譜法［4］等，其中電化學(xué)檢測(cè)法在檢測(cè)前需要修飾電極，化學(xué)傳感器技術(shù)需要制備檢測(cè)傳感器，操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)。光譜法是一種新型檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)快速、無(wú)損檢測(cè)，且靈敏度高，但是該方法需要昂貴的檢測(cè)儀器，檢測(cè)成本高。

2001年 Sharpless 等［5］提出一種以碳雜原子鍵合成為基礎(chǔ)的組合化學(xué)方法，即點(diǎn)擊化學(xué)。點(diǎn)擊化學(xué)中有一類經(jīng)典的化學(xué)反應(yīng)是Cu+催化疊氮化合物和炔基化合物反應(yīng)生成1，2，3-三唑五元環(huán)化合物，通過(guò)五元環(huán)共價(jià)將上述2 種化合物連接起來(lái)。這種方法具有條件溫和、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速且產(chǎn)物無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)，目前利用點(diǎn)擊化學(xué)法構(gòu)建生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用［6］。

顆粒計(jì)數(shù)法主要有圖像計(jì)數(shù)法［7］、光散射法［8］、流式細(xì)胞術(shù)［9］和電阻法［10-12］等，其中圖像計(jì)數(shù)法和光散射法準(zhǔn)確度受顆粒重疊、分層和分散程度等因素的影響，流式細(xì)胞術(shù)適合熒光標(biāo)記的顆粒，適用場(chǎng)合有限。與上述方法相比，電阻法具有分辨率高、檢測(cè)快速、適用范圍廣的優(yōu)勢(shì)。本研究采用電阻法研制液體顆粒計(jì)數(shù)器，結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)法，將聚苯乙烯微球作為檢測(cè)探針，建立一種快速檢測(cè)水中銅離子的方法，旨在為重金屬銅離子的快速檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

電阻法液體顆粒計(jì)數(shù)系統(tǒng)由顆粒脈沖信號(hào)采集與處理系統(tǒng)和液路控制系統(tǒng)兩部分組成［13］，其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框圖Fig.1 System block diagram

1）顆粒脈沖信號(hào)采集與處理系統(tǒng)。顆粒脈沖信號(hào)采集與處理系統(tǒng)由電極傳感器、放大電路、數(shù)據(jù)采集卡和計(jì)算機(jī)組成，采用NI DAQ Express 和Lab-VIEW開發(fā)了顆粒計(jì)數(shù)軟件，對(duì)顆粒脈沖信號(hào)進(jìn)行存儲(chǔ)、處理、計(jì)數(shù)和顯示。電極傳感器包括鉑片電極和小孔管，小孔管底部鑲嵌直徑7 mm、厚度0.5 mm 玻璃片，玻璃片中間打有直徑50 μm的微孔。放大電路選用TL084C 運(yùn)算放大器模塊。數(shù)據(jù)采集卡選用NI USB-6361 數(shù)據(jù)采集卡，具有16 路模擬輸入端口，ADC 分辨率為16 位。計(jì)算機(jī)處理器選用Intel Core i5-10200H CPU，64位操作系統(tǒng)。

2）液路控制系統(tǒng)。液路控制系統(tǒng)由數(shù)據(jù)采集卡、繼電器、液位檢測(cè)傳感器等組成，數(shù)據(jù)采集卡作為控制器，具有24路數(shù)字輸入/輸出端口。繼電器選用四路光耦隔離繼電器模塊，采用SRD-05VDC-SLC 電磁繼電器。繼電器模塊通過(guò)I/O 引腳與數(shù)據(jù)采集卡連接，用于控制蠕動(dòng)泵、微型氣泵、微型水泵和電磁閥的通斷，實(shí)現(xiàn)充清洗液、進(jìn)樣和排廢液。液位檢測(cè)傳感器選用XKC-Y26A-NPN傳感器模塊。

1.2 材料與儀器

羧基修飾的聚苯乙烯微球（polystyrene microspheres，PS），粒徑2～9 μm，Bangs Laboratories公司；羧基修飾的磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles with carboxylic acid functionalized，MNP1000），粒徑1 000 nm，質(zhì)量濃度10 g/L，Thermo Fisher Scientific公司；炔基-四聚乙二醇羧酸、疊氮-四聚乙二醇羧酸，Click Chemistry Tools 公司；抗壞血酸鈉（sodium ascorbate，SA），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺活潑酯（N-hydroxysulfosuccinimide sodium，NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）-carbodiimide，EDC），Sigma-Aldrich 公司；磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphate buffer，PBS）（pH 7.4）、含 0.05% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer-tween，PBST）、五水硫酸銅、0.9%生理鹽水溶液（電導(dǎo)率62.5 Ω·cm），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；配制試劑所用水均為去離子水。

