呂慧杰，王紅梅，趙天天，張東鎖，郭 媛，胡勝武

(西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

油菜是中國乃至世界重要的油料作物，是人類食用植物油的重要來源，也是動物飼料中蛋白質(zhì)的重要來源。大力發(fā)展油菜產(chǎn)業(yè)對于中國食用植物油安全供給，增加菜農(nóng)收入，實現(xiàn)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略具有非常重要的意義[1]。油菜雜種優(yōu)勢顯著，目前利用油菜雜種優(yōu)勢的主要途徑包括細胞質(zhì)雄性不育(CMS)、細胞核雄性不育(GMS)、生態(tài)型雄性不育(Ecological male sterility,EMS)、化學雜交劑誘導的雄性不育(CIMS)和自交不親和(SI)等[2-3]。其中，CIMS具有親本選配自由、后代無胞質(zhì)不良效應、育種周期短、雜交種在生產(chǎn)上不會出現(xiàn)不育株，甚至還可以利用F2代等優(yōu)點[4]，受到中國廣大油菜育種工作者的青睞。中國油菜科研人員在新型化學雜交劑的篩選、研發(fā)及兩系雜交種育種方面做了大量工作。目前，國內(nèi)外公開報道的適用于油菜的化學雜交劑或其有效成分主要有殺雄劑1號[5]、KMS-1[6]、ESP[7]、EN[8]、SX-1[9]、苯磺隆(tribenuron methyl, TBM)[10-13]、化殺靈WP[14]、單嘧磺酯鈉(monosulphuronester sodium)[15]、胺磺隆(amidosulfuron)[16]等。其中，TBM屬于磺酰脲類化學除草劑，低濃度使用時對甘藍型油菜等數(shù)十種十字花科植物殺雄效果良好，是一種高效的油菜化學雜交劑成分[11-12,17-18]。目前，利用該技術(shù)已經(jīng)育成‘湘雜油’‘渝黃’‘秦優(yōu)’‘陜油’等系列油菜雜交種，并在生產(chǎn)中廣泛推廣利用[4,17]。

在利用化學雜交劑進行油菜兩系雜交種制種時，當給母本噴施化學雜交劑時，一般要對父本進行遮擋，以保證父本花朵安全，以便產(chǎn)生大量可育花粉。然而，遮擋過程增加了勞動力投入，使制種成本提高。因此，利用抗除草劑(TBM)的油菜突變體作為父本，無需遮擋，可以簡化油菜兩系雜交種制種程序，對油菜雜種優(yōu)勢的利用及實際生產(chǎn)具有重要意義[19]。乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase,ALS)基因發(fā)生突變是油菜對TBM產(chǎn)生抗性的原因，目前利用自然突變、化學誘變或基因編輯技術(shù)已獲得若干油菜ALS基因突變體，例如PM1和M9 (S653A in BnALS1)、PM2 和M342(T574L in BnALS3)、PN19(T574L in BnALS1)、5N(T574L in BnALS1和BnALS3)、M45(P197S/L in BnALS3)、K4(P197S in BnALS3)和K5(P197S in BnALS1)等[20-28]。Li等[19]在抽薹期對油菜突變體M45及其野生型HS5噴施0.05 mg/L TBM，發(fā)現(xiàn)HS5植株生長及育性受到嚴重影響，而突變體M45植株未受到影響，且花粉完全可育。然而，關(guān)于抽薹期噴施不同劑量(濃度)TBM對油菜ALS基因突變材料生長發(fā)育的影響，以及誘導其雄性不育的TBM劑量的研究鮮有報道。西北農(nóng)林科技大學油菜研究中心生物技術(shù)育種課題組(以下稱本課題組)研究發(fā)現(xiàn)，在抽薹期葉面噴施20.00 mg/L TBM，可誘導甘藍型油菜抗除草劑突變體K5完全雄性不育，而野生型ZS9則在噴施0.10 mg/L TBM時就完全雄性不育[20]。K5的BnALS1基因的544位點處堿基由C突變?yōu)門 (BnALS1544T)，導致BnALS1蛋白的182位由Pro突變?yōu)镾er[29]。

