肖青，李永杰，汪健康 ，查興平，黃建明 ，何張江，康冀川

1.貴州大學(xué)西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025

早在4.6 億年前的植物化石中就發(fā)現(xiàn)真菌孢子的存在，表明植物從開始出現(xiàn)就伴隨著內(nèi)生菌［1］。在長期的互作過程中，二者相互依存形成了穩(wěn)定的共生關(guān)系。內(nèi)生菌對植物的影響是全方位的，內(nèi)生菌可以形成菌絲體網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)植物對土壤中氮、磷等微量元素的吸收［2-3］；通過占據(jù)特殊的生態(tài)位，與病原菌競爭營養(yǎng)和生存空間［4］，顯著提高植物對病蟲害的抗性。此外，內(nèi)生菌還可激活植物體內(nèi)的防御機(jī)制從而達(dá)到增強(qiáng)植物抗性的目的［5］。近年來，國家出臺(tái)的化肥和農(nóng)藥零增長的國策，促使人們尋找更環(huán)保更有效的策略以應(yīng)對需求的缺口，內(nèi)生菌因其對植物具有促生及抗病蟲害的作用而成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上減少化肥和農(nóng)藥使用的理想選擇。

大多數(shù)鐮刀菌屬真菌為植物病原菌，其寄主廣泛，能感染多種作物，并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［6］。但近年來，有研究報(bào)道內(nèi)生鐮刀菌對部分植物不但不會(huì)致病，還具有促生抗病的作用；然而，決定鐮刀菌是否致病或促生抗病的關(guān)鍵在于其所處的生態(tài)位，不同的生態(tài)位下鐮刀菌可對宿主可表現(xiàn)出有害、中立和有益等不同的作用［7］。例如，病原尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的香蕉枯萎病造成了巴拿馬卡迪文許香蕉品種的滅絕［8］。中立的鐮刀菌，能夠存在于植物周圍而不引起植物病害，但一旦條件成熟則轉(zhuǎn)化為病原菌引起宿主感病，枯萎病、根腐?。?］都屬于該類型。而有益的鐮刀菌大多來源于植物內(nèi)生生態(tài)位，如內(nèi)生輪枝鐮刀菌可通過分泌赤霉素改善植物抗鹽脅迫的能力［10］，從辣椒根部分離的內(nèi)生尖孢鐮刀菌EF119 對番茄晚疫病具有良好的防治效果［11］。上述研究表明，鐮刀菌對植物的致病性是寄主特異性的，對一些種類的植物具有致病作用的鐮刀菌，在另外一些植物種類中具有促生抗病作用［12］。

鐮刀菌屬真菌由于所處生態(tài)位的關(guān)系，發(fā)揮著不同作用，特別是內(nèi)生生態(tài)的鐮刀菌對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有潛在的利用價(jià)值。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)馬比木內(nèi)生真菌磚紅鐮刀菌（Fusarium lateritium）對馬鈴薯具有促生抗病的作用［13］。為拓展該菌株的應(yīng)用范圍，本研究以同為茄科作物的番茄作為研究對象，探究磚紅鐮刀菌在番茄生長及抗病過程中的作用，旨在為該磚紅鐮刀菌的后期開發(fā)及實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株與植物：磚紅鐮刀菌野生菌株（F.lateritium）由貴州大學(xué)生化工程中心分離、保存。Micro Tom 番茄（抗病品種）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)許向陽教授饋贈(zèng)；尖孢鐮刀菌番茄?；途闒ol4287 由揚(yáng)州大學(xué)歐陽壽強(qiáng)教授饋贈(zèng)；花繡球（普通易感番茄品種）、次氯酸鈉溶液、番茄水培營養(yǎng)液及營養(yǎng)土均購自貴州銳宏生物有限公司。

質(zhì)粒：含潮霉素 B（hyg）抗性、GFP 片段的質(zhì)粒pK2hyg由西南大學(xué)生物技術(shù)中心張永軍研究員饋贈(zèng)，貴州大學(xué)西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心保存。表達(dá)GFP熒光標(biāo)記的磚紅鐮刀菌由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

1.2 番茄種植及磚紅鐮刀菌的培養(yǎng)