水 質(zhì) 樣 品 ：武 漢 市 南 湖（N30°28′27.83″，E114°22′11.67″）湖水、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)自來(lái)水、池塘水樣和試驗(yàn)田水渠水樣。

SuperMag Multitube Separator 磁分離架，Ocean Nano Tech 公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，Sigma 公司；AA-6300C 原子吸收分光光度計(jì)，Shimadzu 公司；RC-2100 顆粒計(jì)數(shù)器，珠海歐美克儀器有限公司；筆者所在實(shí)驗(yàn)室制作的電阻法液體顆粒計(jì)數(shù)器。

1.3 信號(hào)采集與處理

1）信號(hào)采集。當(dāng)顆粒通過(guò)微孔時(shí)，會(huì)引起電極兩端電阻的變化，產(chǎn)生一個(gè)電壓脈沖。電極兩端電阻與溶液的電阻率、顆粒粒徑和微孔尺寸有關(guān)［14］。在恒流源電路中，當(dāng)顆粒粒徑增加時(shí)，電極兩端電阻增加，電壓脈沖峰值增大，根據(jù)電壓脈沖峰值及個(gè)數(shù)可區(qū)分不同粒徑顆粒并進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)。

通過(guò)NI DAQ Express 采集顆粒脈沖信號(hào)，設(shè)置采樣頻率1 MHz和采樣通道Dev/ai0等參數(shù)，將顆粒脈沖信號(hào)存儲(chǔ)為TDMS文件格式，運(yùn)用LabVIEW 對(duì)信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理、建立模型及顆粒計(jì)數(shù)。

2）信號(hào)處理。受環(huán)境干擾，信號(hào)中含有噪聲，需進(jìn)行預(yù)處理，將異常的脈沖剔除。將后一個(gè)脈沖峰值位置與前一個(gè)脈沖峰值位置之差與顆粒信號(hào)脈沖的脈寬進(jìn)行比較。當(dāng)W≥0，判斷脈沖為顆粒脈沖；當(dāng)W＜0，判斷為異常脈沖并剔除。

式（1）中，Wa為后一個(gè)脈沖峰值位置，Wb為前一個(gè)脈沖峰值位置，K為脈沖寬度。

1.4 模型建立

1）建立顆粒粒徑識(shí)別模型。應(yīng)用小波多尺度峰值檢測(cè)方法提取電壓脈沖峰值，將峰值按照從小到大的順序排列，計(jì)算每種峰值的頻率和累計(jì)頻率。當(dāng)累計(jì)頻率到達(dá)50%時(shí)，將此時(shí)的峰值作為粒徑的響應(yīng)電壓，方法可參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6167—2007《塵埃粒子計(jì)數(shù)器性能試驗(yàn)方法》。計(jì)算公式如下：

式（2）～（4）中，fPi為脈沖峰值i的頻率，Ni為峰值i出現(xiàn)的個(gè)數(shù)，n為樣本中峰值種類，fAj為峰值j的累計(jì)頻率，Ud是顆粒粒徑d的響應(yīng)電壓。

采集 2、3、4、5、6 和 9 μm 6 種顆粒信號(hào)，對(duì)應(yīng)顆粒質(zhì)量濃度分別為 0.5、0.5、1、2、2 和 10 mg/L。每種粒徑重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值為響應(yīng)電壓。根據(jù)上述方法確定不同粒徑的響應(yīng)電壓，采用冪函數(shù)擬合曲線，建立顆粒粒徑識(shí)別模型。

2）顆粒計(jì)數(shù)模型。將脈沖峰值與閾值電壓UY進(jìn)行比較，若脈沖峰值大于UY，則計(jì)數(shù)為一個(gè)顆粒脈沖，通過(guò)累計(jì)脈沖的數(shù)量得到顆粒的個(gè)數(shù)。計(jì)數(shù)公式如下：

式（5）～（7）中，Nd為粒徑d的顆粒數(shù)量，NUY為脈沖峰值大于UY的顆粒數(shù)量。

1.5 裝置評(píng)價(jià)

