叢倩倩，崔 曉，唐麗娜，李秀梅，安秀榮

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 泰安 271000）

靈芝（Ganoderma lingzhi）屬真菌界（Fungi）擔(dān)子菌亞門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）靈芝科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma），是一種名貴的藥用真菌，具有抗腫瘤、護(hù)肝、抗病毒、抑菌、抗氧化等多種藥效[1-5]，被稱為“仙草”。

近年來，隨著靈芝藥用功效被不斷發(fā)現(xiàn)，人們對靈芝及其產(chǎn)品的需求量大幅增加，靈芝產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；l(fā)展迅速[6-7]。我國是靈芝出口大國，但栽培品種大多由國外引進(jìn)或野生菌株分離得到，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的品種較少[8]。這不僅對我國靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成威脅，還會對其他國家的品種產(chǎn)生依賴性，同時也浪費了我國豐富的靈芝種質(zhì)資源。此外，大多育種的目標(biāo)更注重產(chǎn)量因素而忽視了功能性指標(biāo)，導(dǎo)致有效成分含量高的品種較少，且菌種退化的現(xiàn)象比較嚴(yán)重，這些問題均制約了我國靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9]。因此，選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)且有效成分含量高的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)新品種，提高品種的功能性，對滿足國民營養(yǎng)健康需求，加快推進(jìn)供給側(cè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和品種換代改良具有重大意義，是促進(jìn)我國靈芝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

以國家認(rèn)定品種泰山赤靈芝1號（TL-1）和野生靈芝菌株4895作為親本，通過原生質(zhì)體單核化雜交育種技術(shù)開展靈芝新品種的選育工作，旨在為靈芝生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的新菌株，提升產(chǎn)品的市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

親本菌株TL-1、4895于泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。TL-1為國家認(rèn)定品種，子實體多糖含量較高，綜合農(nóng)藝性狀較好；4895由采自泰山的野生靈芝菌株馴化而來，其子實體三萜含量較高。

1.2 親本原生質(zhì)體的制備與再生

分別制備2個親本的原生質(zhì)體，用液體再生培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后涂布于固體再生培養(yǎng)基平板上，至長出再生菌落[10-11]。

1.3 單核菌株的篩選及交配型測定

從親本原生質(zhì)體再生平板上挑取菌落小、生長緩慢的單菌落，分別轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中，待菌落長至3 cm～5 cm時，挑取邊緣菌絲鏡檢，無鎖狀聯(lián)合的即為單核菌株。隨機(jī)選取一株單核菌株作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，將其他單核菌株分別與該標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到同一個PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行對峙培養(yǎng)，當(dāng)2個菌株的菌絲相互接觸后，挑取交接處菌絲鏡檢。有鎖狀聯(lián)合則說明這2個單核菌株為不同的交配型；無鎖狀聯(lián)合則說明兩者不親和，為相同的交配型。

1.4 雜交菌株的選育過程

用直徑0.5 cm的金屬打孔器分別將具有不同交配型的2個單核菌株接種到同一個PDA培養(yǎng)基平板上，兩者相距2 cm，25℃恒溫箱對峙培養(yǎng)7 d；待菌絲相互接觸后，挑取交接處的菌絲鏡檢，有鎖狀聯(lián)合則說明雜交成功；將雜交成功組合進(jìn)行拮抗反應(yīng)驗證，共獲得雜交菌株5個。2018年，將5個雜交菌株分別進(jìn)行栽培比較試驗，發(fā)現(xiàn)編號為TL-3的雜交菌株菌蓋中等偏大且厚，形態(tài)較飽滿，產(chǎn)量、子實體有效成分含量均高于親本菌株TL-1。2019年至2021年，進(jìn)行了連續(xù)3年的栽培試驗，發(fā)現(xiàn)TL-3菌株遺傳穩(wěn)定性較好，綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，具有較高的應(yīng)用推廣價值。

1.5 優(yōu)良菌株的ISSR分子標(biāo)記鑒定

分別提取親本菌株TL-1、4895和雜交菌株TL-3的菌絲體基因組DNA[12]，參考NY/T 1730-2009食用菌菌種真實性鑒定ISSR法[13]中推薦的28條引物分別對供試菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增條帶的穩(wěn)定性和多態(tài)性篩選出適合用于ISSR分析的引物。從篩選出的適宜引物中挑選擴(kuò)增效果較好的引物作為ISSR分子標(biāo)記驗證優(yōu)良雜交菌株的引物。