甘藍型油菜抗除草劑突變體K4，是本課題組利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘變甘藍型油菜ZS9，得到的另一個抗除草劑TBM的突變體[30]。研究表明，該突變體BnALS3基因535位由C突變?yōu)門(BnALS3535T)，導致其編碼的BnALS3蛋白179位Pro變?yōu)镾er[25]。本研究以甘藍型油菜突變體K4為材料，通過抽薹期噴施不同濃度TBM，觀察TBM處理對K4的花粉育性、花器官形態(tài)以及主要農(nóng)藝性狀的影響，從而明確誘導油菜突變體K4雄性不育的TBM劑量。研究結(jié)果將為抗除草劑油菜在化學殺雄兩系雜交種育種中的有效利用提供骨干材料及理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料及化學藥劑

供試材料為甘藍型油菜(BrassicanapusL.)抗TBM突變體K4及其野生型ZS9。該突變體是ZS9經(jīng)過EMS誘變的M2代群體，噴施TBM篩選得到[30]；其BnALS3基因535位由C突變?yōu)門(BnALS3535T)，導致其編碼的BnALS3蛋白179位Pro突變?yōu)镾er(對應擬南芥AtALS-197位)[25]。

化學雜交劑由苯磺隆(TBM)配置而成。TBM可濕性粉劑，有效成分含量10%(麥發(fā)牌，沈陽市和田化工有限公司)。取1 g TBM溶于500 mL水，配制成2.00 mg/mL的母液，噴藥前將母液稀釋成不同濃度的工作液，對照用純水。

1.2 試驗方法

田間試驗于2018年─2020年2個生長季節(jié)進行。2018年和2019年9月下旬將材料播種于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學農(nóng)作物標本園 (N34.29°，E108.06°)，小區(qū)種植，行長2 m，行距0.2 m，株距0.1 m。一般大田管理。

1.2.1 噴藥處理 于油菜抽薹期，最大花蕾長度1～2 mm時，對K4與ZS9植株進行噴藥處理。 2 a試驗分別于2019-03-14、2020-03-03第1次對材料進行葉面噴施，單株受藥量約6 mL，7 d后進行第2次噴施。其中，K4設0.00 mg/L(對照)、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、7.50 mg/L、10.00 mg/L和12.50 mg/L共設7個TBM濃度處理，ZS9設0.00 mg/L(對照)、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L共4個TBM濃度處理。田間試驗每個處理設3次重復，每個重復5行，采用隨機區(qū)組設計。

1.2.2 花器官觀察 在盛花期各濃度處理小區(qū)中，隨機選擇10株，每株選取主花序的5朵花，對花瓣長、花瓣寬、雄蕊長度和雌蕊長度進行測定，并對花和花序進行拍照記錄。

1.2.3 育性統(tǒng)計 不育花粉率統(tǒng)計：在花期取不同濃度處理后的K4和ZS9的花蕾放入70%酒精保存，每個濃度處理選3個花蕾，剝開花藥壓碎混勻，用醋酸洋紅壓片染色，在顯微鏡(Olympus BX51，日本)下檢測花粉活力并拍照，統(tǒng)計不育花粉與總花粉數(shù)，計算不育花粉率。

不育株率統(tǒng)計：將植株上有連續(xù)5朵以上雄性不育花的植株定義為雄性不育株，統(tǒng)計不育株數(shù)與小區(qū)內(nèi)植株總數(shù)，計算不育株率。

1.2.4 農(nóng)藝性狀考察 在油菜成熟期，各處理小區(qū)內(nèi)隨機選擇10株，測定以下農(nóng)藝性狀：株高、分枝部位、一次有效分枝數(shù)、主花序長度、主花序角果數(shù)、全株角果數(shù)、每果粒數(shù)、角果長度、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行整理，SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，差異顯著性分析使用Duncan’s法，P<0.05。表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準偏差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TBM處理對突變體K4花器官及育性的影響