番茄種子消毒方法參考文獻(xiàn)［16］，略有改動(dòng)。將Micro Tom和花繡球種子50 ℃溫水浴浸泡25 min后，用0.75%次氯酸鈉消毒15 min。蒸餾水漂洗6～8 次，漂洗后將種子浸泡于蒸餾水中置于28 ℃催芽3～5 d。待其發(fā)芽后采用3種方法培養(yǎng)：（1）用無菌鑷子將Micro Tom 番茄轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基上無菌生長；（2）將花繡球番茄根部浸沒在水培營養(yǎng)液（按水培營養(yǎng)液配方說明書配制）中進(jìn)行水培培養(yǎng)；（3）Micro Tom番茄直接種植于土壤中，用于后續(xù)研究。

將磚紅鐮刀菌接種至PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 d后挑取菌塊至1/4 SDB 液體培養(yǎng)基中于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4～6 d。

1.3 磚紅鐮刀菌對番茄生長的影響檢測

將磚紅鐮刀菌接種在鋪有無菌玻璃紙的CZM培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d 后，刮取菌絲并用0.05% Tween 80 重懸，制備含菌絲體與孢子的混懸液。并調(diào)整其分生孢子濃度為1×105CFU/mL，通過浸根法處理Micro Tom 番茄（下文除特別說明是“花繡球番茄”外，“番茄”都指“Micro Tom 番茄”）。取生長 14 d 后的番茄植株進(jìn)行研究，對照組和處理組各25株番茄。每次接種5 mL 菌絲體懸液于番茄根部，對照組接種5 mL 含 0.05% Tween 80 的蒸餾水，每 4 d 浸根處理1次，共浸根處理10次，處理50 d時(shí)統(tǒng)計(jì)番茄株高、根系生物量。

1.4 番茄葉綠素提取方法

葉綠素提取及葉綠素含量計(jì)算參考王鳳婷等［17］方法，略有改動(dòng)。浸根法處理番茄50 d 后，取番茄葉位一致的葉片，洗凈，擦干葉片表面水分，剪成2 mm細(xì)條，混勻后稱取細(xì)條0.4 g 放入研缽中，吸取5 mL 95% 乙醇研磨提取，充分研磨后將番茄葉片研磨液過濾，轉(zhuǎn)移至50 mL 棕色容量瓶中，并用95% 乙醇洗滌研缽和研磨棒上殘余液體，最后用95% 乙醇定容至50 mL。過濾后的研磨液搖勻后分別于波長665、649 nm 處測定吸光度，重復(fù)3 次，并據(jù)此計(jì)算葉綠素含量。

1.5 磚紅鐮刀菌對番茄枯萎病抗性的影響檢測

尖孢鐮刀菌番茄?；途闒ol4287 于PDA 培養(yǎng)基上27 ℃生長10 d 后，刮取培養(yǎng)基上孢子并用0.05% Tween 80 懸浮，調(diào)整其濃度為1×107CFU/mL。選取水培培養(yǎng)1個(gè)月的花繡球番茄，處理組及對照組各15 株；對照組采用0.05%Tween 80 浸泡處理番茄根系，處理組采用1×107CFU/mL 磚紅鐮刀菌孢子懸液浸泡，32 h 后，采用1×107CFU/mL尖孢鐮刀菌孢子懸液浸泡對照組及處理組番茄（花繡球）根系，處理35 min 后將花繡球番茄移入土壤中生長，14 d后觀察植物生長及發(fā)病情況。

1.6 磚紅鐮刀菌介導(dǎo)番茄植物激素關(guān)鍵基因表達(dá)水平的檢測

將經(jīng)1×107CFU/mL 磚紅鐮刀菌孢子懸液浸根處理20 、30 、40 d 的番茄根系用水沖洗干凈后液氮速凍，并提取番茄RNA。將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，選用在番茄根和葉中表達(dá)均較為穩(wěn)定的甘油醛3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）作為番茄內(nèi)參基因［14-15］。采用RT-qPCR 法檢測番茄中生長素合成關(guān)鍵基因SlYUC5、水楊酸合成關(guān)鍵基因SlICS1、茉莉酸合成關(guān)鍵基因SlLOXD及與植物抗性有關(guān)的一個(gè)病程相關(guān)蛋白基因SlPR1a［18］的表達(dá)水平。每個(gè)PCR 反應(yīng)各進(jìn)行3 次重復(fù)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 90 s；95 ℃變性 5 s，56 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。研究中用到的相關(guān)引物見表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real time fluorescence quantitative reverse PCR