1）顆粒粒徑識(shí)別模型評(píng)價(jià)。采集 3、4、5、6 μm 4 種顆粒信號(hào)，采用顆粒數(shù)量相近且質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、2 mg/L 的溶液進(jìn)行測(cè)試，每種顆粒重復(fù)測(cè)量10 次，計(jì)算粒徑測(cè)試相對(duì)誤差SD和粒徑測(cè)試相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDD，公式如下：

2）顆粒計(jì)數(shù)模型評(píng)價(jià)。采集3、4、6、9 μm 4種顆粒信號(hào)，質(zhì)量濃度分別為20、40、40、100 mg/L，每種顆粒重復(fù)測(cè)試10次，計(jì)算顆粒計(jì)數(shù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDN。

3）裝置評(píng)價(jià)。配制9 μm 顆粒溶液（0.05～1 000 mg/L），采用本裝置和RC-2100顆粒計(jì)數(shù)器分別進(jìn)行測(cè)試，每種質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)試3 次，取平均值作測(cè)試值，計(jì)算顆粒計(jì)數(shù)相對(duì)誤差SN。

式（8）～（11）中，Ds為標(biāo)準(zhǔn)顆粒粒徑，Dv為識(shí)別顆 粒 粒 徑 ，Ns為 RC-2100 測(cè) 試 值 ，Nt為 本 裝 置 測(cè)試值。

1.6 樣品制備

1）疊氮-微球偶聯(lián)物（Azido-PS4000）的制備。取100 μL EDC（10 g/L）和50 μL NHS（10 g/L）溶液到10 μL 微球（100 g/L）溶液中，在室溫中振蕩 20 min活化微球。將上述混合溶液置于離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置8 000 r/min，移除上清，用1 000 μL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）溶液重懸，加入 23 μL疊氮-四聚乙二醇羧酸（200 mmol/L），室溫振蕩反應(yīng)2 h。結(jié)束后，將溶液置于離心機(jī)中，條件同上，移除上清，微球溶液用1 000 μL PBST 洗滌后，移除上清，用1 000 μL PBST重懸，1 mL Azido-PS4000（1 g/L）溶液制備完成，保存于4 ℃冰箱，備用。

2）炔基-磁珠偶聯(lián)物（Alkyne-MNP1000）的制備。取 100 μL EDC（10 g/L）和 50 μL NHS（10 g/L）溶液到100 μL 磁珠（10 g/L）溶液中，在室溫中振蕩反應(yīng)20 min 活化磁珠。將上述混合溶液置于磁分離架上磁分離20 s，用1 000 μL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）溶液重懸，加入11 μL 炔基-四聚乙二醇羧酸（372 mmol/L），室溫上振蕩2 h。結(jié)束后，將溶液磁分離20 s，移除上清，用 1 000 μL PBST 洗滌，磁分離后移除上清，用 1 000 μL PBST 重懸，1 mL Alkyne-MNP1000（1 g/L）溶液制備完成，保存于4 ℃冰箱，備用。

1.7 測(cè)試方法

將上述步驟制備的Azido-PS4000和Alkyne-MNP1000分別稀釋到50、100 mg/L，取100 μL Azido-PS4000和100 μL Alkyne-MNP1000，加入到100 μL抗壞血酸鈉溶液（10 mmol/L）和100 μL Cu2+溶液（0.1、1、10、100、200、400、600、1 000 和 2 000 μmol/L）中均勻混合，室溫反應(yīng)10 min。實(shí)驗(yàn)原理如圖2 所示?？箟难徕c溶液將Cu2+還原成Cu+，Cu+催化疊氮和炔基特異性結(jié)合發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，形成疊氮-微球偶聯(lián)物和炔基-磁珠偶聯(lián)物的復(fù)合物。

圖2 疊氮-微球偶聯(lián)物和炔基-磁珠偶聯(lián)物的制備實(shí)驗(yàn)原理圖Fig.2 Experimental schematic diagram of Azido-PS4000 and Alkyne-MNP1000

將上述混合溶液置于磁分離架上磁分離，分離完全后，取上清液，使用電阻法液體顆粒計(jì)數(shù)器對(duì)上清液中微球進(jìn)行測(cè)試。

圖3為微球測(cè)試示意圖，測(cè)試步驟如下：

圖3 微球顆粒測(cè)試示意圖Fig.3 Schematic of particle testing

1）充清洗液。取 100 μL 上清液加入到 5 mL 生理鹽水中，混勻溶液，將溶液置于小孔管底部。通過(guò)數(shù)據(jù)采集卡控制蠕動(dòng)泵，將清洗瓶中的液體充入到小孔管中，液體到達(dá)液位檢測(cè)傳感器A 后，蠕動(dòng)泵關(guān)閉。

