崔雨晴，米卓爾，劉傲雪，周丹丹，沙禕煒

[鑒甄檢測技術(shù)(上海)有限公司，上海 200131]

胃復(fù)春片是由紅參、香茶菜、麩炒枳殼3味藥制成的復(fù)方制劑，是國家中藥保護(hù)品種，臨床用于慢性萎縮性胃炎、胃癌前病變、慢性淺表性胃炎、胃及十二指腸潰瘍等，具有療效好、安全性高等特點(diǎn)。研究[1-4]表明，人參皂苷及其代謝產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤作用，尤其是人參經(jīng)蒸制成紅參后，轉(zhuǎn)化的新成分能夠加強(qiáng)抗腫瘤效果；香茶菜中二萜類、酚酸類、黃酮類成分，具有抑菌消炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用；枳殼中黃酮類成分，具有抗腫瘤、抗微生物、抗炎等作用。上述化學(xué)成分構(gòu)成胃復(fù)春片的復(fù)雜體系，共同發(fā)揮健脾益氣、活血解毒之功效。2020年版《中華人民共和國藥典》以紅參對照藥材、人參皂苷Rb1、Re、Rg1對照品作為參照，對制劑中紅參進(jìn)行薄層鑒別。含量測定項(xiàng)僅對麩炒枳殼中柚皮苷進(jìn)行含量測定。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對制劑中的香茶菜未作任何質(zhì)量控制，故無法有效控制胃復(fù)春片的質(zhì)量。本研究采用超高效液相色譜(ultra high performance liquid chromatography，UPLC)串聯(lián)單四極桿質(zhì)譜(quadrupole dalton，QDA)法測定胃復(fù)春片中橙皮苷，新橙皮苷，迷迭香酸，人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1成分的含量，以期為胃復(fù)春片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class-QDA超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：沃特世科技有限公司；XSE105DU電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；MS204TS/02電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；P120H超聲儀：德國Elma Schmidbauer GmbH；Elix Advantage 15超純水制備儀：默克密理博。

1.2 試藥 新橙皮苷(純度97.8%，批號 8177)：購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；橙皮苷(純度95.3%，批號 110721-202019)、迷迭香酸(純度90.5%，批號 111871-201706)、人參皂苷Re(純度93.9%，批號 110754-202028)、人參皂苷Rg1(純度93.4%，批號 110703-201933)、人參皂苷Rf(純度99.3%，批號 111719-201806)、人參皂苷Rb1(純度93.1%，批號 110704-202028)：購自中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈：默克公司；色譜純甲醇：默克公司；質(zhì)譜純甲酸：賽默飛世爾科技有限公司；分析純甲醇：上海泰坦科技有限公司。14批胃復(fù)春片、缺紅參陰性制劑、缺麩炒枳殼陰性制劑和缺香茶菜陰性制劑均由杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1對照品適量，加甲醇制成每毫升含橙皮苷6 μg、新橙皮苷80 μg、迷迭香酸8 μg、人參皂苷Re 8 μg、人參皂苷Rg16 μg、人參皂苷Rf 3 μg、人參皂苷Rb115 μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品研細(xì)，精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率330 W，頻率37 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。同法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Waters X-select HSS T3(3.0 mm×150 mm，2.5 μm)；流速：0.5 mL/min；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫程序如下：0～4 min，25%～26% A；4～5 min，26%～34% A；5～8 min，34%～35% A；8～10 min，35%～50% A；10～12 min，50%～95% A；12～13 min，95%～25% A；13～16 min，25% A。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；采用電噴霧離子源(ESI源)，負(fù)離子檢測，選擇性離子監(jiān)測模式(SIR)，毛細(xì)管電壓為0.8 kV，離子源溫度為600 ℃，以m/z609.13(橙皮苷、新橙皮苷，錐孔電壓20 V)、m/z359.15(迷迭香酸，錐孔電壓15 V)、m/z991.47(人參皂苷Re，錐孔電壓15 V)、m/z845.49(人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf，錐孔電壓15V)、m/z1 107.60(人參皂苷Rb1，錐孔電壓40 V)為測定離子。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 分別精密吸取空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各1 μL，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。各通道內(nèi)樣品色譜圖中出現(xiàn)與對照品色譜圖中保留時(shí)間一致的色譜峰。色譜圖見圖1。

注:1.橙皮苷;2.新橙皮苷;3.迷迭香酸;4.人參皂苷Re;5.人參皂苷Rg1;6.人參皂苷Rf;7.人參皂苷Rb1;混合對照品溶液(A、B、C、D、E)、供試品溶液(F、G、H、I、J)圖1 對照品與供試品的高效液相色譜圖

2.3.2 線性方程、檢測限和定量限 取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1的混合對照品溶液，用甲醇稀釋配制為7個(gè)不同濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣分析。以對照品的峰面積(y)對相應(yīng)的濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍；以各化合物的信噪比(S/N)等于3時(shí)相對應(yīng)的濃度確定為最低檢測限(limit of detection，LOD)，以各化合物的信噪比(S/N)等于10時(shí)相對應(yīng)的濃度確定為最低定量限(limit of quantity，LOQ)。見表1。

