毛 煥 潘建立 王長友

天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院1.病理科；2.普外科，天津 301900

急性胰腺炎是一種全身性疾病，肺損傷是其發(fā)病后首先出現(xiàn)的嚴重并發(fā)癥[1］。急性胰腺炎肺損傷患者主要表現(xiàn)為胸腔積液、動脈血氧分壓（PaO2）降低等癥狀，是影響胰腺炎進展及預后的關(guān)鍵性因素[2］。中醫(yī)學認為胰腺炎肺損傷與體內(nèi)肝火瘀滯、氣滯濕阻等病機有關(guān)[3］，然而目前臨床中尚未有用于治療急性胰腺炎肺損傷的療效確切的藥物，對于急性胰腺炎所致肺損傷的治療藥物的研發(fā)，仍是目前的工作重點。Rho/ROCK通路近年來被報道是誘導胰腺炎患者體內(nèi)發(fā)生炎癥因子級聯(lián)反應的重要信號通路[4］，并對胰腺炎肺損傷患者的疾病狀態(tài)發(fā)揮重要作用[5］。柴芩雙解湯由柴胡、葛根等諸多中藥材組成，具有清熱解毒、和解表里的功效。本研究通過探索柴芩雙解湯對急性胰腺炎所致大鼠肺損傷的保護作用及機制，為柴芩雙解湯在急性胰腺炎所致肺損傷中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠72只，雄性，SPF級，8周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自湖南嘉泰實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2020-0006］，飼養(yǎng)于動物房，溫度20～24℃，濕度40%～70%，每12 h明暗交替，給予標準飼料及自來水。

1.1.2 藥品及試劑 柴芩雙解湯（由柴胡4.5 g，生葛根3 g，羌活2.4 g，知母6 g，炙草3 g，青子芩4.5 g，生石膏四錢12 g，防風3 g，豬苓4.5 g，白豆蔻1.8 g組成）由藥材飲片制成生藥含量為1 g/mL的湯劑，由北京同仁堂藥業(yè)提供；牛黃膽酸鈉（北京索萊寶科技公司，貨號145-42-6）；法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號201905261，規(guī)格2 mL：30 mg）；肺組織髓過氧化物酶（MPO）（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號ER0142）；環(huán)氧化酶2（COX-2）（武漢華美生物工程有限公司，貨號CSBE13399r-1）；一氧化氮合酶（iNOS）（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號KGT020）；RhoA、GAPDH兔單克隆抗體及ROCK2兔多克隆抗體（碧云天生物科技公司，貨號AF2179、AF1186、AF7899）；蛋白裂解液（德國Qiagen公司，貨號19076）；顯影液（上海博湖生物科技有限公司，貨號BH-DB6589）；蘇木精伊紅（HE）染色液（上海吉至生化科技有限公司，貨號AG1120）；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物設(shè)計及合成（賽默飛世爾科技有限公司）；TRIzol試劑及qPCR試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，貨號A15299、A33254）。

1.1.3 儀器 InfiniteF50酶標儀（瑞士Tecan公司）；MicroChemi凝膠成像儀（以色列DNR生物影像系統(tǒng)有限公司）；Ts2-FL熒光倒置顯微鏡（尼康儀器有限公司）；RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；冷凍離心機購自美國BECKMAN COULTER公司；BX-4000全自動生化分析儀購自日本SYSMEX公司；VetStat動物電解質(zhì)與血氣分析儀（美國IDEXX公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 72只大鼠隨機分為假手術(shù)組，胰腺炎肺損傷組，柴芩雙解湯低、中、高劑量組及法舒地爾組，每組12只。除假手術(shù)組，其余參照文獻方法[6-7］，大鼠麻醉后取仰臥位，沿腹部中線行縱向切口，暴露十二指腸，按照1 mL/kg向胰膽管泵入5%牛黃膽酸鈉；假手術(shù)組只暴露十二指腸及胰膽管然后關(guān)腹。2 d后以大鼠食欲減退、毛色變暗、背部弓起、耳緣靜脈變粗突起，同時伴呼吸急促，肺部聽診出現(xiàn)濕啰音視為造模成功[7］，所有大鼠全部造模成功，造模成功率100%。按照臨床給藥劑量的6.2倍折算，柴芩雙解湯低、中、高劑量組分別灌胃給予2、4、8 g/kg的柴芩雙解湯，每日2次；法舒地爾組腹腔注射法舒地爾10 mg/kg[8］，每日1次；假手術(shù)組及胰腺炎肺損傷組給予生理鹽水，連續(xù)5 d[9］。