2）進(jìn)樣及數(shù)據(jù)采集。通過(guò)微型氣泵使小孔管內(nèi)部產(chǎn)生負(fù)壓，將含有微球的樣品溶液吸入到小孔管，同時(shí)數(shù)據(jù)采集卡采集顆粒數(shù)據(jù)，液體到達(dá)液位檢測(cè)傳感器B后，微型氣泵關(guān)閉，停止進(jìn)樣。

3）排廢液。微型水泵和電磁閥接通，將小孔管內(nèi)微球溶液排出到廢液瓶，液體到達(dá)液位檢測(cè)傳感器A后，微型水泵和電磁閥關(guān)閉。

4）顆粒計(jì)數(shù)。采用LabVIEW 軟件對(duì)顆粒數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、計(jì)數(shù)，最后輸出顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果，根據(jù)顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果，建立銅離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)計(jì)濃度計(jì)算軟件，方便后續(xù)測(cè)試實(shí)際樣品時(shí)，可通過(guò)顆粒數(shù)量直接得出銅離子濃度。

1.8 銅離子檢測(cè)時(shí)間

銅離子檢測(cè)時(shí)間包括樣品進(jìn)樣操作時(shí)間和顆粒計(jì)數(shù)輸出銅離子檢測(cè)結(jié)果時(shí)間兩部分，第一部分是充清洗液到排廢液整個(gè)過(guò)程；第二部分是通過(guò)Lab-VIEW進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)到輸出銅離子濃度值的時(shí)間，用電子時(shí)鐘記錄銅離子檢測(cè)時(shí)間。

1.9 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

采用原子吸收分光光度法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。原子吸收分光光度法測(cè)試步驟如圖4 所示。

圖4 原子吸收分光光度法測(cè)試步驟Fig.4 Atomic absorption spectrophotometry test steps

1）實(shí)際樣品檢測(cè)。取武漢南湖湖水、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)自來(lái)水、池塘水樣、試驗(yàn)田水渠水樣等17份實(shí)際樣品，分別用本研究方法與原子吸收分光光度法檢測(cè)水中銅離子。

2）實(shí)際樣品加標(biāo)檢測(cè)。選取3份實(shí)際樣本，分別添加 100 μL 系列濃度（10、40、80 μmol/L）銅離子溶液，用上述2 種方法分別檢測(cè)水中銅離子濃度，每種樣品重復(fù)測(cè)試3 次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 顆粒脈沖信號(hào)

經(jīng)測(cè)試，粒徑3、4、5、6 μm 顆粒脈沖信號(hào)幅值分別在0.25～0.5、1～1.5、1.5～2、2～3 V，6 μm 顆粒脈沖信號(hào)幅值最大，脈沖信號(hào)脈寬為 20 μs，3 μm 顆粒脈沖信號(hào)幅值最?。▓D5），表明隨著顆粒粒徑變大，脈沖信號(hào)幅值變大。

圖5 顆粒脈沖信號(hào)Fig.5 Particle pulse signal

2.2 顆粒粒徑識(shí)別模型

根據(jù)本文“1.4”節(jié)中所述方法確定不同粒徑顆粒的響應(yīng)電壓，2、3、4、5、6 和 9 μm 顆粒的響應(yīng)電壓分別為0.12、0.35、0.98、1.66、2.65 和10.52 V，隨著粒徑增加，顆粒響應(yīng)電壓增加。

根據(jù)不同粒徑響應(yīng)電壓，采用冪函數(shù)擬合曲線建立顆粒粒徑識(shí)別模型，擬合曲線如圖6所示。

圖6 顆粒粒徑識(shí)別曲線Fig.6 Particle size identification curve

2.3 裝置性能

1）顆粒粒徑識(shí)別模型評(píng)價(jià)。為測(cè)試顆粒計(jì)數(shù)器能否區(qū)分粒徑相差1 μm 的顆粒，選取了3、4、5、6 μm 4 種粒徑的顆粒，經(jīng)10 次重復(fù)測(cè)試后，粒徑測(cè)試結(jié)果如表1 所示，RSDD小于1%，SD小于5%，說(shuō)明該顆粒粒徑識(shí)別模型可靠，分辨率高，可準(zhǔn)確區(qū)分不同粒徑的顆粒。

