張 浩，孫田昊澤，張 策，劉沐垚，張小芳，王超穎，田旭升

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

抑郁癥(depression)又稱抑郁障礙，以顯著而持久的心境低落、精力下降、勞累負(fù)荷重和活動(dòng)減少為主要臨床癥狀，其發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率高且多伴有自殺傾向，是一類嚴(yán)重的精神障礙性疾病。據(jù)報(bào)道，全球抑郁癥患者已達(dá)到3億5千萬[1]。該病發(fā)生發(fā)展與社會(huì)、心理因素和生物遺傳關(guān)系密切，致病機(jī)理有多種假說，臨床常用選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)與選擇性去甲腎上腺素再吸收抑制劑(selective noradrenalin reuptake inhibitors,SNRIs)進(jìn)行治療，療效尚可。目前抑郁癥的治療多采用西藥，但不良反應(yīng)較大[2]。近年來，中醫(yī)藥治療抑郁的效果與優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯，課題組選用酸棗仁湯治療虛煩不寐型抑郁癥，效果較好。酸棗仁湯出自《金匱要略》，用于治療“虛勞虛煩不得眠”，為養(yǎng)血安神、清熱除煩之經(jīng)典方劑[3]。

神經(jīng)可塑性假說認(rèn)為，情緒腦區(qū)神經(jīng)發(fā)生減少和/或神經(jīng)元退行性變的增加是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵[4]。臨床研究結(jié)果顯示，與正常人比較，抑郁癥患者的海馬體積顯著減少，且海馬神經(jīng)元出現(xiàn)壞死和萎縮[5，6]，故海馬神經(jīng)元再生障礙是抑郁癥發(fā)生的重要病理機(jī)制之一[7]。研究表明，重組人Dick-kopf相關(guān)蛋白-1(dickkopf-1,DKK-1)在一定條件下可以影響神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在腦組織尤其是海馬中呈高表達(dá)，參與神經(jīng)發(fā)生、突觸可塑性及穩(wěn)態(tài)的調(diào)控等過程[8]。本研究建立大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型(chronic unpredictable mild stress,CUMS)，通過觀察酸棗仁湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬組織DKK-1、β-catenin與GSK-3β的影響，探討其抗抑郁機(jī)制是否與神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。本研究通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2015121002)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)48只SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20) g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(黑)2014-0008。飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、自由攝食飲水、12 h明暗周期環(huán)境下適應(yīng)性循環(huán)。

1.2 藥物

酸棗仁湯組成：酸棗仁20 g，茯苓10 g，知母10 g，甘草5 g，川芎10 g，其劑量主要參考《金匱要略》，方中所需中藥飲片均購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥局，按照常規(guī)方法搗碎浸泡40 min后熬制2次，藥液合并過濾，具體換算方法參照參考文獻(xiàn)[9]。酸棗仁湯水煎劑人用劑量為55 g / (kg·d)，根據(jù)大鼠與人的體表面積換算法得到大鼠服用中劑量為55×0.018×5≈5 g /(kg·d)，此劑量屬于臨床等效劑量，即酸棗仁湯低、中、高劑量分別為2.5、5、10 g /kg，分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1 /2 、1、2 倍。氟西汀(法國禮來蘇州制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20080016，每片20 mg，成人用藥劑量20 mg～60 mg)的大鼠臨床等效藥量為0.04×0.018×5≈0.0036 g/(kg·d)。

1.3 主要試劑及儀器

DKK-1兔抗多克隆抗體(貨號(hào)AF2056)與二抗(貨號(hào)A0208)，由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；β-catenin、GSK-3β、β-actin引物均由上海碧云天生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

石蠟切片機(jī)(2136型，萊卡)；顯微攝影成像系統(tǒng)(moticam3000型，麥克奧迪)；熒光定量PCR儀(7500型，ABI)；高速低溫離心機(jī)(5810R型，Eppendorf)；自制曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(規(guī)格100 cm×100 cm×80 cm)。

1.4 分組及模型制備

將48只SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、酸棗仁湯低、中、高劑量組及氟西汀組各8只。實(shí)驗(yàn)過程中正常組大鼠不接受任何刺激，其余大鼠均單籠飼養(yǎng)，每天從以下7種造模方法中隨機(jī)選擇1種進(jìn)行造模。造模當(dāng)天(8∶00～20∶00)進(jìn)行12 h斷食，正常飲水；造模當(dāng)天(8∶00～20∶00)進(jìn)行12 h斷水，正常飲食；造模當(dāng)天(8∶00～20∶00)進(jìn)行12 h鼠籠45°傾斜；向鼠籠中的墊料噴水，保持潮濕狀態(tài)12 h后更換；造模當(dāng)天(19∶00至次日7∶00)持續(xù)日光燈照射12 h；將大鼠置于0 ℃冷水中，保持大鼠漂浮于水面5 min后撈出，吹風(fēng)機(jī)吹干身體；將大鼠放進(jìn)45 ℃烘箱內(nèi)烘烤10 min，造模共持續(xù)28 d。采用行為學(xué)(糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑郁模型評(píng)價(jià)。

