胡欣瑞，賀衛(wèi)軍，呂金，王業(yè)民，陶美鳳

上海交通大學(xué)微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200030

放線菌來源的天然產(chǎn)物具有多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和豐富的生物活性，在醫(yī)療和農(nóng)業(yè)方面具有重要應(yīng)用價(jià)值［1-2］。其中許多重要抗生素由稀有放線菌產(chǎn)生，如萬古霉素、替考拉寧、紅霉素和利福霉素［3］。近些年，由于常在鏈霉菌中重復(fù)篩選出已知天然產(chǎn)物，新型活性化合物的獲得效率大大降低，稀有放線菌作為挖掘新型抗生素的潛在資源，愈發(fā)受到關(guān)注［3-5］。通過基因組學(xué)和生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)放線菌基因組中通常含有20～40 個(gè)生物合成基因簇（biosynthesis gene clusters，BGC）。然而在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，僅少數(shù)BGC 產(chǎn)生對應(yīng)的天然產(chǎn)物，超過90%的BGC處于沉默狀態(tài)，這些BGC被稱為隱性基因簇［6-7］。由于大多數(shù)稀有放線菌生長緩慢、遺傳操作困難，將目標(biāo)化合物的基因簇轉(zhuǎn)到異源宿主中表達(dá)成為發(fā)現(xiàn)隱性天然產(chǎn)物的有效途徑［8］。這種方法主要取決于2個(gè)因素：一是將完整的BGC 克隆到合適的表達(dá)載體中的能力；二是異源宿主表達(dá)外源BGC的兼容性。

目前，鏈霉菌因其相對完備的遺傳操作系統(tǒng)和強(qiáng)大的次級代謝能力被開發(fā)成最廣泛使用的宿主，如天藍(lán)色鏈霉菌M145、變鉛青鏈霉菌TK24、白色鏈霉菌 J1074 和阿維鏈霉菌 SUKA2 等［8-10］。這些模式異源宿主具備一些共同的特征，如：生長速率快，遺傳操作簡單，遺傳背景清晰，對次級代謝產(chǎn)物的分析背景低；能識別并轉(zhuǎn)錄外源DNA，即能識別異源生物合成基因簇的所有表達(dá)調(diào)控元件，以確保所需蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)；能提供豐富的前體和輔因子，滿足不同類型化合物生物合成的需求；其內(nèi)源天然產(chǎn)物的表達(dá)與調(diào)控已有一定程度的了解，便于對異源途徑進(jìn)行理性設(shè)計(jì)；能表達(dá)必要的轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，如磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，使天然產(chǎn)物生物合成相關(guān)蛋白活化［11］。

在實(shí)際應(yīng)用中，針對特定的目標(biāo)化合物，常遇到在異源宿主中不表達(dá)或產(chǎn)量很低的情況，一般還需要進(jìn)行密碼子優(yōu)化、增加前體供應(yīng)、使用強(qiáng)啟動子、過表達(dá)正調(diào)控蛋白和敲除負(fù)調(diào)控蛋白等一系列操作對宿主菌株進(jìn)行工程化改造，實(shí)驗(yàn)周期較長［12-13］?？紤]到化合物來源、宿主的轉(zhuǎn)錄機(jī)制和代謝能力，需要開發(fā)親緣關(guān)系更近或兼容性更高的底盤菌株。2018年，Zhang 等［14］首次開發(fā)出海洋放線菌Salinispora tropicaCNB-440 作為異源宿主，用于表達(dá)來自Salinispora pacifica的硫乳霉素生物合成基因簇，與在超級宿主天藍(lán)色鏈霉菌M1152 中生產(chǎn)相比產(chǎn)量提高 3 倍。2019年，Wang 等［15］開發(fā)了 CRAGE 工具用于快速激活未馴化的細(xì)菌來源的生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)當(dāng)基因簇在與天然生產(chǎn)者親緣關(guān)系近的菌株中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物多樣性和產(chǎn)量比遠(yuǎn)緣菌株更大。這些研究均暗示著開發(fā)系統(tǒng)發(fā)育多樣的底盤菌株可能會顯著提高基因簇異源表達(dá)的成功率或產(chǎn)量。2020年，Lü 等［16］敲除紅色糖多孢菌 HOE107 的內(nèi)源基因簇，使其成功異源表達(dá)來自刺糖多孢菌的多殺菌素和來自天藍(lán)色鏈霉菌的放線紫紅素。稀有放線菌來源的異源表達(dá)宿主對于活性天然產(chǎn)物的基因組挖掘具有重要意義，但目前相關(guān)報(bào)道非常有限。