表1 胃復(fù)春片中7個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和LOD、LQD

2.3.3 精密度 取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為1.0%、0.5%、2.2%、0.8%、0.8%、2.2%、2.1%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性 按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液(樣品批號：19066119)，測定橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1的峰面積，計(jì)算含量。6份樣品中橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1含量的RSD值分別為0.6%、0.5%、2.2%、1.1%、1.0%、1.2%、0.8%，表明樣品重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性 同一供試品溶液在室溫條件下放置0、2、4、8、12、24 h后，進(jìn)樣測定。樣品中橙皮苷，新橙皮苷，迷迭香酸，人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1含量RSD值分別為2.1%、1.5%、1.4%、2.1%、2.5%、2.0%、3.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的胃復(fù)春片0.25 g，精密加入一定量的混合對照品溶液，使其加入量與所取胃復(fù)春片中各指標(biāo)成分量之比控制在1∶1左右。按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算橙皮苷，新橙皮苷，迷迭香酸，人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1平均回收率依次為89.3%、99.9%、101.2%、94.4%、91.8%、90.4%、94.2%，RSD分別為1.5%、1.3%、2.1%、3.1%、3.5%、3.1%、2.8%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.7 耐用性考察 采用不同流速(0.4、0.5、0.6 mL/min)；不同柱溫(28、30、32 ℃)；不同色譜柱Waters X-select HSS T3(3.0 mm×150 mm，2.5 μm)、Agilent Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)和Waters CORTECS?T3(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)測定同一批次樣品成分含量，各成分含量RSD值均小于5%，方法耐用性良好。

2.3.8 樣品含量測定 取14批胃復(fù)春片樣品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果14批胃復(fù)春片樣品每片含橙皮苷(0.19±0.02)mg、新橙皮苷(2.78±0.16)mg、迷迭香酸(0.48±0.21)mg、人參皂苷Re (0.23±0.02)mg、人參皂苷Rg1(0.18±0.01)mg、人參皂苷Rf(0.08±0.01)mg、人參皂苷Rb1(0.47±0.06)mg。

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇 胃復(fù)春片物質(zhì)基礎(chǔ)研究[5]表明，枳殼中主要含柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黃酮類成分，其中柚皮苷含量最高，2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中僅測定柚皮苷的含量，為了更全面反映制劑中枳殼質(zhì)量，選取橙皮苷、新橙皮苷為測定指標(biāo)。紅參為生粉入藥，人參皂苷類成分具有較弱的紫外吸收，且在制劑中的含量較低，傳統(tǒng)的紫外檢測器的靈敏度較差。2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中僅以人參皂苷的定性鑒別難以真實(shí)反映其質(zhì)量，故選取人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1為定量測定指標(biāo)。香茶菜并未被2020年版《中華人民共和國藥典》收載，其在處方中用量最大。本研究選擇酚酸類迷迭香酸作為指標(biāo)性成分對其進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2 檢測方法的選擇 中藥復(fù)方的化學(xué)成分較復(fù)雜，采用高效液相色譜分析時(shí)間較長。王桂峰等[6]建立高效液相色譜法同時(shí)測定胃復(fù)春片中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、柚皮苷、新橙皮苷，檢測時(shí)間為60 min。張紅霞等[7]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定胃復(fù)春片中的11種成分(柚皮苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd、人參皂苷20(R)-Rg3、冬凌草甲素、表諾多星醇)的含量。由于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法儀器的價(jià)格高昂，維護(hù)成本高，普及程度低等特點(diǎn)，無法滿足中藥企業(yè)日常的樣品檢驗(yàn)需求，方法的實(shí)際應(yīng)用性不高。QDA檢測器是一種質(zhì)譜檢測器，能夠與液相分離系統(tǒng)完美兼容，對紫外檢測器或二極管陣列檢測器進(jìn)行有效的補(bǔ)充。QDA檢測器可以獲得相當(dāng)于單四極桿質(zhì)譜儀的質(zhì)譜信息，其價(jià)格相對較低，操作簡單，維護(hù)保養(yǎng)方便，在藥品分析領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多[8-9]。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 錐孔電壓是影響QDA檢測器相應(yīng)信號強(qiáng)弱的關(guān)鍵參數(shù)，在參數(shù)可調(diào)的范圍內(nèi)，以樣品中所含各成分色譜峰的峰面積為考核指標(biāo)對其進(jìn)行優(yōu)化。通過加酸來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，促進(jìn)化合物的離子化，改善峰形。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.02%甲酸、乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.05%甲酸(含2 mmol/L甲酸銨)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.05%甲酸的響應(yīng)值比較穩(wěn)定，且峰形對稱。同時(shí)，分別考察了提取溶劑、提取時(shí)間、料液比對成分提取的影響，優(yōu)選的供試品制備方法為50%甲醇為溶劑，料液比為1∶100，超聲時(shí)間30 min。

3.4 樣品的測定 采用UPLC-QDA法對14批胃復(fù)春片中的黃酮類、酚酸類、人參皂苷類成分進(jìn)行測定。結(jié)果表明，不同批次間胃復(fù)春片的黃酮類和人參皂苷類成分含量相差不大，而香茶菜中迷迭香酸含量范圍為每片0.27～1.05 mg(RSD=43.7%)，表明投料用藥材質(zhì)量差異較大。本研究建立的UPLC-QDA法同時(shí)測定7個(gè)指標(biāo)成分含量，可全面反映復(fù)方中麩炒枳殼、香茶菜、紅參藥材的質(zhì)量，能夠有效地監(jiān)控產(chǎn)品的穩(wěn)定性，為其質(zhì)量提供保障。