表1 不同顆粒經(jīng)10次重復(fù)測(cè)試的粒徑結(jié)果Table 1 Particle size results of 10 repeat test for different particles μm

2）顆粒計(jì)數(shù)模型評(píng)價(jià)。為評(píng)價(jià)顆粒計(jì)數(shù)器對(duì)粒徑不同大小顆粒的計(jì)數(shù)穩(wěn)定性，選取了3、4、6、9 μm 4種顆粒，顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果如表2所示，由于粒徑越小的顆粒溶液，顆粒分布越密集，所以在4 種粒徑的顆粒溶液中，濃度最低的3 μm溶液顆粒個(gè)數(shù)最多，濃度最高的 9 μm 溶液顆粒個(gè)數(shù)最少。由于 3 μm 顆粒脈沖信號(hào)幅值較小，顆粒計(jì)數(shù)時(shí)，將部分噪聲信號(hào)計(jì)數(shù)為顆粒脈沖信號(hào)，導(dǎo)致粒徑3 μm 顆粒RSDN較大，而4種粒徑顆粒RSDN小于10%，說(shuō)明系統(tǒng)計(jì)數(shù)穩(wěn)定性較好。

表2 不同粒徑的顆粒經(jīng)10次重復(fù)測(cè)試的計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 Particle counting results of 10 repeat test for different particle size

3）裝置計(jì)數(shù)精度評(píng)價(jià)。裝置測(cè)試結(jié)果如圖7 所示，本裝置測(cè)試結(jié)果擬合曲線為：y=27.72x+330.33，R2=0.994，RC-2100 顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果擬合曲線為：y=30.32x+155.82，R2=0.997。與 RC-2100 顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較，顆粒計(jì)數(shù)相對(duì)誤差小于10%，說(shuō)明本裝置計(jì)數(shù)精度較高。

圖7 裝置對(duì)比結(jié)果Fig.7 Device comparison

2.4 微球-磁珠復(fù)合物的表征

根據(jù)上述裝置評(píng)價(jià)結(jié)果可知，本裝置粒徑測(cè)試SD小于5%，說(shuō)明本裝置可準(zhǔn)確區(qū)分不同粒徑顆粒，根據(jù)顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果可知，4、6、9 μm 3 種顆粒的RSDN均小于5%，由于粒徑越大的微球與1 μm 磁珠結(jié)合時(shí)，會(huì)影響磁分離效果，本研究選用4 μm 微球和1 μm磁珠進(jìn)行試驗(yàn)。

Azido-PS4000與 Alkyne-MNP1000復(fù)合物的顯微鏡表征結(jié)果如圖8 所示。圖8A～C 分別是添加銅離子濃度為 0、10、20 μmol/L 的表征結(jié)果，結(jié)果顯示，未添加銅離子的Azido-PS4000與Alkyne-MNP1000不會(huì)結(jié)合在一起（圖8A），而添加了銅離子后 ，會(huì) 形 成 Azido-PS4000與 Alkyne-MNP1000復(fù) 合 物（圖 8B、C），這是由于 Cu+使 Azido-PS4000和 Alkyne-MNP1000發(fā)生了環(huán)加成反應(yīng)，導(dǎo)致磁珠和微球進(jìn)行了結(jié)合，隨著銅離子濃度增加，磁珠和微球結(jié)合效果更明顯，證實(shí)Azido-PS4000與Alkyne-MNP1000成功結(jié)合。

圖8 微球和磁珠結(jié)合的顯微鏡照片F(xiàn)ig.8 Microscopic images of magnetic beads and bead binding

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖9為本研究方法建立的銅離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖 9A 可知，當(dāng)銅離子濃度從 10 μmol/L 上升到500 μmol/L 時(shí)，顆粒個(gè)數(shù)明顯下降。如圖9B 所示，在對(duì)數(shù)坐標(biāo)系下，當(dāng)銅離子濃度為10～1 000 μmol/L，線性方程為：y=4 224.42-424.79x（x=lg［Cu2+］），R2=0.997，銅離子濃度與顆粒個(gè)數(shù)之間的線性關(guān)系良好。檢測(cè)限（limit of detection，LOD）為2.29 μmol/L。

圖9 本研究方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）和線性范圍（B）Fig.9 The standard curve of this research method（A）and linear range（B）