稀有放線菌擬無枝酸菌（Amycolatopsissp.）TNS106 是一株糖肽抗生素瑞斯托霉素（ristomycin）的產(chǎn)生菌，前期研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵2～3 d即可達(dá)到產(chǎn)素高峰，發(fā)酵周期較短［17］。本研究旨在開發(fā)TNS106作為底盤宿主，用于表達(dá)異源生物合成基因簇，以補(bǔ)充目前以鏈霉菌為主的宿主庫。為了構(gòu)建具有干凈的次級代謝背景的可整合宿主，用噬菌體ΦC31 和ΦBT1 細(xì)菌附著位點(diǎn)attB替換瑞斯托霉素生物合成的非核糖體肽合成酶基因rpsA，并在突變株中異源表達(dá)來自鏈霉菌的放線紫紅素和來自糖多孢菌屬的多殺菌素，旨在探究該菌株表達(dá)不同來源基因簇的適配性。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

大 腸 桿 菌 DH10B、ET12567、ET12567/pUB307、擬無枝酸菌TNS106、白色鏈霉菌J1074、變鉛青鏈霉菌TK24、天藍(lán)色鏈霉菌M145、紅色糖多孢菌LJ161/pJTU2554 和LJ161/pMM1 菌株均由上海交通大學(xué)微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。本研究所用質(zhì)粒見表1，所用引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表2）。

表1 本研究所使用的質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究所使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 培養(yǎng)基

研究中用到的培養(yǎng)基有LB 和LA（大腸桿菌培養(yǎng)基）、MS（放線菌固體培養(yǎng)基）、TSBY 液體培養(yǎng)基、SAM 液體培養(yǎng)基［22］、R5-固體培養(yǎng)基［23］、GMC 液體培養(yǎng)基、CTF4 液體培養(yǎng)基。TSBY、SAM、R5-和CTF4 培養(yǎng)基于115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，其余培養(yǎng)基于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 擬無枝酸菌TNS106生長曲線的測定

將擬無枝酸菌TNS106 單菌落接種至含有50 mL TSBY 培養(yǎng)基的三凹搖菌瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h；將5 mL種子液接種至含有50 mL SAM 培養(yǎng)基的三凹搖菌瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)7 d；期間每隔24 h 取1 mL 發(fā)酵液置于預(yù)先稱質(zhì)量的1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，小心棄去上清，將收集的菌體置于烘箱干燥至恒定質(zhì)量，再次稱質(zhì)量后計(jì)算與空離心管的差值，即為生物量；記錄1～7 d生物量變化，繪制生長曲線。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建

1）pXH8 的構(gòu)建。設(shè)計(jì)引物使得同源重組臂片段之間以及擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化載體之間各有36 bp的末端重疊序列，并分別凝膠回收同源重組臂片段和線性化載體。DNA 無縫克隆采用諾唯贊公司的ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit，配制10 μL反應(yīng)體系：線性化載體，200 ng；上游同源重組臂片段，40 ng；下游同源重組臂片段，40 ng；2×ClonExpress Mix，5 μL；補(bǔ)加ddH2O 至 20 μL。將體系置于 50 ℃水浴30 min，脫鹽后電轉(zhuǎn)化，對單克隆進(jìn)行驗(yàn)證。

2）pJWJ3H2 的構(gòu)建。以pHLJ811為模板擴(kuò)增鼠李糖和福樂糖胺合成基因，以pYH7為模板擴(kuò)增氨芐青霉素抗性基因，然后利用重疊延伸PCR 獲得blagtt-epi-gdh-kre基因盒。通過 PCR-targeting 技術(shù)［24］將基因盒敲入pSPI3H2，獲得pJWJ3H2。

1.5 三親本接合轉(zhuǎn)移

將含有待轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的供體菌株ET12567 和含有三親本接合轉(zhuǎn)移輔助質(zhì)粒的菌株ET12567/pUB307分別接種至含有相應(yīng)抗生素的5 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)至 OD600約為 0.6；取 5 mL 培養(yǎng)24 h 的新鮮TNS106 菌絲體和上述大腸桿菌混合，4 ℃4 000 r/min離心3 min，收集菌體；用無菌水洗滌2 次，每次 4 ℃ 4 000 r/min 離心 3 min；將洗好的菌體用1 mL 無菌水重懸并充分混勻，均勻涂布在2 塊含有20 mmol/L MgCl2的MS平板，每塊平板500 μL菌液，并于超凈臺干燥45～60 min，30 ℃倒置培養(yǎng)8～10 h；將抗生素溶液稀釋到工作濃度（按平板中培養(yǎng)基的體積計(jì)算）后均勻覆蓋在培養(yǎng)基表面，在超凈臺上干燥后于30 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)3～5 d，觀察長出的接合轉(zhuǎn)移子。

