王婧吉，瞿 艷，王 娟，杜坤銳，陳 赟，朱國旗

(1.安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽省中醫(yī)藥科學院針灸臨床研究所，安徽 合肥 230061；3.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，安徽 合肥 230012)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是第二大常見性癡呆[1]，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)。據(jù)統(tǒng)計，北美與歐洲15%～20%癡呆患者是腦血管病變引起的，而亞洲該類癡呆患者占比30%[2]。VD是由腦血管病變引起，繼發(fā)神經(jīng)細胞功能與突觸功能的異常[3]。因此，晚期VD患者在腦功能、腦病理變化等方面與AD有較多的相似性[4]，均與海馬神經(jīng)細胞丟失和海馬突觸可塑性異常密切相關[5]。海馬突觸結構由突觸前膜、間隙和突觸后膜組成。突觸后膜上分布有α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy 5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR)、N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)以及突觸后致密蛋白95(postsynaptic density 95，PSD95)等蛋白，在維系突觸后膜結構和發(fā)揮功能過程中具有重要的作用[6]。因此，從突觸角度探討VD的發(fā)生機制及尋求干預措施具有重要意義。

“百會”“神庭”穴作為督脈腧穴，具有升陽補氣、填髓安神之功效，是針灸臨床中防治認知功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病常用選穴。多項研究[7-9]表明，電針“百會”“神庭”可顯著改善認知功能障礙患者的臨床癥狀，其作用機制可能與促進血管新生、改善系統(tǒng)性炎癥、調控學習記憶相關神經(jīng)肽物質等相關。然而，電針“百會”“神庭”是否能夠影響VD大鼠海馬突觸結構及具體的機制仍有待進一步探索。本研究選用改良型雙側頸動脈結扎模型[10]，進一步從突觸結構與突觸蛋白表達水平角度探討電針“百會”“神庭”對VD大鼠學習與記憶的作用及其機制，為電針治療VD提供實驗基礎。

1 材料

1.1 動物與分組 SPF級健康雄性SD大鼠35只(3月齡)，體質量(200±20)g，由安徽省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-0002。動物飼養(yǎng)在室溫20～25 ℃、相對濕度40%～75%的環(huán)境中。適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將其分為假手術組、模型組、電針非穴位組、電針穴位組和奧拉西坦組，每組7只。實驗手術中未出現(xiàn)大鼠死亡情況。行為學實驗結束后，動物經(jīng)過量戊巴比妥鈉注射安樂死，4只動物用于Western blot檢測，3只動物用于透射電子顯微鏡觀察實驗。實驗過程中對動物各項處理方法均按照《關于善待實驗動物的指導性意見》及動物倫理相關規(guī)定執(zhí)行。

1.2 主要試劑及儀器 奧拉西坦(批號 20030301)：中國湖南健朗藥業(yè)有限責任公司；β-actin抗體(批號 3700、1∶1 000)、GluA1抗體(批號 13185、1∶1 000)、GluN2B抗體(批號 14544、1∶1 000)、p-GluN2B(批號 4209、1∶1 000)：美國Cell Signaling Technology公司；SDZ-Ⅱ型電子針療儀：蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司；一次性不銹鋼針灸針(0.25 mm×25 mm)：蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司；電泳儀：美國Bio-Rad公司；165-8000型電泳槽：美國Bio-Rad公司；UC-7切片機：德國LEICA；7700型透射電子顯微鏡：日本HITACHI。

2 方法

2.1 改良型雙側頸動脈結扎模型及干預 模型組、電針非穴位組、電針穴位組和奧拉西坦組大鼠采用改良型雙側頸動脈結扎模型[10]：2%戊巴比妥鈉(2.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定于手術板上。頸部皮膚剃毛后用75%乙醇棉球進行常規(guī)無菌操作。沿頸部正中線切2 cm的切口，鈍性分離皮下組織，于肌肉間隙找到左頸總動脈，分離迷走神經(jīng)，用4-0手術線永久結扎后縫合皮下組織及皮膚。放回鼠籠休息并注意保溫，待完全蘇醒后轉移到鼠房飼養(yǎng)。1周后進行右側頸總動脈分離結扎，方法同前。假手術組大鼠也采用相同的手術操作，但不結扎雙側頸總動脈。

