袁志豪，李振鋒，陸月霞，蔡麗

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

百合（Liliumspp.）為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）的多年生草本植物，具有觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值和食用價(jià)值［1］。近年來我國百合種植業(yè)飛速發(fā)展，國內(nèi)觀賞百合種植面積迅速增加，主要分布于云南、四川、西藏、貴州、吉林、湖北、陜西、遼寧、河北、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、江西、浙江等?。▍^(qū)）［2］。然而，栽培過程中，百合常受到各種病害的侵染，常見病害有葉枯病、病毒病、鱗莖基腐病等［3］，其中，百合病毒病已經(jīng)嚴(yán)重影響了百合的產(chǎn)量和品質(zhì)。百合受病毒侵染常見的癥狀類型有輕花葉型、重花葉型、矮化型、叢簇矮化型、黃化矮化型、扁莖簇葉型、花變?nèi)~型等［4］。另一方面，隨著從國外引進(jìn)種球的數(shù)量和批次數(shù)目的增長，一些危害性大的檢疫性病毒傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸增大［5］。

目前國內(nèi)外報(bào)道侵染百合的病毒有20 多種（包括1種植原體），其中危害較嚴(yán)重、發(fā)生最普遍的有百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV）、百合無癥病毒（lily symptomless virus，LSV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV），常表現(xiàn)為復(fù)合侵染［6-7］。我國已報(bào)道的侵染百合的病毒有11種：包括車前草花葉病毒（plantago asiatica mosaic virus，PlAMV）［8］、剪秋蘿斑駁病毒（lychnis mottle virus，LycMoV）、百合黃脈病毒（lily yellow vein virus，LYVV）、百合內(nèi)生病毒（lily endomavirus，LEV）［9］、百合卷葉病毒（lily polerovirus virus，LPV）［9］、百合黃化花葉病毒（lily yellow mosaic virus，LYMV）［10］、李屬壞死環(huán)斑病毒（prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）［11］、CMV［12］、LMoV［13］、LSV［14］、南薺菜花葉病毒（arabis mosaic virus，ArMV）［15］，在這些病毒中，CMV、LSV、LMoV和PlAMV 是侵染百合植株的主要病毒［16］。

百合屬于無性繁殖，病毒可通過種球傳給后代，在田間也可以通過蚜蟲或汁液接觸傳播擴(kuò)散。病毒主要侵染百合的鱗莖、葉片、花等部位，病情嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)百合生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［17］。所以，加強(qiáng)百合病毒的檢測(cè)和監(jiān)控是十分必要的，對(duì)病毒的防控、無毒苗生產(chǎn)和海關(guān)檢疫等方面是必需的。

本研究從我國云南、浙江、江西、廣東、湖南和上海6個(gè)地區(qū)采集疑似感染病毒的百合葉片，從中提取總RNA，通過高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析和RTPCR 等技術(shù)，檢測(cè)侵染百合的病毒，分析不同病毒的發(fā)生率、地區(qū)分布和復(fù)合侵染情況等，旨在為百合無病毒種球和種苗的生產(chǎn)以及病毒病的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2020年9月至2021年12月，從云南、浙江、江西、上海、廣東、湖南6個(gè)地區(qū)，共采集表現(xiàn)疑似病毒癥狀的百合葉片樣品48份（表1），置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

植物總RNA 提取試劑盒、第一鏈cDNA 合成試劑盒、2×AccurateTaqMaster Mix（dye plus）、GL DNA Marker 100 Ladder、DNA 膠回收試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京擎科生物科技有限公司，TA 快速克隆試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 總RNA的提取

百合發(fā)病葉片總RNA 的提取參照試劑盒使用說明書進(jìn)行，提取的總RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。

反轉(zhuǎn)錄參照第一鏈cDNA 合成試劑盒說明操作。病毒RT-PCR 特異性檢測(cè)引物（表2）由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