為探明誘導突變體K4雄性不育的TBM劑量范圍，抽薹期利用不同濃度的TBM對K4和其野生型ZS9進行葉面噴施處理。結(jié)果表明，ZS9隨著TBM處理濃度的升高，花莖變紫色(圖1- A1～D1)，花器官(花瓣長、花瓣寬、雌蕊長、雄蕊長)變小(表1；圖1-A2～D2)，花粉不育率(表2；圖1-A3～D3)及雄性不育株率升高(表2；圖1- A4～D4)，其中，0.10 mg/L TBM處理可誘導ZS9完全雄性不育。K4隨著TBM處理濃度的升高，花莖略微變色(圖2-A1～G1)，花器官(花瓣長、花瓣寬、雌蕊長、雄蕊長)變小(表3；圖2- A2～G2)，花粉不育率(表4；圖2-A3～G3)及雄性不育株率升高(表4；圖2-A4～G4)，在10.00 mg/L TBM處理下可誘導K4完全雄性不育。

表1 不同濃度苯磺隆處理下ZS9花器官形態(tài)Table 1 Floral organ morphology of ZS9 under different concentrations of tribenuron methyl

A～D分別代表TBM處理濃度為0.00 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L;1～4分別代表花序、花、花粉活力、自交結(jié)實情況A-D represents 0.00 mg/L, 0.05 mg/L, 0.10 mg/L and 0.50 mg/L of TBM treatment，respectivelyt; 1-4 represents inflorescence, flower, pollen vigor and bagged seed-settings，respectively

表2 不同濃度苯磺隆處理下ZS9的育性情況Table 2 Male sterility of ZS9 induced by different concentrations of tribenuron methyl

A～G分別代表TBM處理濃度為0.00 mg/L、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、7.50 mg/L、10.00 mg/L和12.50 mg/L;1～4分別代表花序、花、花活力自交結(jié)實情況A-G represent 0.00 mg/L,1.00 mg/L,2.50 mg/L,5.00 mg/L,7.50 mg/L,10.00 mg/L,12.50 mg/L of TBM treatment,respectively;1-4 represents inflorescence,flower,pollen vigor and bagged seed-settings,respectively圖2 不同濃度苯磺隆處理下突變體K4花器官、花粉活力及自交結(jié)實情況Fig.2 Morphology of floral organs, pollen viability and bagged seed-setting of mutant K4 under different concentrations of tribenuron methyl

表3 不同濃度苯磺隆處理下K4花器官形態(tài)Table 3 Floral organ morphology of K4 under different concentrations of tribenuron methyl

表4 不同濃度苯磺隆處理下K4突變體的育性情況Table 4 Male sterility of mutant K4 induced by different concentrations of tribenuron methyl

與ZS9比較，K4能耐受更高濃度的TBM。在不同濃度TBM處理后，K4花莖變色較ZS9更輕微，花粉不育率和雄性不育株率升高慢，誘導K4完全雄性不育的TBM濃度(10.00 mg/L)是ZS9(0.10 mg/L)的100倍。

2.2 不同濃度TBM處理對K4農(nóng)藝性狀的影響

ZS9在不同濃度TBM噴藥處理后，與對照比較，除角粒數(shù)顯著降低外，單株產(chǎn)量、千粒質(zhì)量和全株角果數(shù)等其他9個性狀無顯著差異(表5)。

表5 不同濃度苯磺隆處理下ZS9主要農(nóng)藝性狀Table 5 Main agronomic traits of ZS9 underdifferent concentrations of tribenuron methyl TBM

