潘天琦 閆京銳 姚俐冰 楊一帆 田 華 姚樹桐

山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）1.臨床與基礎醫(yī)學院；3.藥學院；4.動脈粥樣硬化研究所，山東泰安 271000；2.泰安第一中學，山東泰安 271000；5.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東濟南 250355

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是眾多心腦血管疾病共同的病理學基礎，而AS性疾病是指AS病變引起的器官嚴重血液供應障礙，最終導致器官功能紊亂的疾病，是一類嚴重危害人類健康的疾病，是全世界范圍內(nèi)心血管疾病致死和致殘的主要病因。雖然AS的發(fā)病因素繁多，且引發(fā)AS的具體機制尚存在爭議，但是慢性炎癥在AS發(fā)生和發(fā)展中的重要作用已被廣泛認可，尤其是巨噬細胞作為重要的炎癥細胞在其中發(fā)揮著非常重要的作用。在AS病變中，巨噬細胞上的清道夫受體能夠識別并攝取大量氧化修飾的脂蛋白，成為泡沫細胞的主要來源，促進脂質(zhì)核心的形成和增大，并產(chǎn)生白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥介質(zhì)，介導繼發(fā)性炎癥反應的發(fā)生和細胞的壞死，最終導致血管內(nèi)的斑塊破裂，從而導致血栓形成，這是急性心血管事件發(fā)生的主要機制[1］。有研究顯示，細胞焦亡是介于細胞壞死和凋亡之間的一種新型程序性死亡方式，該方式伴有炎癥反應的發(fā)生，且對天冬半胱氨酸酶-1（caspase-1）有依賴作用。細胞焦亡主要是細胞快速的質(zhì)膜破裂反應，將細胞內(nèi)容物和IL-1β、白介素-18（interleukin-18，IL-18）等促炎介質(zhì)等釋放出來[2］。研究顯示，在細胞發(fā)生焦亡的過程中起到關鍵作用的信號分子有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）和caspase-1，這兩種分子在糖尿病患者的頸動脈粥樣斑塊、急性冠狀動脈綜合征患者的粥樣斑塊和巨噬細胞來源的泡沫細胞中都呈現(xiàn)高度表達[3-4］。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoproein，ox-LDL）和AS斑塊中的膽固醇結(jié)晶能夠活化巨噬細胞中的caspase-1，以提高巨噬細胞IL-1β和IL-18的轉(zhuǎn)錄、表達和釋放，而通過基因敲除來抑制細胞焦亡，可有效降低小鼠AS的斑塊面積，表明巨噬細胞的焦亡作用在AS進程中發(fā)揮著極其重要的作用，并可能成為AS新的治療靶點[2，5-7］。大蒜作為一種兼有食藥兩用特性的食品，因其有抗病毒、抗菌、調(diào)節(jié)血糖和免疫、降血脂、抗腫瘤等生物學功能而被廣泛應用[8］。臨床試驗證實，大蒜的片劑[9］和大蒜素[10］可以顯著降低冠心病患者頸動脈內(nèi)膜中層的厚度。另外，大蒜素還可降低血脂水平[11］，誘導三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1表達[12］，并可縮小Apo E基因敲除小鼠動脈硬化斑塊的面積、抑制腹腔來源的巨噬細胞發(fā)生泡沫化[13］。本課題組既往研究證實，大蒜素可通過抑制caspase-12和凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1來減少ox-LDL所致的巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞的凋亡[14-15］。但是關于大蒜素抑制細胞焦亡的作用和機制，目前國內(nèi)外報道較少。本研究在ox-LDL誘導的巨噬細胞損傷模型上探索了大蒜素對細胞焦亡和氧化應激的影響，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限公司，胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基分別為Gibco和Hyclone公司產(chǎn)品，大蒜素購于Santa Cruz公司，TUNEL檢測試劑盒購于Roche公司。MTT購于Genview公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒來源于南京建成生物工程研究所。2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescein diacetate，DCHF-DA）和二亞苯基碘鎓（diphenyleneiodoniu，DPI）分別來源于Molecular Probes和Sigma公司。檢測caspase-1的試劑盒和檢測IL-1β及IL-18的ELISA試劑盒分別購買自上海碧云天公司和上海藍基生物科技公司。NLRP3和βactin兔來源的一抗分別來源于Cell Signaling Technology和Sigma公司。山羊抗兔二抗和ECL試劑盒分別來源于北京中杉金橋和Pierce公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