百合樣品按云南省和浙江省2個(gè)地區(qū)，不同癥狀進(jìn)行混合，送貝瑞基因公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1）文庫構(gòu)建。植物總RNA 檢測(cè)合格后，通過去核糖體 RNA 試劑盒（Ribo-off?rRNA depletion kit，Vazyme Biotech Co.，Ltd）去除rRNA。隨后加入緩沖液將mRNA 打斷成短片段，以mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs 和 DNA polymerase I 和 RNase H 合 成 二 鏈cDNA，再用AMPure XP beads 純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA 先進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads 進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并用AMPure XP beads 純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。

2）文庫定量。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 對(duì)文庫的插入大小進(jìn)行檢測(cè)，插入大小符合預(yù)期后，使用Q-PCR 方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度＞2 nmol/L），以保證文庫質(zhì)量。

3）上機(jī)測(cè)序。文庫質(zhì)量經(jīng)檢測(cè)合格后，用Illumina Novaseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

4）數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析。將高通量測(cè)序返回的reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，去除低質(zhì)量、含有接頭的reads，然后針對(duì)每個(gè)樣品經(jīng)預(yù)處理得到的Clean reads，采用IDBA_UD［18］對(duì) clean reads 進(jìn)行拼接（K=19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119），得到contig，通過與Nr（NCBI non-redundant protein sequences）庫進(jìn)行Blast 比對(duì)（e值≤10-3）。由于每條序列可能會(huì)有多個(gè)比對(duì)結(jié)果，得到多個(gè)不同的分類級(jí)別，為了保證其生物學(xué)意義，采取LCA算法，將出現(xiàn)第一個(gè)分支前的分類級(jí)別，作為該序列的物種注釋信息。對(duì)注釋到的 Nr 數(shù)據(jù)庫的 contig 與 NCBI Taxonomic 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，獲取分類地位，最后提取注釋到病毒的contig，將 contig 在 NCBI 中進(jìn)行 Blastn 和 BlastX 搜索比對(duì)，將比對(duì)到病毒的序列及病毒種類整理匯總。

1.5 RT-PCR驗(yàn)證及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)注釋到的病毒contig，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物檢測(cè)樣品中的病毒。提取百合樣品的總DNA和總RNA。提取的RNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下利用隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈。用DNA聚合酶和特異性引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。50 μL 反應(yīng)體系包含 2×Accurate Taq Master Mix（dye plus）25 μL，ddH2O 20 μL，cDNA 2 μL，引物F 1.5 μL，引物R 1.5 μL；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性30 s，98 ℃變性10 s，退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸2 min。PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收目標(biāo)片段，經(jīng)DNA 純化試劑盒純化后連入One step ZTOPO-Blunt/TA 載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定。RT-PCR 檢測(cè)后統(tǒng)計(jì)分析侵染百合病毒的種類、病毒侵染率、各地區(qū)病毒分布情況和病毒復(fù)合侵染情況等。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合病毒病主要癥狀

2020年 9 月至 2021年 12 月，從 6 個(gè)地區(qū)共采集表現(xiàn)疑似病毒癥狀的百合葉片樣品48份，感病植株主要表現(xiàn)為花葉、黃化、皺縮、畸形、矮化等癥狀（圖1）。

圖1 百合病毒病田間癥狀類型Fig.1 Symptom types of lily virus disease in the field

2.2 高通量測(cè)序及分析

將最早采于云南和浙江兩省表現(xiàn)不同癥狀的百合葉片RNA 混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共獲得109 041 624 對(duì)clean reads。其中云南樣品（BH-YN）得到55 080 214 對(duì) clean reads，占reads 總數(shù)的 98.40%，拼接后得到 142 767 條 contigs，注釋到病毒相關(guān)的有1 719 條contigs，302 912 個(gè)堿基；浙 江樣品（BH-ZJ）得 到 53 961 410 對(duì) clean reads，占reads總數(shù)的98.35%，拼接后得到165 202條contigs，注釋到病毒相關(guān)的有1 278條contigs，224 321個(gè)堿基。