1.5 給藥方法

空白組和模型組大鼠給予 0.9%氯化鈉溶液灌胃，酸棗仁湯低、中、高劑量組大鼠分別以相應(yīng)劑量中藥灌胃，氟西汀組給予0.0036 g /kg氟西汀混懸液灌胃，每日1次，共28 d。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 糖水消耗試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)的第0、28天分別進(jìn)行糖水消耗試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前在安靜房間內(nèi)訓(xùn)練大鼠適應(yīng)含糖飲水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶。第1個(gè)24 h 2瓶均裝入1%蔗糖水，第2個(gè)24 h 1瓶裝1%蔗糖水、1瓶裝純水，24 h禁食禁水后開始試驗(yàn)。同時(shí)給每只大鼠1瓶1%蔗糖水、1瓶純水，60 min后取出水瓶定量，并計(jì)算各組大鼠的總液體、糖水、純水消耗量及糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.6.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)于第28天進(jìn)行，于大鼠測(cè)量體質(zhì)量后檢測(cè)，其測(cè)試裝置為頂部固定有攝像頭的100 cm×100 cm×80 cm黑色敞箱，用白色油漆將底部平均分成25個(gè)等面積的正方形區(qū)域，遮蔽外界視野，降低周圍噪音。將大鼠自籠中取出稱量后置于清潔敞箱的中央空格，開始計(jì)時(shí)觀察其3 min內(nèi)的自由活動(dòng)。其測(cè)量方法為水平活動(dòng)得分以大鼠穿越底面1格(三爪或四爪進(jìn)入同一格)記1分，垂直活動(dòng)得分以直立次數(shù)1次(大鼠前雙足同時(shí)離開地面)記1分，每修飾1次記1分[10]。其中水平得分反映動(dòng)物的活動(dòng)度，垂直得分反映動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境探究度，自我修飾得分反映動(dòng)物對(duì)自身的關(guān)注度。每只大鼠監(jiān)測(cè)完畢后清理大鼠排泄物，移動(dòng)痕跡并消除氣味，減少其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

1.6.3 免疫組化法檢測(cè)DKK-1蛋白表達(dá) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取4只大鼠處死并快速取出海馬組織進(jìn)行石蠟切片，脫蠟進(jìn)行抗原修復(fù)、封閉，加DKK-1一抗(稀釋比為1∶100)，4 ℃冰箱保存過夜。PBS洗3次，每次5 min后加二抗，37 ℃溫箱30 min。PBS沖洗后加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC，稀釋比為1∶100)，顯色劑顯色、復(fù)染，脫水封片，顯微鏡下觀察。用Motic3000顯微攝影系統(tǒng)于200倍下攝片，選用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性表達(dá)結(jié)果進(jìn)行定量分析，IOD值代表蛋白相對(duì)表達(dá)量，IOD值=陽性面積×平均光密度。海馬CA3區(qū)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒即為DKK-1陽性細(xì)胞[11]。每張切片在光鏡下隨機(jī)分析4個(gè)高倍鏡視野，取其均值代表該片的相對(duì)表達(dá)量。

1.6.4 熒光定量 PCR檢測(cè)β-catenin及GSK-3β mRNA 表達(dá) 在GenBank上查詢到β-catenin及GSK-3β基因序列，利用Primer Premier 7.0軟件設(shè)計(jì)引物(引物序列見表1)。每組取余下的4只大鼠處死并快速取出海馬，加入裂解液制備組織勻漿，按20∶1的比例加入Trizol后提取總RNA。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用20 μL反應(yīng)體系，用β-actin作為內(nèi)參校正，按照Thermo說明書，在96孔板中依次加入Maxima SYBR Green qPCR Master 10 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 1 μL，Water 7 μL，每個(gè)樣本均設(shè)置3個(gè)副孔。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性，94 ℃，30 s；退火，延伸，60 ℃，30 s；共計(jì)40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 表2示，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，酸棗仁湯中、高劑量組及氟西汀組大鼠體質(zhì)量均明顯增長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

表2 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.1.2 各組大鼠糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 表2示，與正常組比較，模型組大鼠的總液體消耗量、糖水消耗量及糖水偏愛百分比均明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，酸棗仁湯中劑量組糖水偏愛百分比明顯增加(P<0.01)；酸棗仁湯高劑量組與氟西汀組總液體消耗、糖水消耗及糖水偏愛百分比均明顯增加(P<0.05,P<0.01)。