1.2.2 血PaO2、二氧化碳分壓（PaCO2）檢測 大鼠麻醉后仰臥，固定于操作板上，腹主動脈取血3 mL，使用血氣分析儀檢測大鼠動脈血PaO2、PaCO2。

1.2.3 肺組織MPO、COX-2、iNOS檢測 大鼠處死后取肺組織，研磨勻漿后離心，取上清，使用MPO、COX-2、iNOS ELISA檢測試劑盒測定肺組織MPO、COX-2、iNOS水平。

1.2.4 病理學評價 取肺組織，經(jīng)生理鹽水灌洗后用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切成5μm厚的切片，HE染色，光鏡下盲法觀察。根據(jù)肺組織水腫、出血、炎癥細胞浸潤等病理改變比例進行Holfbauer病理評分[10］，0分：無病理改變；1分：0<病理改變≤25%；2分：25%<病理改變≤50%；3分：50%<病理改變≤75%；4分：75%<病理改變≤100%。

1.2.5 肺組織RhoA、ROCK2 mRNA水平檢測 用TRIzol試劑從肺組織中提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA。使用qPCR試劑盒進行qRT-PCR檢測，以GAPDH作為內(nèi)參，使用2?ΔΔCT法分析各基因相對表達量。引物序列如表1所示。

表1 各基因引物序列

1.2.6 肺組織RhoA、ROCK2蛋白表達檢測 取肺組織，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解并勻漿，以8 000 r/min離心10 min，收集上清液，水浴煮沸變性后測蛋白濃度，取50μg蛋白上樣，電泳分離、轉(zhuǎn)膜后，用RhoA、GAPDH兔單克隆抗體及ROCK2兔多克隆抗體（均以1∶500稀釋）及山羊抗兔二抗（1∶1 000稀釋）孵育后，滴加顯影劑，凝膠成像并使用ImageJ進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，對多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠血PaO2、PaCO2的影響

與假手術(shù)組比較，胰腺炎肺損傷組大鼠血PaO2降低，血PaCO2升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與胰腺炎肺損傷組大鼠比較，柴芩雙解湯低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠血PaO2升高，血PaCO2降低，且隨著柴芩雙解湯劑量的增加，大鼠血PaO2逐漸升高，PaCO2逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見表2。

表2 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠血PaO2、PaCO2的影響（mmHg）

2.2 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠肺組織MPO、COX-2、iNOS的影響

與假手術(shù)組比較，胰腺炎肺損傷組大鼠肺組織MPO、COX-2、iNOS水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與胰腺炎肺損傷組大鼠比較，柴芩雙解湯低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠肺組織MPO、COX-2、iNOS水平降低，且MPO、COX-2、iNOS水平隨柴芩雙解湯劑量的增加而逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見表3。

表3 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠肺組織MPO、COX-2、iNOS的影響（U/g）

2.3 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠肺組織病理的影響

假手術(shù)組大鼠肺組織正常，與假手術(shù)組大鼠比較，胰腺炎肺損傷組肺泡壁增厚，肺間質(zhì)水腫及炎性細胞浸潤，肺組織病理評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與胰腺炎肺損傷組大鼠比較，柴芩雙解湯低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠肺組織炎性浸潤減輕，肺泡壁增厚減輕，病理學評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見圖1及表4。

表4 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠肺組織病理評分的影響

圖1 柴芩雙解湯對急性胰腺炎所致大鼠肺損傷的影響

2.4 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠RhoA、ROCK2 mRNA的影響

與假手術(shù)組比較，胰腺炎肺損傷組大鼠肺組織RhoA、ROCK2 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與胰腺炎肺損傷組大鼠比較，柴芩雙解湯低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠RhoA、ROCK2 mRNA水平降低，且RhoA、ROCK2 mRNA水平隨柴芩雙解湯劑量的增加而逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見表5。

表5 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠RhoA、ROCK2 mRNA的影響

2.5 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠RhoA、ROCK2蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，胰腺炎肺損傷組大鼠肺組織RhoA、ROCK2蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與胰腺炎肺損傷組大鼠比較，柴芩雙解湯低、中、高劑量組及法舒地爾組RhoA、ROCK2蛋白水平降低（P<0.05），隨著柴芩雙解湯劑量的增加，大鼠肺組織RhoA、ROCK2蛋白水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見圖2。