RAW264.7巨噬細胞從中國科學院上海細胞庫獲取，將RAW264.7用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2的無菌環(huán)境中。隨機分為4組：對照組、ox-LDL組、大蒜素預處理組和氧化應激抑制劑DPI預處理組。其中對照組于培養(yǎng)液中進行常規(guī)培養(yǎng)；ox-LDL組選擇濃度為100 mg/L ox-LDL刺激細胞；大蒜素預處理組培養(yǎng)液中加入濃度分別為12.5、25、50和100 mg/L的大蒜素進行1 h的預處理，隨后加入100 mg/L ox-LDL；氧化應激抑制劑DPI預處理組培養(yǎng)液中首先加入DPI（5μmol/L）進行預處理1 h，然后再加入ox-LDL（100 mg/L）。上述4組細胞均在干預24 h后進行收集。

1.3 細胞活力和LDH檢測

細胞經(jīng)過處理后，根據(jù)常規(guī)MTT方法對細胞的活力進行檢測[14］。細胞活力（%）=IOD樣本/IOD對照×100%。依據(jù)LDH活性檢測試劑盒的說明書檢測4組培養(yǎng)液中LDH活性以評價細胞膜的損傷程度。

1.4 IL-1β和IL-18檢測

取4組細胞培養(yǎng)液，以2 500 r/min離心10 min后取上清液。根據(jù)制造商說明書使用ELISA試劑盒對IL-1β和IL-18水平進行檢測。

1.5 caspase-1檢測

在胰酶消化各組細胞后，2 000 r/min離心10 min，PBS潤洗后，使用裂解液于冰浴中裂解20 min，在4℃，12 000 r/min條件下離心20 min。取上清液，蛋白定量采用Bradford法。取40μL反應緩沖液、50μL細胞裂解液和10μL caspase-1底物（Ac-YVAD-p NA），于96孔板內(nèi)混勻，在37℃環(huán)境中孵育2 h。隨后用多功能酶標儀（奧地利Molecular Devices公司）對上述混勻液進行吸光度檢測，檢測波長為405 nm。利用標準曲線計算出每組樣本caspase-1的活性。caspase-1活性（%）=A405樣本/A405對照×100%。

1.6 TUNEL實驗

4組細胞的爬片用4%多聚甲醛固定30 min。隨后PBS潤洗3次，放置在冰上并使用0.1%Triton X-100透化處理3 min，加入TUNEL反應液后，室溫黑暗孵育1 h，經(jīng)PBS洗滌后，用DAPI襯染細胞核。熒光顯微鏡采集圖像。TUNEL染色陽性細胞率=TUNEL染色陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.7 Western blotting

參考課題組既往的操作步驟[16］，用RIPA裂解液提取細胞蛋白，隨后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉后與NLRP3和β-actin一抗（1∶500）4℃孵育過夜，洗膜后再與二抗（1∶1 500）室溫孵育1 h，最后用ECL顯色液顯示出各組蛋白條帶，使用化學發(fā)光成像儀（上海歐翔科學儀器有限公司）完成圖像采集。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics，MD，美國）對蛋白條帶IOD值進行分析，NLRP3的相對表達水平以NLRP3 IOD值與β-actin IOD值的比值表示。

1.8 活性氧檢測

將細胞均勻種植于無菌96孔板中，24 h后吸棄培養(yǎng)基，加入1∶1 000用無FBS培養(yǎng)液稀釋的DCHF-DA探針（終濃度為10μmol/L），培養(yǎng)箱中避光孵育30 min后，以無血清培養(yǎng)液潤洗3次，使用多功能酶標儀檢測，設置檢測條件為激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm。以對照組細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平限定為100%，其他各組ROS的水平以熒光強度占對照組的百分比來表示。