2.1.3 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 表2示，與空白組比較，模型組大鼠的水平得分、垂直得分和修飾得分均明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，酸棗仁湯各劑量組及氟西汀組水平得分均明顯增加(P<0.05,P<0.01)；酸棗仁湯高劑量組及氟西汀組垂直得分均明顯增加(P<0.01,P<0.05)。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

圖1表3示，空白組大鼠海馬CA3區(qū)中DKK-1蛋白陽性表達(dá)較少且呈淺棕黃色。與空白組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)中DKK-1蛋白陽性表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，酸棗仁湯各劑量組及氟西汀組大鼠海馬CA3區(qū)中DKK-1蛋白陽性表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。

圖1 各組大鼠海馬CA3區(qū)DKK-1蛋白表達(dá)變化(免疫組化染色，標(biāo)尺50 μm)

表3 各組大鼠海馬CA3區(qū)中DKK-1蛋白IOD值比較

2.3 熒光定量PCR法檢測(cè)海馬β-catenin及GSK-3β mRNA表達(dá)結(jié)果

表4示，與空白組比較，模型組大鼠海馬GSK-3β mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，酸棗仁湯高劑量組大鼠海馬β-catenin、GSK-3β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織β-catenin和GSK-3β比較

3 討論

結(jié)構(gòu)影像學(xué)和病理解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者會(huì)出現(xiàn)海馬體積萎縮等現(xiàn)象[12]。Wnt信號(hào)通路參與諸多細(xì)胞復(fù)雜的生化反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)。DKK-1、β-catenin及GSK-3β是該通路的3個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及遷移[13，14]。研究表明，DKK-1表達(dá)異常可影響特定通路、環(huán)路及相關(guān)信號(hào)蛋白與基因，臨床可出現(xiàn)異常神經(jīng)發(fā)育、障礙性認(rèn)知和異常情緒等神經(jīng)精神疾病。DKK-1可阻斷Wnt信號(hào)在胞內(nèi)的傳遞，若下調(diào)海馬中DKK-1水平，可修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞并減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗抑郁作用[15]。本研究結(jié)果顯示，酸棗仁湯可顯著降低海馬CA3區(qū)DKK-1蛋白表達(dá)水平，改善抑郁癥狀。

DKK-1可抑制細(xì)胞內(nèi)GSK-3β活性和下游β-catenin降解，通過降低β-catenin與GSK-3β表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，從而影響海馬神經(jīng)元的調(diào)控。β-catenin與GSK-3β在腦組織尤其是海馬呈高表達(dá)，并參與神經(jīng)發(fā)生、突觸可塑性及穩(wěn)態(tài)形成[8]，海馬腦區(qū)的β-catenin含量增加與快速產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)呈正相關(guān)[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酸棗仁湯高劑量提高了大鼠海馬組織β-catenin基因表達(dá)水平，可能通過影響海馬結(jié)構(gòu)及功能發(fā)揮抗抑郁作用。

若GSK-3β磷酸化水平降低，Wnt信號(hào)通路功能紊亂，最終可影響神經(jīng)元可塑性或?qū)е缕涞蛲鯷17]。動(dòng)物出現(xiàn)抑郁行為，酪氨酸磷酸化GSK-3β的增加與β-catenin水平的顯著降低呈負(fù)相關(guān)[18]，通過上調(diào)GSK-3β基因表達(dá)水平，可顯著改善抑郁癥狀[19]。實(shí)驗(yàn)顯示，高劑量酸棗仁湯可提高大鼠海馬組織β-catenin與GSK-3β基因表達(dá)水平，與上述研究結(jié)論一致。

酸棗仁湯在選藥上動(dòng)靜相配，酸棗仁養(yǎng)肝血、安心神為君藥；川芎調(diào)血養(yǎng)肝，茯苓寧心安神為臣藥；知母滋陰降火、清熱除煩為佐藥；甘草和中緩肝為使藥，治法上通補(bǔ)并用，有養(yǎng)血調(diào)肝、寧心安神、解熱除煩之效。中藥藥理學(xué)研究已證實(shí)，酸棗仁皂甙、知母總皂苷、茯苓多糖、甘草苷均具有抗抑郁和神經(jīng)元保護(hù)作用[20-22]。本研究通過觀察酸棗仁湯干預(yù)CUMS模型大鼠海馬中上述指標(biāo)變化，顯示出酸棗仁湯具有較好的抗抑郁作用，其作用機(jī)制可能與其對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用有關(guān)。