1.6 瑞斯托霉素的發(fā)酵與檢測

將TNS106 野生型和基因置換菌株HXR1 在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，挑取單菌落分別接種至含有50 mL TSBY培養(yǎng)基的250 mL三凹搖菌瓶中，30 ℃、220 r/min 培養(yǎng)48 h；將5 mL 種子液接種至含有50 mL SAM 培養(yǎng)基的三凹搖菌瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng) 2 d；取 1 mL 發(fā)酵液 12 000 r/min 離心 5 min，將上清用0.22 μm 濾膜過濾，對濾液進(jìn)行HPLC 分析。流動相為水（A相）和甲醇（B相），兩相均含0.05%甲酸。色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為 0.6 mL/min，檢測波長為 220 nm，洗脫條件：0～23 min，5%～25% B 相；23～30 min，25%～100% B 相 ；30～35 min，100% B 相 ；35.1～45 min，5%B相。

1.7 放線紫紅素的發(fā)酵與檢測

將含pMM1 的擬無枝酸菌和含載體對照的菌株在MS 培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落分別接種至R5-平板固體發(fā)酵，30 ℃培養(yǎng)8 d；期間每隔24 h 用 1 mL 藍(lán)槍頭末端取同等大小菌塊置于1.5 mL 離心管中，加入 1 mL 1 mol/L KOH 溶液，浸提 1 h；12 000 r/min離心5 min，取上清測量OD640，并扣除未接種培養(yǎng)基浸提液的光密度。

1.8 多殺菌素的發(fā)酵與檢測

將含pJWJ3H2 的擬無枝酸菌和對照菌株在MS 培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落分別接種至含有50 mL TSBY 培養(yǎng)基的 250 mL 三凹搖菌瓶中，30 ℃，220 r/min 培養(yǎng)48 h；將5 mL 種子液接種至含有50 mL CTF4 培養(yǎng)基的三凹搖菌瓶中，30 ℃，220 r/min避光發(fā)酵10 d；取1 mL發(fā)酵液加入等體積甲醇，超聲處理30 min，避光靜置12 h；12 000 r/min 離心5 min，將上清用0.22 μm 濾膜過濾，對濾液進(jìn)行HPLC 分析。流動相為體積比為47.5∶47.5∶5.0 的甲醇/乙腈/0.05%乙酸鈉溶液（A 相）和乙腈（B 相）。色譜柱為 ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為1 mL/min，檢測波長為250 nm，洗脫條件：0～15 min，0% B 相；15.1～20 min，100% B 相；20.1～30 min，0%B相。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬無枝酸菌TNS106生長特性的評估

首先確定其生長曲線（圖1A），TNS106 在SAM培養(yǎng)基中，1～3 d生長較快，生物量積累迅速，為對數(shù)生長期；3～5 d 達(dá)到穩(wěn)定期，之后進(jìn)入衰亡期。在TSBY、R5-、SAM 和 GMC 4 種液體培養(yǎng)基中觀察，擬無枝酸菌TNS106 都呈現(xiàn)出菌絲體均勻分散的特征，而其他3種常見的鏈霉菌宿主白色鏈霉菌J1074、變鉛青鏈霉菌TK24和天藍(lán)色鏈霉菌M145均出現(xiàn)非常明顯的顆粒和團(tuán)塊，且更易沉降（圖1B）。菌絲體均勻分散的特征有利于菌體對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的利用，對于大規(guī)模發(fā)酵過程具有重要的應(yīng)用價(jià)值。其次，TNS106 在MS 平板上培養(yǎng)1 d 即可觀察到非常明顯的白色氣生菌絲體，培養(yǎng)至后期菌絲體更加濃密，而其他3 種鏈霉菌宿主生長相對緩慢，菌絲體也較為稀疏和粗糙（圖1C）。此外，由于擬無枝酸菌TNS106 產(chǎn)孢少，采用菌絲體代替孢子進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，省去傳統(tǒng)方法中收集孢子、孢子熱激和預(yù)培養(yǎng)的步驟，遺傳操作更加簡化。綜上，TNS106 生長特性優(yōu)良、遺傳操作便捷，具有開發(fā)成底盤宿主的優(yōu)勢。