1.9 SOD和MDA檢測

將4組細胞處理后重新懸浮于0.5 mL的裂解緩沖液中進行裂解，以1 500 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定SOD（U/mg蛋白）的活性和MDA含量（μmol/g蛋白）。

1.10 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析進行組間比較，組間兩兩比較采取SNK法，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素減輕ox-LDL所致的巨噬細胞損傷

RAW 264.7巨噬細胞分別用12.5、25、50和100 mg/L的大蒜素處理24 h，結(jié)果顯示只有100 mg/L大蒜素處理的細胞活力降低（P<0.05），其他組細胞活力與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；12.5～50 mg/L的大蒜素處理后無損傷細胞（圖1A）。然而大蒜素預處理后細胞活力增加，LDH釋出減少（P<0.05或P<0.01）（圖1B和C），表明大蒜素能夠減輕ox-LDL誘導的巨噬細胞損傷。ox-LDL組TUNEL陽性細胞率明顯高于正常對照組，而大蒜素預處理可以明顯抑制ox-LDL所致的TUNEL染色陽性細胞率增加（P<0.01）（圖1D）。大蒜素對ox-LDL所致細胞損傷的抑制作用與氧化應激抑制劑DPI類似。

圖1 大蒜素抑制ox-LDL所致的巨噬細胞損傷（n=6）

2.2 大蒜素抑制ox-LDL觸發(fā)的巨噬細胞炎癥因子分泌

與正常對照組比較，ox-LDL處理細胞24 h明顯增加IL-1β和IL-18的分泌（P<0.01），而與DPI相似，大蒜素預處理則可明顯抑制IL-1β和IL-18分泌，且具有濃度依賴性（P<0.05或P<0.01）。見圖2。

圖2 大蒜素抑制ox-LDL所誘導的IL-1β和IL-18分泌（n=6）

2.3 大蒜素抑制ox-LDL觸發(fā)的NLRP3表達的上調(diào)

Western blot檢測焦亡相關蛋白NLRP3的表達。與正常對照組比較，ox-LDL處理組細胞NLRP3蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.01），而經(jīng)過大蒜素的預處理，NLRP3蛋白表達較ox-LDL處理后明顯下降（P<0.05或P<0.01），其作用與DPI相似（圖3）。

圖3 大蒜素抑制ox-LDL所誘導的RAW 264.7細胞NLRP3上調(diào)（n=3）

2.4 大蒜素抑制ox-LDL觸發(fā)的巨噬細胞caspase-1活化

與正常對照組比較，ox-LDL處理組細胞caspase-1活性顯著上調(diào)（P<0.01），而經(jīng)過大蒜素的預處理，caspase-1活性較ox-LDL處理后明顯下降（P<0.05或P<0.01），其作用與DPI相似（圖4）。

圖4 大蒜素抑制ox-LDL所誘導的caspase-1活化（n=6）

2.5 大蒜素減輕ox-LDL所介導的氧化應激

與正常對照組比較，ox-LDL處理組SOD活性明顯下降（P<0.01），ROS和MDA水平顯著上調(diào)（P<0.01）；而與DPI相似，大蒜素預處理使SOD活性明顯增加（P<0.05），ROS和MDA生成顯著減少（P<0.01），提示大蒜素可減輕ox-LDL所介導的氧化應激。見圖5。

圖5 大蒜素抑制ox-LDL所誘導的氧化應激（n=6）

3 討論

細胞的炎癥反應和死亡參與了AS的整個發(fā)生發(fā)展過程，并且與AS斑塊易損性密切相關。AS晚期，巨噬細胞凋亡可促進斑塊破裂和血栓形成，從而引發(fā)急性心腦血管事件[17］，但易損斑塊形成以及伴發(fā)的炎癥反應的發(fā)生機制不僅限于巨噬細胞凋亡。作為AS發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素，ox-LDL能夠介導巨噬細胞凋亡，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，致使細胞內(nèi)容物流出和促炎因子釋放，而介導細胞凋亡的關鍵酶被抑制后并不能完全拮抗ox-LDL所誘導的巨噬細胞的死亡[18-19］，提示ox-LDL很可能通過除凋亡以外的其他方式引起巨噬細胞的死亡。