1.6 優(yōu)良菌株的菌絲生長特征分析

取大小約0.5 cm×0.5 cm的親本和雜交株的菌絲塊，分別接種于3個PDA平板培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫箱中避光培養(yǎng)5 d；觀察親本和雜交株的菌落形態(tài)，并測量菌絲的生長速度，每個處理3次重復(fù)。

1.7 優(yōu)良菌株的綜合農(nóng)藝性狀分析

發(fā)菌期，觀察和記錄親本和雜交菌株的栽培袋菌絲生長情況。子實體生長期，拍照記錄不同生長時期的子實體形態(tài)特征。待菌蓋邊緣白色生長點消失，菌蓋背面開始彈射霧狀紅褐色孢子時，開始采收。采收后，親本和雜交菌株各取30個靈芝子實體，分別測量菌蓋長直徑、菌蓋厚度、菌柄長度；將子實體曬干，統(tǒng)計產(chǎn)量并計算生物學(xué)效率，生物學(xué)效率為子實體干重（g）與培養(yǎng)料干重（g）之比乘以100%，每個處理3次重復(fù)。

1.8 優(yōu)良菌株的有效成分含量檢測

各取10個曬干的靈芝子實體，分別檢測親本和雜交株子實體中多糖和三萜的含量[14-15]，每個處理3次重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本原生質(zhì)體的制備與再生

親本菌絲體通過溶壁酶降解除去細(xì)胞壁后，離心收集原生質(zhì)體，并在顯微鏡下分別拍照記錄原生質(zhì)體的形態(tài)，見圖1。

圖1 親本菌株TL-1及4895的原生質(zhì)體Fig.1 Protoplasts of parental strains TL-1 and 4895

2.2 單核菌株的篩選及交配型測定

通過鏡檢親本原生質(zhì)體再生菌落中鎖狀聯(lián)合的有無，可以篩選到2種交配型的單核菌株。篩選獲得TL-1單核菌株共21個，其中2種不同交配型單核體的比例為16∶5；篩選獲得4895單核菌株23個，其中僅獲得1種交配型單核體。

2.3 優(yōu)良雜交菌株的鑒定

對菌株進(jìn)行拮抗試驗，結(jié)果見圖2。

圖2 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的拮抗現(xiàn)象Fig.2 Antagonism of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

如圖2所示，雜交菌株TL-3與親本菌株TL-1、4895之間均存在明顯的拮抗現(xiàn)象，證明TL-3為真正的雜交株。

菌株TL-1、4895和TL-3的ISSR擴(kuò)增圖譜見圖3。

圖3 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.3 ISSR amplification map of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

如圖3所示，ISSR分子標(biāo)記驗證中，引物P4、P9對雜交株和親本菌株的擴(kuò)增效果較好，親本菌株與雜交株間的特異性條帶較明顯。雜交株TL-3擴(kuò)增條帶中同時包含了親本菌株TL-1和4895的特異性條帶，從而在分子水平上進(jìn)一步證明了TL-3雜交株的真實性。

2.4 優(yōu)良菌株的菌絲生長特性分析

對親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3進(jìn)行培養(yǎng)，其菌落形態(tài)見圖4，菌絲生長情況見表1。

由圖4和表1可知，雜交菌株TL-3菌絲潔白，呈絨毛狀，濃密，長勢強壯。TL-3平板培養(yǎng)的菌絲生長速度介于2個親本之間，為0.74 cm·d-1，快于親本菌株4895，慢于親本菌株TL-1，與2個親本菌株相比差異極顯著（P<0.01）。

表1 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的菌絲生長情況比較Tab.1 Comparison of mycelial growth between parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

圖4 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的菌落形態(tài)Fig.4 Mycelial morphology of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

2.5 優(yōu)良菌株的綜合農(nóng)藝性狀分析

統(tǒng)計親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的農(nóng)藝性狀，結(jié)果見表2。