比對(duì)到病毒序列的contigs 包括：8 條注釋為CMV，456 條 注 釋 為 PlAMV，1 534 條 注 釋 為LMoV，11 條注釋為 DMV，39 條注釋為RYVV，6 條注釋為FMV，2 條注釋為DCMV，1 條注釋為Cs-VMV，2 條contig 未比對(duì)到已知病毒，可能是新病毒（表3）。

表3 百合測(cè)序結(jié)果中比對(duì)到的8種已知病毒Table 3 Parameters of contigs of eight known viruses from lily sequencing results

2.3 RT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)測(cè)序分析獲得的8種病毒的序列，以及設(shè)計(jì)合成的每種病毒的特異性引物，利用RT-PCR 對(duì)測(cè)序結(jié)果中的已知病毒進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在百合樣品中擴(kuò)增到了與 CMV、PlAMV、LMoV、DMV、FMV、RYVV 6種病毒預(yù)期相符的條帶，而未擴(kuò)增到DCMV 和CsVMV 相應(yīng)的條帶（圖2）。對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證中得到的百合樣品中的6 種病毒擴(kuò)增條帶進(jìn)行克隆和測(cè)序分析，結(jié)果顯示測(cè)序正確，符合預(yù)期大小。

圖2 百合6種病毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of RT-PCR amplification of 6 viruses from lily

對(duì)采集的48份樣品進(jìn)行了上述6 種病毒的RTPCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示：6 種病毒的檢出率從14.58%～100%不等。其中，DMV和RYVV的檢出率最高，均為100%，其次是PlAMV 和LMoV，檢出率均為95.83%，然后是FMV，檢出率為85.42%，檢出率最低的是CMV，為14.58%。

2.4 百合病毒的分布及復(fù)合侵染情況

對(duì)6 個(gè)地區(qū)的病毒分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：云南地區(qū)6 種病毒都有，上海市有3 種，其他地區(qū)存在4～5 種病毒，不同地區(qū)侵染百合的病毒種類差別不大。其中，CMV 只在云南地區(qū)檢測(cè)出，LMoV、DMV和RYVV 在6個(gè)地區(qū)都存在，表明這3種病毒分布范圍最廣（表4），發(fā)生最普遍。

表4 我國6個(gè)地區(qū)檢出的百合病毒Table 4 Lily viruses detected in 6 regions of China

對(duì)6 種病毒的復(fù)合侵染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：百合單個(gè)樣品可檢測(cè)出3～6 種病毒，其中僅有1個(gè)樣品檢測(cè)到3種病毒復(fù)合侵染，LMoV、DMV、RYVV 3 種病毒復(fù)合侵染率最低，為2.08%；LMoV、PlAMV、DMV、RYVV 和FMV 5 種病毒復(fù)合侵染率最高，為62.50%；6種病毒復(fù)合侵染的樣品有7個(gè)，復(fù)合侵染率為14.58%，表明田間自然發(fā)病存在普遍的復(fù)合侵染現(xiàn)象。從病樣采集地來看，云南地區(qū)的百合病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象最復(fù)雜，存在6 種復(fù)合侵染類型，詳情見表5。

表5 48份百合樣品中6種病毒復(fù)合侵染情況Table 5 Mixed infection of 6 viruses in 48 lily samples

3 討 論

本研究通過對(duì)疑似百合病毒病樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析得到LMoV、CMV、PlAMV、DMV、FMV、RYVV、DCMV、CsVMV 8種已知病毒和2種未知病毒的序列信息。利用RT-PCR 在百合樣品中檢測(cè)到除DCMV 和CsVMV 以外的6 種病毒。在已知病毒中，DMV 和RYVV 在所有樣品中均有檢出，檢出率最低的是CMV，且僅在云南昆明市的樣品中檢出。LMoV、DMV和RYVV分布范圍最廣，在6個(gè)地區(qū)都有分布。