圖10為原子吸收分光光度法建立的銅離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖10 可知，當(dāng)銅離子濃度在0～100 μmol/L，線 性 方 程 為 ：y=0.0075x-0.0101，R2=0.998，LOD為0.47 μmol/L。

圖10 原子吸收分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 Atomic absorption spectrophotometer standard curve

綜上，2 種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度良好，檢測(cè)限低，靈敏度高。

2.6 銅離子檢測(cè)時(shí)間

銅離子檢測(cè)時(shí)間約4 min，其中進(jìn)樣操作約2 min，顆粒計(jì)數(shù)及結(jié)果輸出約2 min 。與量子點(diǎn)熒光傳感器（10 min）［15］、陽(yáng)極溶出伏安法（6 min）［16］和生物傳感器（48 min）［17］等檢測(cè)方法相比，本研究測(cè)試時(shí)間更短。

2.7 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

本研究方法與原子吸收分光光度法均未在實(shí)際水質(zhì)樣品中檢測(cè)出銅離子，結(jié)果顯示實(shí)際水質(zhì)樣品中不含銅離子。

表3 為實(shí)際樣品加標(biāo)測(cè)試結(jié)果，由表3 可知，本研究方法平均回收率為87.85%～101.08%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.35%～6.53%，原子吸收分光光度法平均回收率為94.57%～102.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.74%～4.56%，本研究方法與原子吸收分光光度法相比，平均回收率相差不大，且不需要昂貴的檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)成本降低。并且在檢測(cè)銅離子濃度過(guò)程中，原子吸收分光光度法在測(cè)得吸光度后，仍需通過(guò)查詢銅離子標(biāo)準(zhǔn)曲線才能計(jì)算出銅離子濃度值，而本研究方法可通過(guò)顆粒計(jì)數(shù)軟件直接得出銅離子濃度值，操作更簡(jiǎn)便。

表3 實(shí)際樣品分析結(jié)果（n=3）Table 3 Results of actual sample analysis（n=3）

3 討 論

本研究采用電阻法研制了液體顆粒計(jì)數(shù)系統(tǒng)，通過(guò)確定不同粒徑的響應(yīng)電壓，建立了顆粒粒徑識(shí)別模型和顆粒計(jì)數(shù)模型。結(jié)果表明，粒徑識(shí)別相對(duì)誤差小于5%，與RC-2100 顆粒計(jì)數(shù)器測(cè)試結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，顆粒計(jì)數(shù)相對(duì)誤差小于10%，說(shuō)明本系統(tǒng)可識(shí)別不同粒徑的顆粒并計(jì)數(shù)，檢測(cè)精度較高。通過(guò)結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)法，本研究構(gòu)建了基于電阻法液體顆粒計(jì)數(shù)器的銅離子快速檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間約4 min，與量子點(diǎn)熒光傳感器、陽(yáng)極溶出伏安法和生物傳感器相比，本方法檢測(cè)時(shí)間更短，省略了復(fù)雜樣品制備的步驟，操作方法更簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度明顯提高。與暗場(chǎng)成像的LSPR 傳感器檢測(cè)銅離子的方法［3］（檢測(cè)限為9.69 μmol/L）對(duì)比，本研究使用聚苯乙烯微球作為檢測(cè)探針，提高了銅離子檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)限（2.29 μmol/L）更低，靈敏度更高，且滿足我國(guó)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB 5749－2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中水中銅離子濃度檢測(cè)限的要求（15.6 μmol/L）。對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，本研究方法和原子吸收分光光度法在檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)，測(cè)試結(jié)果基本一致，但原子吸收分光光度計(jì)儀器昂貴，而本研究方法無(wú)需昂貴的檢測(cè)儀器，檢測(cè)成本降低，直接輸出銅離子濃度值，省去了人工查詢標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，操作更簡(jiǎn)便。綜上，基于電阻法液體顆粒計(jì)數(shù)器的銅離子檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)。

本研究利用抗壞血酸將Cu2+還原成Cu+、Cu+催化疊氮和炔基進(jìn)行反應(yīng)的原理，根據(jù)聚苯乙烯微球數(shù)量的變化從而實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子的快速檢測(cè)，而重金屬污染包括Zn、Cr、Hg 等多種元素，后續(xù)將進(jìn)一步研究基于電阻法液體顆粒計(jì)數(shù)系統(tǒng)的多種重金屬同時(shí)檢測(cè)方法，以提高該方法的檢測(cè)效率。