術后第2天，電針穴位組大鼠在2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后將其俯臥位固定在操作臺上，根據(jù)《實驗針灸學》[11]選取“百會”“神庭”，其中“百會”位于頂骨正中，“神庭”位于前正中線上，在額頂骨縫交界線前方處。穴位常規(guī)無菌操作后，選用一次性針灸針進行針刺治療，“百會”穴向后斜刺2 mm，“神庭”穴向上斜刺2 mm，針刺后選用SDZ-Ⅱ型電子針療儀，疏密波，強度0.5 mA，頻率1 Hz/20 Hz。每次電針干預30 min，每日1次，共治療14 d。電針非穴位組在取兩個固定非穴點(穴位旁開0.2寸)，電針干預30 min。假手術組和模型組大鼠分別給予相同時間、相同水平的抓握刺激，不進行電針干預。奧拉西坦組大鼠予以奧拉西坦鹽水溶液50 mg/kg腹腔注射，每日1次，共治療14 d。

2.2 檢測指標及方法

2.2.1 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮評估空間學習和記憶功能，水迷宮由一個直徑為1.6 m的黑色圓形水池組成，水溫控制在(25±2)℃。隱藏在水下的平臺(直徑為12 cm，高20 cm)位于第四象限的中心。使用連接到固定在水迷宮中心上方的視頻跟蹤系統(tǒng)獲取數(shù)據(jù)。定位巡航實驗為期4 d。每只大鼠從任意象限面向池壁被放入水中，讓其在60 s內(nèi)找到隱藏的平臺。如果大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺，則由實驗者引導至平臺并記錄逃離潛伏期為60 s?？臻g探索實驗在定位巡航結束后的第5天，用于測試大鼠穿越平臺的次數(shù)以及目標象限停留的時間。行為學試驗結束后，動物經(jīng)過量戊巴比妥鈉麻醉安樂死，并取海馬組織。

2.2.2 Western blot檢測海馬突觸相關蛋白水平 大鼠海馬組織加細胞裂解液，4 ℃冰上研磨，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清。1∶1加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱10 min，以充分變性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉膜，漂洗5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入PSD-95(1∶1 000)、GluA1(AMPA receptor subunit GluR1)(1∶1 000)、GluN2B(NMDA Receptor 2B)(1∶1 000)和磷酸化GluN2B(1∶500)抗體，緩慢搖動4 ℃孵育過夜。加入洗滌液TBST(10 min×3)。加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h。加入洗滌液TBST，10 min×3次。采用化學發(fā)光試劑顯影成像。使用Image J軟件對圖像進行分析，計算條帶的光密度值。

2.2.3 透射電子顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量 取新鮮海馬CA1區(qū)組織(1 mm×1 mm×1 mm)，置2.5%戊二醛液中固定6 h，將標本用0.1 mmol/L磷酸緩沖液洗3次后，鋨酸固定2 h，用上述緩沖液洗3次后，逐級梯度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧丙烷過渡；然后用環(huán)氧樹脂包埋，60 ℃烤箱聚合48 h，超薄切片機切片，厚度70 nm；醋酸鈾，硝酸鉛液染色，用透射電子顯微鏡觀察拍照。

3 結果

3.1 電針對改良型雙側頸動脈結扎模型大鼠學習和記憶功能的影響 水迷宮實驗分為學習和測試兩個時期。各組大鼠在1～4 d學習期，逃避潛伏時間顯著縮短，與假手術組比較，模型組大鼠第4天逃避潛伏時間顯著延長(P<0.05)；與模型組比較，電針穴位組和奧拉西坦組第4天逃避潛伏時間顯著縮短(P<0.05)。與假手術組比較，測試期模型組大鼠跨越平臺次數(shù)減少，目標象限停留時間顯著縮短(P<0.05)。與模型組比較，電針穴位組和奧拉西坦組大鼠跨越平臺次數(shù)增加，目標象限停留時間顯著延長(P<0.05)。電針非穴位組大鼠學習期逃避潛伏期與測試期跨越平臺次數(shù)和目標象限停留時間與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