圖1 擬無枝酸菌TNS106的生長特性Fig.1 Growth characteristics of Amycolatopsis sp.TNS106

2.2 rpsA基因置換質(zhì)粒pXH8的構(gòu)建

為了對擬無枝酸菌TNS106 中瑞斯托霉素生物合成基因簇內(nèi)非核糖體肽合成酶基因rpsA進(jìn)行基因置換以清除背景代謝物瑞斯托霉素，構(gòu)建了rpsA基因置換質(zhì)粒。以擬無枝酸菌TNS106的基因組DNA為反應(yīng)模板，利用引物rpsA-Up_F/R 和rpsADown_F/R 分別擴(kuò)增獲得rpsA上下游各2 kb 的同源重組臂片段。用于擴(kuò)增同源臂的引物中還添加了attBΦC31和attBΦBT1的序列。同時(shí)，將質(zhì)粒pYH7 用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅤ酶切制備線性化載體。用一步克隆試劑盒將同源重組臂片段與線性化載體進(jìn)行重組。最后，將完成重組反應(yīng)后的體系脫鹽，電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B 中，在含有阿泊拉霉素的抗性平板上培養(yǎng)獲得單克隆。用引物pXH8_F/R 對單克隆進(jìn)行PCR 驗(yàn)證（圖2B），并測序得到正確的rpsA基因置換質(zhì)粒pXH8，其中2 個(gè)同源臂之間含有attBΦC31和attBΦBT1，因此，在敲除rpsA基因的同時(shí)將引入細(xì)菌附著位點(diǎn)，利于后續(xù)BAC 質(zhì)粒和其他功能質(zhì)粒的高效整合。

2.3 rpsA 基因置換菌株HXR1 的構(gòu)建及其發(fā)酵產(chǎn)物分析

通過三親本接合轉(zhuǎn)移將rpsA基因置換質(zhì)粒pXH8 轉(zhuǎn)入TNS106 中，挑取接合子至含有阿泊拉霉素的MS抗性平板，篩選獲得同源單交換菌株。將單交換菌株接種至不含抗生素的TSBY 液體培養(yǎng)基中松弛培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)接到TSBY 再松弛培養(yǎng)2 d。然后，取適量菌液劃線至不含抗生素的MS平板上，培養(yǎng)獲得單菌落。將單菌落一一對應(yīng)地分別接種至含有或不含阿泊拉霉素的MS平板上培養(yǎng)，篩選獲得阿泊拉霉素敏感菌株，即為雙交換菌株（圖2A）。最后，提取雙交換菌株基因組DNA 作為模板，以TNS106 基因組 DNA 為對照，rpsA_F/R 為引物進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。理論上，TNS106 野生型的擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)為6 772 bp，缺失rpsA基因并引入2 個(gè)attB位點(diǎn)后的擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)為660 bp。PCR 驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)期完全一致（圖2C），表明成功獲得rpsA基因置換菌株，命名為HXR1。隨后，將HXR1 和野生型菌株分別接種至SAM 液體培養(yǎng)基中發(fā)酵2 d，并對發(fā)酵液進(jìn)行HPLC分析。如圖3 所示，HXR1 的發(fā)酵液中不再積累瑞斯托霉素，具有更加干凈的代謝產(chǎn)物分析背景。

圖2 rpsA基因置換突變株HXR1的構(gòu)建Fig.2 Construction of the rpsA gene replacement mutant HXR1

圖3 基因置換菌株HXR1和野生型發(fā)酵液的HPLC分析Fig.3 HPLC profile analysis of ristomycin A in WT and HXR1