我們的檢測(cè)結(jié)果與前人的報(bào)道既有相同之處，又有所不同。CMV、LMoV 和LSV 被認(rèn)為是百合上的三大病毒，很多研究直接利用ELISA 法或者RTPCR 技術(shù)檢測(cè)這3 種病毒。王連春等［19］對(duì)侵染云南食用百合的病毒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CMV、LSV 和LMoV 的檢出率分別為60%、50%和30%，且CMV和LSV 的復(fù)合侵染率為20%，本研究在云南樣品中檢測(cè)出CMV 和LMoV，未檢測(cè)出LSV。江西萬載縣的百合葉片中檢測(cè)出PlAMV、LMoV、DMV 和RYVV 4 種病毒，未檢測(cè)出CMV 和LSV；葉曉夢(mèng)等［12］采用多重RT-PCR 技術(shù)對(duì)江西省蓮花縣的百合葉片所攜帶的上述3 種病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示含有CMV 和LMoV；謝晚彬等［13］采用RT-PCR 技術(shù)在江西萬載縣的龍牙百合鱗莖中對(duì)CMV、LMoV 和LSV的檢測(cè)結(jié)果表明，3 種病毒中僅有LMoV 呈陽性；本研究中浙江海寧市和杭州市百合葉片中檢測(cè)出了PlAMV、LMoV、DMV、RYVV 和FMV 5 種病毒，未檢測(cè)出CMV；而沈嘉樂等［20］采用間接 ELISA 法對(duì)浙江杭州市從荷蘭引進(jìn)的百合和杭州本地栽種的百合樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，LMoV 和LSV 均有發(fā)現(xiàn)，且LSV 侵染樣品均為與LMoV 復(fù)合侵染。劉文洪［11］在進(jìn)口百合和我國浙江麗水栽培百合樣品中檢測(cè)到PNRSV 的發(fā)生，侵染率為20.8%，這是PNRSV侵染百合的首次報(bào)道，證明百合是PNRSV 的一個(gè)新寄主。綜上所述，即便是相同地區(qū)百合病毒的檢測(cè)結(jié)果也有差異，可能是由于采樣的病毒樣品類型、樣品數(shù)量或者檢測(cè)時(shí)取樣部位等不同造成的，也可能是檢測(cè)方法的靈敏度或者病毒株系變異引起的。

由本研究檢測(cè)結(jié)果還可以看出，百合病毒在田間存在嚴(yán)重的復(fù)合侵染現(xiàn)象，單個(gè)樣品中能同時(shí)檢出3～6 種病毒，且以LMoV、PlAMV、DMV、RYVV和FMV 5 種病毒復(fù)合侵染率最高，48份樣品中有30份為上述5 種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率高達(dá)62.50%。被譽(yù)為“春城”的云南省昆明市，由于其獨(dú)特的氣候環(huán)境，四季如春，一年四季可不間斷種植各種蔬菜和花卉，特別有利于病毒侵染及傳播。因此，云南地區(qū)的百合病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象最復(fù)雜，單個(gè)樣品被5～6種病毒復(fù)合侵染，其中6種病毒復(fù)合侵染率為14.58%。多種病毒復(fù)合侵染百合，還有些病毒侵染后并不表現(xiàn)癥狀，很難單從癥狀上進(jìn)行正確診斷。病毒復(fù)合侵染已成為百合脫毒生產(chǎn)中的重大障礙，而且脫毒苗的檢測(cè)大多僅針對(duì)已知病毒，對(duì)未知的新病毒則無法檢測(cè)。我們對(duì)百合樣品進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)2種未知病毒，新病毒的全長序列和分類地位有待進(jìn)一步確認(rèn)。因此，在全國范圍內(nèi)廣泛采樣，研究侵染百合的病毒種類及特性，尤其是對(duì)新病毒的鑒定和檢測(cè)，將對(duì)百合脫毒生產(chǎn)及病毒病防控有重大意義。

致謝：感謝江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所的黃冬華研究員、羅云博士和李艷婷博士在百合病毒樣品采集中提供的幫助。