圖2 柴芩雙解湯對急性胰腺炎肺損傷大鼠RhoA、ROCK2蛋白表達的影響

3 討論

急性胰腺炎是臨床常見的消化道危重癥之一，由酒精性因素、代謝性疾病等病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活并消化自身胰腺組織，引起胰腺水腫、出血甚至壞死等炎癥反應。流行病學研究表明，急性胰腺炎發(fā)病率逐年上升，總體病死率約為5%[11］，若患者出現(xiàn)呼吸功能受限等肺部相關(guān)并發(fā)癥則提示預后不良[12］，因此對于急性胰腺炎肺損傷的治療非常關(guān)鍵。

中醫(yī)學認為胰腺炎是以痞結(jié)于胸、肝氣郁滯、腑實不通等為主要病機，其臨床表現(xiàn)的腹痛、發(fā)熱等癥狀則歸屬為“痞、滿、燥、實”的典型表現(xiàn)[13］。因此對于胰腺炎及其引起的肺損傷等并發(fā)癥則采用清熱瀉火、祛瘀通腑的原則進行治療[14］。柴芩雙解湯出自中醫(yī)學著作《重訂通俗傷寒論》，具有和解表里，調(diào)劑陰陽之功效，傳統(tǒng)中醫(yī)學使用其治療肢冷脅痛、胸痞不舒等癥狀。方中柴胡、黃芩為君藥，起到清少陽相火之功效；葛根、羌活、防風則為臣藥，用于解表祛邪；同時知母、石膏聯(lián)合黃芩，使邪離于陽，佐以豬苓，分離陰陽；使以白蔻之開達氣機，最后以甘草調(diào)和各藥。

動脈血PaO2水平及PaCO2水平是反映肺換氣功能的重要指標[15-16］。MPO是由中性粒細胞分泌的一種過氧化物酶，在胰腺炎患者體內(nèi)，過度活化中性粒細胞分泌的MPO能夠促進毛細血管通透性增加，進而使肺組織充血、水腫，滲出增加，臨床表現(xiàn)為胸腔積液等[17］。COX-2是胰腺炎發(fā)病過程中影響預后的重要因子，研究發(fā)現(xiàn)，胰腺炎大鼠體內(nèi)COX-2表達顯著升高，敲除胰腺炎小鼠COX-2基因后，小鼠肺損傷則明顯減輕[18］。臨床試驗表明，給予胰腺炎患者COX-2抑制劑，可顯著降低患者重癥胰腺炎的發(fā)生率[19］。劉壘等[20］研究發(fā)現(xiàn)，iNOS水平升高是胰腺炎肺損傷的發(fā)病原因之一。朱斌等[21］研究表明，抑制肺組織iNOS水平能夠減輕胰腺炎肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠柴芩雙解湯后，與胰腺炎肺損傷組比較，大鼠血PaO2升高，PaCO2降低，肺組織MPO、COX-2、iNOS水平呈劑量依賴性降低，大鼠肺組織病理學評分逐漸降低，提示柴芩雙解湯能夠恢復胰腺炎肺損傷大鼠肺功能并降低其炎癥反應。

Rho/ROCK通路是與細胞遷移、粘附和聚集相關(guān)的信號通路。研究表明，其在體內(nèi)異常激活能夠促進下游與炎癥相關(guān)通路蛋白的表達[22］。有文獻報道，Rho/ROCK通路異常與腫瘤、蛛網(wǎng)膜下腔出血、肺動脈高壓、肺纖維化等疾病有密切關(guān)系[23］。Rho/ROCK通路對胰腺淀粉酶、蛋白酶等多種酶的分泌有重要影響。同時，在胰腺炎患者體內(nèi)，Rho/ROCK通路被激活，可促進趨化因子的形成，加速中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，誘發(fā)炎癥因子瀑布反應，導致患者疾病加重[24］。抑制Rho/ROCK通路的過度表達則能夠起到肺損傷保護作用[25］。法舒地爾是臨床中常用的一種Rho/ROCK通路抑制劑，因此本實驗使用法舒地爾作為陽性對照藥物。本實驗表明，與胰腺炎肺損傷組大鼠比較，柴芩雙解湯各劑量組及法舒地爾組大鼠肺組織RhoA、ROCK2 mRNA及蛋白水平呈劑量依賴性降低，提示柴芩雙解湯對胰腺炎肺損傷大鼠的保護作用及肺組織病理改變的修復作用可能是通過調(diào)節(jié)Rho/ROCK通路實現(xiàn)的。

綜上所述，柴芩雙解湯能夠改善急性胰腺炎所致肺損傷大鼠肺功能并抑制肺組織病理性改變，降低炎癥水平及氧化損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)Rho/ROCK通路有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突