2.4 以HXR1為宿主異源表達(dá)放線紫紅素

放線紫紅素（actinorhodin）是天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)生的聚酮類色素抗生素（圖4A），在堿性環(huán)境中呈現(xiàn)藍(lán)色，由Ⅱ型聚酮合酶利用乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A催化合成。為評估HXR1 表達(dá)異源基因簇的能力，將包含完整放線紫紅素生物合成基因簇的質(zhì)粒pMM1 通過位點(diǎn)特異性重組整合至其染色體上，抗性篩選獲得突變株HXR1/pMM1。在R5-培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 時(shí)，HXR1/pMM1 可以明顯觀察到藍(lán)色色素的產(chǎn)生（圖4B）。為了與之前報(bào)道的稀有放線菌宿主紅色糖多孢菌LJ161 定量比較放線紫紅素的產(chǎn)生情況，將HXR1/pMM1 和LJ161/pMM1 發(fā)酵產(chǎn)物分別用1 mol/L KOH 溶液浸提（圖4C），并測定在640 nm處的光密度。結(jié)果顯示，HXR1/pMM1在發(fā)酵第2天開始產(chǎn)生放線紫紅素，第3～6 天迅速積累，在第4 天可以達(dá)到LJ161/pMM1發(fā)酵的最大產(chǎn)量。與LJ161/pMM1 相比，HXR1/pMM1 中放線紫紅素提前 1 d 產(chǎn)生，產(chǎn)量提高了1.3倍（圖4D）。

圖4 以HXR1為宿主異源表達(dá)放線紫紅素Fig.4 Heterologous expression of actinorhodin by HXR1 carrying the S.coelicolor actinorhodin BGC on pMM1

2.5 以HXR1為宿主異源表達(dá)多殺菌素

通過異源表達(dá)多殺菌素來驗(yàn)證HXR1 與稀有放線菌來源的基因簇的適配性。多殺菌素（spinosad）是多殺菌素A 和多殺菌素D 的混合物（圖5A），常作為一種高效綠色殺蟲劑，由Ⅰ型聚酮合酶負(fù)責(zé)合成。多殺菌素原始產(chǎn)生菌為刺糖多孢菌，與擬無枝酸菌同為擬諾卡氏菌科，但不同屬。BAC 質(zhì)粒pJWJ3H2含有完整多殺菌素生物合成基因簇和多殺菌素生產(chǎn)所必需的4 個(gè)鼠李糖生物合成基因。通過三親本接合轉(zhuǎn)移將pJWJ3H2 轉(zhuǎn)入HXR1 中獲得HXR1/pJWJ3H2。接著，將HXR1/pJWJ3H2 和整合了空載體的對照菌株HXR1/pHL921 分別接種至CTF4 液體培養(yǎng)基中發(fā)酵10 d，并對發(fā)酵液進(jìn)行HPLC 分析。如圖 5B 所示，與對照相比，HXR1/pJWJ3H2 在 8.592 min 和9.819 min 出現(xiàn)的2 個(gè)差異峰與多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，推測其分別為多殺菌素A 和多殺菌素D。高分辨質(zhì)譜分析（UHPLC/Q-TOFMS）結(jié)果表明，樣品中2 個(gè)目標(biāo)化合物的相對分子質(zhì)量分別與多殺菌素A 和多殺菌素D 的相對分子質(zhì)量一致（圖5C）。綜上，HXR1/pJWJ3H2 成功異源表達(dá)多殺菌素生物合成基因簇，產(chǎn)生多殺菌素A和多殺菌素D。

圖5 以HXR1為宿主異源表達(dá)多殺菌素Fig.5 Heterologous expression of spinosad by HXR1

3 討 論

異源表達(dá)已經(jīng)成為“隱性”基因簇對應(yīng)代謝產(chǎn)物的發(fā)掘和天然產(chǎn)物生物合成規(guī)律研究的常規(guī)方法。稀有放線菌蘊(yùn)含豐富的“隱性”基因簇，采用親緣關(guān)系更近的非鏈霉菌來源的宿主對于激活這些基因簇更為有利。然而，目前廣泛使用的放線菌底盤主要是鏈霉菌，稀有放線菌由于生長緩慢和遺傳改造困難，鮮有被開發(fā)成異源表達(dá)宿主的報(bào)道。

本研究基于快速生長、特性優(yōu)良的稀有放線菌擬無枝酸菌TNS106，通過同源重組的方法，將其主產(chǎn)物瑞斯托霉素生物合成的必需基因rpsA替換為attB位點(diǎn)，獲得一個(gè)代謝背景干凈的底盤菌株HXR1。HXR1 能成功表達(dá)鏈霉菌來源的放線紫紅素和稀有放線菌來源的多殺菌素，表明該宿主對不同來源的BGC具有一定普適性。而且與紅色糖多孢菌相比，擬無枝酸菌HXR1 的放線紫紅素產(chǎn)生更早、產(chǎn)量更高，具有一定優(yōu)勢。異源表達(dá)宿主菌株HXR1對于未來鏈霉菌和稀有放線菌中天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和工程化應(yīng)用具有重要意義。