研究指出，細胞焦亡是一種新型的程序性細胞死亡形式，表現(xiàn)為細胞不斷腫脹，細胞上形成凸出物直至細胞膜破裂，釋放內(nèi)容物和IL-1β及IL-18等炎癥因子，引起強烈的炎癥反應。隨著形態(tài)學改變，細胞核出現(xiàn)固縮，DNA發(fā)生斷裂并且TUNEL染色呈現(xiàn)陽性[2］。慢性炎癥反應是AS發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，細胞焦亡過程可以促進炎癥因子的釋放，提示細胞焦亡可能參與了AS的發(fā)展并增加斑塊易損性，因此細胞焦亡很可能成為AS新的治療靶點。本研究顯示，ox-LDL處理后，RAW 264.7巨噬細胞的活力下降，培養(yǎng)基中LDH水平和IL-1β、IL-18分泌增加，TUNEL染色陽性的細胞數(shù)量也有明顯增加，這與文獻報道[5，20］一致，而大蒜素可明顯抑制ox-LDL所致的上述變化，提示大蒜素可以減輕ox-LDL介導的巨噬細胞焦亡。

NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR）家族成員，在經(jīng)典的caspase-1依賴性細胞焦亡通路中，caspase-1前體可以與識別受體NLRP3通過接頭蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain，ASC）結(jié)合成為一個炎性復合物，即炎癥小體。其自身水解并產(chǎn)生具有酶活性的cleaved-caspase-1，從而對IL-β和IL-18的前體進行切割，成為有活性的IL-β和IL-18，隨后釋放到細胞外造成炎癥反應，即發(fā)生細胞焦亡[21］。在患者冠狀動脈和頸動脈AS斑塊特別是巨噬源性泡沫細胞中NLRP3的表達顯著上調(diào)[3-4］，而沉默NLRP3可以減少促炎因子生成，并能上調(diào)平滑肌和膠原纖維含量，增強粥樣斑塊的穩(wěn)定性[7，22］。ox-LDL可活化NLRP3和caspase-1，引發(fā)巨噬細胞焦亡。但基因沉默或基因敲除NLRP3和caspase-1可抑制巨噬細胞DNA的斷裂、細胞的崩解和內(nèi)容物流出以及IL-1β、IL-18等炎癥因子的釋放，還可以減少ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊中單核細胞聚集和炎癥因子的表達，進而能夠減輕AS病理改變[5-7，22］。本研究顯示，大蒜素可明顯抑制ox-LDL觸發(fā)的NLRP3上調(diào)和caspase-1活化，提示抑制NLRP3-caspase-1信號通路是大蒜素減輕細胞焦亡的重要機制之一。

氧化應激是介導細胞焦亡的重要機制。ox-LDL[5］和琥珀酸[23］通過增強氧化應激反應誘導巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞焦亡，而ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸可抑制琥珀酸誘導的血管內(nèi)皮細胞NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡相關蛋白的上調(diào)[23］。本研究顯示，氧化應激抑制劑DPI不僅可抑制ox-LDL所觸發(fā)的巨噬細胞NLRP3上調(diào)和caspase-1活化，而且明顯降低TUNEL陽性細胞率和LDH漏出，增加細胞活力，并可減少IL-1β和IL-18釋放，進一步證實ox-LDL通過增強氧化應激激活NLRP3-caspase-1途徑介導的巨噬細胞焦亡。文獻報道[24］和本課題組[15］前期的研究均證實大蒜素通過抑制氧化應激反應減輕ox-LDL所觸發(fā)的血管內(nèi)皮細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以通過抑制ROS的產(chǎn)生降低NLRP3、caspase-1和IL-1β等蛋白的表達，且能顯著抑制脂多糖誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的炎癥反應[25-26］。本研究顯示，與DPI相似，大蒜素可減輕ox-LDL所致的ROS和MDA的生成，提高SOD的活性，提示大蒜素可以抑制巨噬細胞焦亡和減弱氧化應激反應。

綜上所述，大蒜素能夠減輕ox-LDL觸發(fā)的RAW 264.7巨噬細胞焦亡，該過程與減弱氧化應激和NLRP3-caspase-1信號通路的活化密切相關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突