1.7 磚紅鐮刀菌在番茄中定殖的觀察

將用MS 培養(yǎng)基上無菌培養(yǎng)的番茄根部浸泡在表達(dá)GFP 熒光標(biāo)記的磚紅鐮刀菌1×107CFU/mL孢子懸液中，22 ℃靜置14 h 后取出番茄植株。用蒸餾水沖洗干凈番茄根部，加入終質(zhì)量濃度為200 μg/mL 的碘化丙啶（propidium iodide，PI）。置 于37 ℃培養(yǎng)箱黑暗條件染色25～30 min，染色完成后，將植物根系用1×PBS 緩沖液洗滌4～6 次，每次沖洗時(shí)間不少于2 min。將染色處理后的根樣固定在含10%甘油的載玻片上，并于激光共聚焦倒置顯微鏡成像系統(tǒng)（LSM900，ZEISS）的載物臺(tái)上進(jìn)行觀察并拍照。

1.8 磚紅鐮刀菌定殖率的測定

按表2進(jìn)行引物篩選，最終選定磚紅鐮刀菌特有基因FlEf1α進(jìn)行研究。首先按本文“1.2”方法搖床培養(yǎng)磚紅鐮刀菌6 d 后收集磚紅鐮刀菌孢子，懸浮于無菌水中并調(diào)整其濃度分別為 108、107、106、105和104CFU/mL，按He 等［19］方法進(jìn)行絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。選取土壤中生長30 d 的番茄，用0.05%Tween 80 將磚紅鐮刀菌孢子濃度調(diào)整為1×107CFU/mL 后將番茄根部浸泡在孢子懸液中，收集0、6、12、24、48 h的番茄根系用水沖洗干凈后液氮速凍，并提取番茄DNA。使用倍沃公司真菌gDNA提取試劑盒提取磚紅鐮刀菌DNA，提取方法嚴(yán)格按照說明書上進(jìn)行。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線測定磚紅鐮刀菌定殖率。

表2 磚紅鐮刀菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物篩選Table 2 Screening of real-time fluorescent quantitative PCR primers for F.lateritium

2 結(jié)果與分析

2.1 磚紅鐮刀菌對番茄生長的影響

浸根法處理番茄50 d 后測定植株的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示：相較于對照組，經(jīng)磚紅鐮刀菌處理后，番茄株高顯著增加，處理組平均株高較對照組增加了1.15 倍（P＜0.01）（圖1A、B）；處理組葉綠素 a 及葉綠素b 的含量均較對照顯著增加（1.16 倍和1.47 倍，P＜0.01）（圖1C、D）；磚紅鐮刀菌處理促進(jìn)番茄植株根部發(fā)育（圖1 E），且其根系生物量顯著大于未處理的對照組（1.38 倍，P＜0.01）（圖1 F）；表明磚紅鐮刀菌促進(jìn)了番茄植株的生長。

圖1 磚紅鐮刀菌對番茄株高（A、B）、葉片（C、D）和根系（E、F）的影響Fig.1 Effects of F.lateritium on tomato plant height（A，B），leaf（C，D）and roots（E，F(xiàn)）

2.2 磚紅鐮刀菌對番茄枯萎病抗性的影響

生測結(jié)果顯示，處理組病情指數(shù)為45.16%，而對照組為74.15%（圖2A、B），處理組較對照組病情指數(shù)下降。表明磚紅鐮刀菌增強(qiáng)了番茄植株對番茄枯萎?。ú≡鸀榧怄哏牭毒┑目剐?。

圖2 磚紅鐮刀菌對番茄枯萎病的影響Fig.2 Effects of F.lateritium on resistance to tomato fusarium wilt

2.3 磚紅鐮刀菌對番茄中植物激素關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

為探究磚紅鐮刀菌是否能通過影響植物中激素表達(dá)而促進(jìn)番茄生長及增強(qiáng)其對其他病原菌的抗性，通過RT-qPCR 檢測了對照組及磚紅鐮刀菌浸根處理后（20、30、40 d）的番茄植株中植物激素相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，生長素合成關(guān)鍵基因SlYUC5在浸根處理20 d 后與未處理對照組相比無顯著差異，而在處理 30 及 40 d 后，SlYUC5較對照組相比表達(dá)顯著上升（3.4 倍和1.6 倍，P＜0.01）（圖3A）；水楊酸合成關(guān)鍵基因SlICS1在浸根處理20 d后與未處理對照組相比無顯著差異，但處理30 及40 d 后，其表達(dá)水平較對照組相比顯著降低（45.36%和36.13%，P＜0.05，P＜0.01），而對照組SlICS1整體呈上升趨勢，表明磚紅鐮刀菌下調(diào)了SlICS1的表達(dá)（圖3B）；茉莉酸合成途徑關(guān)鍵基因SlLOXD在20 d 時(shí)較對照組顯著下調(diào)了38.73%（P＜0.01），而在30 d 時(shí)其表達(dá)量較對照組無顯著差異，40 d 后，其表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)（2.33 倍，P＜0.01）（圖3C）。而試驗(yàn)組中植物抗性相關(guān)蛋白 SlPR1a 在 20、30 和 40 d 的表達(dá)量被顯著上調(diào)了7.89 倍、5.77 倍和1.8 倍（P＜0.01），表明植物防御可能存在高激活狀態(tài)（圖3D）。綜上，我們推測內(nèi)生磚紅鐮刀菌通過影響番茄中與植物生長和抗病相關(guān)的植物激素基因的表達(dá)，從而促進(jìn)番茄生長并增強(qiáng)其抗性。