3.2 電針對改良型雙側頸動脈結扎模型大鼠腦質量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦質量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，電針穴位組和奧拉西坦組大鼠腦質量顯著降低(P<0.05)，而電針非穴位組大鼠腦質量無顯著變化(P>0.05)；與奧拉西坦組比較，電針穴位組大鼠腦質量顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注:A.假手術組;B.模型組;C.電針非穴組;D.電針穴位組;E.奧拉西坦組;與假手術組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.3 電針對改良型雙側頸動脈結扎模型大鼠大腦海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量的影響 假手術組大鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量豐富，而模型組大鼠和電針非穴位組大鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量明顯下降；而電針穴位組大鼠海馬CA1區(qū)突觸密度增加。見圖3。

注：A.假手術組；B.模型組；C.電針非穴組；D.電針穴位組

3.4 電針對改良型雙側頸動脈結扎模型大鼠大腦海馬突觸蛋白PSD95、GluA1和GluN2B表達水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠海馬PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，電針穴位組PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)，電針非穴位組PSD95、GluA1、GluN2B和p-GluN2B蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

4 討論

VD屬于中醫(yī)“呆證”范疇，其病位在腦，病機為髓海不足、清竅閉阻、神機失用?！鞍贂睂俣矫}，位于巔頂，是督脈、手少陽三焦經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)、足少陽膽經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)的交會穴，能通達陰陽脈絡，連貫周身經(jīng)穴，可振復陽氣、疏通經(jīng)絡、調一身之陰陽之氣，故“百會”為治療精神情志類疾病的要穴。“神庭”也屬于督脈，為神志所在，其功在神，為督脈、陽明經(jīng)、足太陽交匯之穴?！夺樉募滓医?jīng)》：“神者，天部之氣也；庭者，庭院也。”現(xiàn)代臨床研究也表明，“百會”“神庭”穴是調節(jié)大腦功能的要穴，具有較為明顯的安神定志、調節(jié)情志、醒腦開竅的功效，可有效改善認知功能，是極具研究價值的穴組[8-9]。本研究選擇“百會”“神庭”二穴，并施以電針，評價電針對VD大鼠學習和記憶功能的影響。

注：A.假手術組；B.模型組；C.電針非穴組；D.電針穴位組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

改良型雙側頸動脈結扎模型是一種經(jīng)典的制作VD模型的方法，該模型廣泛應用于VD發(fā)病機制的研究和篩選相關的治療方法[12]。故本研究選擇改良型雙側頸動脈結扎大鼠模型評價電針“百會”“神庭”對VD大鼠學習和記憶的作用及探究其機制。本研究發(fā)現(xiàn)，改良型雙側頸動脈結扎能延長大鼠訓練期平臺逃避潛伏期，并縮短大鼠測試期平臺象限穿越次數(shù)和平臺象限停留時間。該結果提示，改良型雙側頸動脈結扎能造成大鼠空間學習和記憶功能的下降。本研究選擇奧拉西坦作為陽性對照藥[13]，結果表明，奧拉西坦能改善模型復制造成的學習和記憶能力的損傷，進一步證明該研究模型的成功。模型組大鼠經(jīng)電針“百會”“神庭”治療后，空間學習和記憶功能都得到顯著改善，而電針非穴組大鼠學習和記憶功能未能得到改善。值得注意的是，本研究選擇改良型雙側頸動脈結扎大鼠模型，雙側頸動脈的結扎間隔1周的時間，成功地避免了傳統(tǒng)雙側頸動脈結扎復制模型引起動物的高死亡率[10]。因此，該模型是一種較好的VD模型。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，雙側頸動脈結扎后，大鼠腦組織出現(xiàn)水腫等現(xiàn)象，且大腦的質量顯著增加，這和以往研究結果[14]相一致。電針“百會”“神庭”能阻止雙側頸動脈結扎造成的大鼠腦質量的增加，而電針非穴組則不具備這種功效。此外，與奧拉西坦組比較，電針“百會”“神庭”也展示了更優(yōu)的效果，該結果也提示電針和奧拉西坦發(fā)揮改善VD學習和記憶功能的機制不完全相同。據(jù)文獻報道，奧拉西坦主要促進磷酰膽堿和磷酰乙醇胺合成，提高大腦中ATP與ADP的比值，使大腦中蛋白質和核酸的合成增加，從而改善AD和記憶障礙患者的記憶和學習功能[15]。而電針可通過多種機制改善學習和記憶功能，如抗炎、抗氧化和阻止細胞凋亡等[16]。