K4在不同濃度TBM處理后，除分枝數(shù)、主花序長度、全株角果數(shù)與對照比較無顯著差異外，其他7個性狀均存在顯著差異(表6)。角果長度在1.00 mg/L TBM處理下，與對照比較就已顯著減??；角粒數(shù)在5.00 mg/L TBM處理下，與對照比較出現(xiàn)顯著降低；主花序角果數(shù)則在10.00 mg/L TBM處理下，與對照比較存在顯著差異；株高、分枝部位、千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量則在12.50 mg/L TBM處理下，與對照比較存在顯著差異，且均比對照顯著降低。在誘導K4完全雄性不育的10.00 mg/L TBM處理下，除主花序角果數(shù)、角果長度、每角粒數(shù)與對照相比顯著降低外，單株產(chǎn)量等其他7個性狀與對照均無顯著差異。

表6 不同濃度苯磺隆處理下K4主要農(nóng)藝性狀Table 6 Main agronomic traits of mutant K4 under different concentrations of tribenuron methyl TBM

3 討 論

利用化學雜交劑誘導雄性不育已成為油菜雜種優(yōu)勢利用的一個重要授粉控制系統(tǒng)[3-4]。在利用化學雜交劑進行油菜兩系雜交種制種時，當給母本噴施化學雜交劑時，一般要對父本進行遮擋，以保證父本安全、花粉可育，這個過程將增加制種成本。中國科研人員研究發(fā)現(xiàn)，磺酰脲類化學除草劑TBM在低濃度使用時，對甘藍型油菜等多種十字花科植物具有良好的殺雄效果，是一種高效的油菜化學雜交劑成分[11-13,17-18,31]。有學者提出，利用抗化殺劑(TBM)的油菜作為父本，噴藥時父本無需遮擋，從而可以簡化兩系雜交種制種程序[19]。本研究以抗TBM的甘藍型油菜突變體K4為材料，在抽薹期葉面噴施不同濃度的TBM，研究其誘導雄性不育的效果，探究誘導K4雄性不育的最適TBM濃度。結(jié)果表明，在0.10 mg/L×6 mL TBM劑量處理下，野生型ZS9就已經(jīng)產(chǎn)生100%雄性不育，主要農(nóng)藝性狀未受顯著影響，這與前人結(jié)果基本一致[11-12,19-20]；而 10.00 mg/L×6 mL TBM劑量處理才能誘導K4完全雄性不育，該TBM劑量是誘導ZS9雄性不育劑量的100倍。Lv等[20]研究報道，在20.00 mg/L×5 mL TBM處理才能誘導抗除草劑突變體K5雄性不育，該劑量大約是誘導K4雄性不育劑量的兩倍。誘導K4和K5雄性不育TBM劑量差異的原因可能是二者突變基因不同。K4的BnALS3基因的535位點處堿基由C突變?yōu)門(BnALS3535T)，導致BnALS3蛋白的179位由Pro突變?yōu)镾er[25,32]；K5的BnALS1基因的544位點處堿基由C突變?yōu)門(BnALS1544T)，導致BnALS1蛋白的182位由Pro突變?yōu)镾er，雖然這兩個突變位點均對應擬南芥的AtALS-197位。Guo等[26]研究報道，甘藍型油菜EMS突變體M342(T574L in BnALS3)和PN19(T574L in BnALS1)突變位點均對應擬南芥的AtALS-574位，但二者對除草劑TBM和MES(mesosulfuron)苗期抗性也存在差異。因此，推測突變基因以及突變位點的不同可能會造成突變體對殺雄劑的抗性不同。

此外，研究發(fā)現(xiàn)外施TBM導致油菜花莖變色等現(xiàn)象，下一步測量相關(guān)激素如花青素等的含量變化，雄蕊敗育的細胞學特征，以及基因表達變化情況等，以期揭示苯磺隆誘導油菜ALS基因突變體雄性不育的機理?？傊琄4是一個很好的抗化殺劑(TBM)的親本材料，在兩系制種中作為父本材料使用可簡化制種程序，降低制種成本。該研究結(jié)果為油菜化殺兩系育種提供了重要的理論參考和育種親本材料。