圖3 磚紅鐮刀菌激活番茄中植物激素相關(guān)基因表達(dá)Fig.3 The expression of plant hormone-related genes is mediated by F.lateritium

2.4 磚紅鐮刀菌在番茄中定殖的觀察結(jié)果

為檢測磚紅鐮刀菌在番茄根系中的定殖狀況，使用激光共聚焦倒置顯微鏡觀察磚紅鐮刀菌定殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理14 h 后在番茄根系能夠觀察到GFP 標(biāo)記的磚紅鐮刀菌菌絲，并且在根細(xì)胞內(nèi)觀察到磚紅鐮刀菌菌絲生長（圖4）。表明磚紅鐮刀菌能夠內(nèi)生定殖于番茄根系。

圖4 表達(dá)GFP的磚紅鐮刀菌在番茄根系的顯微觀察Fig.4 Microscopic image of tomato roots stained with PI

2.5 磚紅鐮刀菌在番茄中的定殖率

為量化磚紅鐮刀菌在番茄根部的定殖程度，通過qPCR 檢測其定殖率。以FlEF1α-F/R 為引物，繪制磚紅鐮刀菌絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明磚紅鐮刀菌孢子數(shù)與Cq值相關(guān)（圖5A），以此標(biāo)準(zhǔn)曲線為參考，結(jié)合qPCR 結(jié)果表明磚紅鐮刀菌能夠在番茄植株中定殖，且在6～48 h 其定殖率隨著定殖時(shí)間的延長而顯著增加（圖5B）。

圖5 熒光定量PCR法檢測磚紅鐮刀菌在番茄中的定殖率Fig.5 Colonization rate of F.lateritium in tomato detected by fluorescence quantitative PCR

3 討 論

前人在研究植物病原菌與植物互作時(shí)發(fā)現(xiàn)植物的生長往往與其抗病性負(fù)相關(guān)［20］，其原因在于促進(jìn)植株生長的生長素與增強(qiáng)植株系統(tǒng)抗性的激素水楊酸存在拮抗關(guān)系。然而，有研究表明內(nèi)生菌定殖能在促進(jìn)植物生長的同時(shí)提高植物抗病性［21］，由此可以推測，病原菌和內(nèi)生菌對植物的作用機(jī)制有著本質(zhì)的區(qū)別。與病原菌一樣，內(nèi)生真菌功能的發(fā)揮同樣依賴于成功定殖植物，這會(huì)觸發(fā)植物的免疫防御系統(tǒng)，引發(fā)植物防御相關(guān)基因如病程相關(guān)蛋白基因PR1a的高表達(dá)［22］。本研究結(jié)果表明，番茄在接種內(nèi)生磚紅鐮刀菌后其生長素合成相關(guān)基因SlYUC5表達(dá)水平顯著提高，與植物生長素促進(jìn)植物生長的功效一致。然而，有意思的是水楊酸合成途徑關(guān)鍵基因SlICS1的表達(dá)顯著下調(diào)，茉莉酸合成關(guān)鍵基因Sl-LOXD和病程相關(guān)蛋白基因SlPR1a的表達(dá)水平顯著上調(diào)。由此推測，內(nèi)生磚紅鐮刀菌可能通過迂回的方式，在抑制植物SA 通路促進(jìn)定殖的同時(shí)，激活茉莉酸和病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物抗病性［23］，實(shí)現(xiàn)促生與抗病相統(tǒng)一。內(nèi)生菌抑制水楊酸合成、激活生長素和茉莉酸合成途徑的機(jī)制還需要深入的探究；內(nèi)生磚紅鐮刀菌的寄主譜也還要進(jìn)一步的發(fā)掘，為將其開發(fā)成為“植物疫苗”奠定基礎(chǔ)。