海馬是大腦內(nèi)重要的腦區(qū)，與學習記憶功能密切相關[17-18]，雙側頸動脈結扎能導致海馬結構的萎縮及功能的減弱。神經(jīng)細胞間的信息傳遞主要通過突觸來完成，而突觸的損傷意味著神經(jīng)細胞間信息傳遞的異常。突觸損傷發(fā)生在VD發(fā)病的晚期，且與認知功能障礙密切相關[5]。對VD發(fā)病中突觸可塑性的研究有利于進一步闡明其發(fā)病機制。本研究重點觀察海馬CA1突觸的結構以及突觸相關蛋白的表達水平，來探究電針“百會”“神庭”對海馬突觸結構的影響。透射電子顯微鏡結果顯示，模型組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結構的數(shù)量顯著減少，電針“百會”“神庭”能逆轉改良型雙側頸動脈結扎模型造成的突觸損傷，而電針非穴不具備逆轉雙側頸動脈結扎造成的突觸損傷的功效。該結果表明，電針“百會”“神庭”對雙側頸動脈結扎造成的突觸結構損傷確有改善效應，同時也說明穴位的特異性作用。

為進一步研究電針“百會”“神庭”對改良型雙側頸動脈結扎模型大鼠海馬突觸損傷修復的機制，本研究選擇性檢測了突觸后膜蛋白PSD-95及突觸受體蛋白的表達水平。突觸后致密物是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜的特殊結構，是突觸后信號轉導和整合的關鍵物質。根據(jù)分子質量不同，可將其分為PSD-95和PSD-93。海馬CA1區(qū)突觸后膜廣泛分布PSD-95。因此，通過檢測PSD-95的表達水平可進一步確證突觸結構的變化。Western blot檢測結果表明，模型組大鼠海馬PSD-95表達水平顯著下降，電針“百會”“神庭”能顯著提升PSD-95表達水平，而電針非穴位未能提升該蛋白的表達水平，該結果進一步驗證電針“百會”“神庭”對改良型雙側頸動脈結扎模型造成的突觸損傷具有改善作用。

突觸后膜主要的膜受體包括AMPAR和NMDAR，而GluA1是AMPAR的主要亞型，負責海馬突觸的基礎傳遞[19]。NMDAR由NR1、N2A和N2B亞基構成，參與突觸可塑性的調控。本研究中，筆者檢測了GluA1的表達水平，結果顯示模型組大鼠海馬GluA1的表達水平顯著下降，而電針能改善改良型雙側頸動脈結扎造成的GluA1下降。此外，筆者檢測了各組大鼠海馬GluN2B和磷酸化GluN2B的表達水平變化。磷酸化GluN2B是一種活化的GluN2B，參與NMDAR對Ca2+的調控[20]。因此，磷酸化GluN2B是NMDAR活性的亞基。模型組大鼠海馬GluN2B和磷酸化GluN2B的表達水平均下降，而電針“百會”“神庭”促進GluN2B的表達及GluN2B的磷酸化。該結果也提示改良型雙側頸動脈結扎模型動物海馬突觸可塑性的損傷及電針“百會”“神庭”對其的逆轉作用。

總之，電針“百會”“神庭”可能通過調節(jié)突觸結構改善VD大鼠學習記憶功能，其分子機制可能與增加突觸蛋白PSD95、GluA1和GluN2B的表達水平有關。海馬長時程增強(long-term potentiation，LTP)是學習記憶重要的模型，而LTP的誘導和維持與AMPAR和NMDAR的功能密切相關[21]，本研究未能用電生理的方法來評價改良型雙側頸動脈結扎模型和電針對LTP誘導的影響，后期課題組將進一步展開該方面的研究。此外，Arc等蛋白參與LTP的維持，后期研究應該更多聚焦NMDAR的下游信號通路的變化，進一步闡明電針“百會”“神庭”的作用機制。