由表2可知，TL-3栽培袋中菌絲的發(fā)菌速度為0.62 cm·d-1，介于2個親本之間；菌絲長勢強壯、濃密，發(fā)菌情況與雙親相比均無顯著性差異。菌蓋中等偏大，平均長直徑為10.33 cm，小于2個親本菌株，與親本TL-1之間有顯著性差異（P<0.05），與4895之間無顯著性差異。TL-3菌蓋厚度為2.79 cm，比雙親的菌蓋厚，與TL-1之間差異極顯著（P<0.01），與4895之間無顯著性差異。TL-3菌柄長度為2.06 cm，短于雙親，但無顯著性差異。TL-3平均單產(chǎn)和生物學(xué)效率比2個親本菌株高，與親本TL-1之間有顯著性差異（P<0.05），與4895之間無顯著性差異。

表2 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的農(nóng)藝性狀比較Tab.2 Comparison of agronomic characters between parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

對比親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3不同生長時期的子實體形態(tài)，結(jié)果見圖5（左側(cè)圖為正面，右側(cè)圖為背面）。

圖5 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3不同生長時期的子實體正反面形態(tài)Fig.5 Positive and negative morphology of fruit bodies of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3 at different growth stages

如圖5所示，TL-3子實體腎圓形，正面黃褐色到紅褐色，有光澤，表面有明顯的放射性縱脊和同心環(huán)紋，反面黃色，菌蓋邊緣較圓鈍；菌肉淡褐色；菌柄扁圓柱狀，光滑且亮，紅褐色至紫褐色。

2.6 優(yōu)良菌株的有效成分含量檢測

檢測親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3的多糖、三萜含量，結(jié)果見表3。

表3 親本菌株TL-1、4895及雜交株TL-3子實體有效成分含量比較Tab.3 Comparison of effective components in fruit bodies of parental strains TL-1,4895 and hybrid strain TL-3

由表3可知，雜交菌株TL-3子實體多糖含量為1.09%，均高于親本，比TL-1提高1.87%，比4895提高29.76%，與親本TL-1之間無顯著性差異，與親本4895之間有極顯著差異（P<0.01）。子實體三萜含量為0.22%，介于2個親本之間，比親本菌株TL-1提高37.5%，與2個親本之間均有極顯著性差異（P<0.01）。

2.7 優(yōu)良菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

將雜交株TL-3進(jìn)行連續(xù)3年的栽培試驗，并記錄每年的栽培農(nóng)藝性狀，統(tǒng)計結(jié)果見表4。

表4 雜交株TL-3的遺傳穩(wěn)定性分析Tab.4 Genetic stability analysis of hybrid strain TL-3

由表4可知，雜交株TL-3菌絲生長速度為0.60 cm·d-1～0.65 cm·d-1，平均單產(chǎn)為 40.5 g/袋～43.7 g/袋，生物學(xué)效率>6%，子實體中多糖和三萜的含量分別為1.07%～1.13%和0.21%～0.27%。每年的栽培農(nóng)藝性狀之間及與初代之間在平均生長速度、平均單產(chǎn)、生物學(xué)效率、子實體多糖及三萜含量等方面基本一致，說明雜交菌株TL-3遺傳穩(wěn)定性較好。

3 討論

親本TL-1為國家認(rèn)定品種，其綜合農(nóng)藝性狀較好，子實體多糖含量較高，但三萜含量較低；且TL-1作為主栽品種之一，經(jīng)過連續(xù)多年的栽培，菌種退化現(xiàn)象比較嚴(yán)重。親本4895子實體片厚且三萜含量較高，但產(chǎn)量低。經(jīng)原生質(zhì)體單核化雜交選育的新品種TL-3較好地遺傳了雙親的優(yōu)良性狀，其出芝整齊、片厚、產(chǎn)量高、子實體多糖和三萜含量均較高，綜合農(nóng)藝性狀和功能性指標(biāo)均優(yōu)于國家認(rèn)定品種TL-1，具有較高的推廣應(yīng)用價值。此外，新品種的選育還有效解決了菌種退化問題，為生產(chǎn)企業(yè)替換老化、退化的品種提供了備選種質(zhì)資源，進(jìn)一步滿足了市場需求。

通過分別提取親本和新品種的基因組DNA，利用ISSR法，從28條引物中篩選出2條擴(kuò)增效果較好的引物作為ISSR分子標(biāo)記驗證雜交菌株的引物。進(jìn)一步從分子水平上證明了新品種的真實性，為將來申報新品種權(quán)提供了依據(jù)。