劉秀繼 鄒 群 覃先武 鄧張雙

(1.中國輕工業(yè)功能酵母重點實驗室(三峽大學生物與制藥學院)，湖北 宜昌 443002;2.安琪酵母股份有限公司研究院，湖北 宜昌 443003)

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸縮合而形成的三肽，在自然界中以還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)兩種形式存在，其中氧化型谷胱甘肽由還原型谷胱甘肽通過巰基縮合生成二巰鍵形成.GSH是一種重要的細胞調(diào)節(jié)代謝物質(zhì)、藥物試劑和功能性添加劑，在醫(yī)藥、食品、化妝品、動物營養(yǎng)等領(lǐng)域廣泛應用，市場前景廣闊.GSH來源于富含生物體的提取[1-2]、化學合成[3]、生物酶法合成[4]和微生物發(fā)酵[5]，其中酵母細胞發(fā)酵生產(chǎn)GSH被廣泛應用于工業(yè)制備.日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社(KYOWA)基本壟斷GSH全球市場并形成生產(chǎn)技術(shù)壁壘，國內(nèi)部分生物發(fā)酵企業(yè)通過引進國外專利技術(shù)，已實現(xiàn)國內(nèi)生產(chǎn)和市場銷售，但產(chǎn)量和利潤多受限于富含GSH酵母發(fā)酵技術(shù)、發(fā)酵(原材料)成本和技術(shù)轉(zhuǎn)讓成本.

本文以CNKI和CNIPA為數(shù)據(jù)源，采用篇名和發(fā)明名稱為檢索條件，以“谷胱甘肽”為檢索詞，檢索日期為1990—2020年，分別檢索學術(shù)期刊和中國發(fā)明專利，共檢索到5627條文獻和1122項專利.圍繞“微生物菌種選育、發(fā)酵調(diào)控、純化方法”等研究領(lǐng)域作進一步篩選，最終篩選出樣本文獻和專利共計170篇，并作歸納總結(jié)，旨在幫助相關(guān)研究人員快速了解微生物生產(chǎn)谷胱甘肽進展以及探索新的研究領(lǐng)域.

1 生產(chǎn)谷胱甘肽的微生物菌種選育[6-51]

見表1，生產(chǎn)谷胱甘肽的微生物菌種主要包括:藤 黃 八 疊 球 菌(Sarcineluted)、南 極 衣 藻(Chlamydomonassp.)、南極硅藻(Berkeleyaruti lans)、南極綠藻(Chlorophyceae)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactisssp.)、釀酒酵母(Saccharomycescere-visiae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonassp.)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce Spombe，S.promb)、Candidacarpophila以及轉(zhuǎn)入GSH生物合成酶基因的工程菌，現(xiàn)有報道生產(chǎn)菌種多為釀酒酵母菌和以酵母或大腸桿菌為載體的基因工程菌.

表1 生產(chǎn)谷胱甘肽微生物菌種選育

續(xù)表1 生產(chǎn)谷胱甘肽微生物菌種選育

續(xù)表1 生產(chǎn)谷胱甘肽微生物菌種選育

在菌種選育方面，野生型菌株多來源于土壤與水體微生物、植物與昆蟲共生菌、極地冰藻等.誘變方式多采用紫外誘變、化學誘變、等離子體誘變、激光誘變、γ射線誘變、航天育種、原生質(zhì)體融合等單一或者聯(lián)合多種方法處理，同時結(jié)合氯化鋅、鎘鹽和乙硫氨酸等抗性篩選，獲得高產(chǎn)GSH的突變株.通過選育，未優(yōu)化培養(yǎng)條件，GSH產(chǎn)量最高可達到約900 mg/L;工程菌高度表達GSH合成酶，最高產(chǎn)量可達到約10 g/L.

2 生產(chǎn)谷胱甘肽的微生物發(fā)酵調(diào)控[52-109]

見表2，過去30年主要圍繞釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)開展發(fā)酵調(diào)控研究，包括:培養(yǎng)基優(yōu)化(碳氮源、p H、金屬離子等)、GSH合成前體氨基酸(L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸)的添加、流加與分批補料(如以控制比生長速率為目的的補糖策略)、代謝通量分析和代謝途徑干預(3-磷酸甘油酸和A-酮戊二酸節(jié)點)、乙醇代謝反饋調(diào)控、外源刺激(如H2O2、Na2SO3、低p H等)脅迫調(diào)控、DO-srat組合反饋流加控制以及多菌(釀酒酵母與乳酸桿菌Lactobacilluscasei)共培養(yǎng)模式.其中較為高效的調(diào)控策略為:前體L-半胱氨酸分批補加策略、控制乙醇濃度的流加補糖策略、DO-srat反饋流加高密度發(fā)酵策略、低p H脅迫等，酵母細胞生產(chǎn)GSH能力得到大幅度提升.相較而言，轉(zhuǎn)入GSH合成酶基因的大腸桿菌作為GSH生產(chǎn)菌，具備高產(chǎn)、穩(wěn)定和副產(chǎn)物少等代謝調(diào)控優(yōu)勢.

表2 生產(chǎn)谷胱甘肽微生物發(fā)酵調(diào)控

續(xù)表2 生產(chǎn)谷胱甘肽微生物發(fā)酵調(diào)控

續(xù)表2 生產(chǎn)谷胱甘肽微生物發(fā)酵調(diào)控

續(xù)表2 生產(chǎn)谷胱甘肽微生物發(fā)酵調(diào)控

3 酵母中谷胱甘肽的純化方法

3.1 提取方法[110-126]

見表3，目前從酵母細胞中提取GSH的方法包括:溶劑提取法，所用溶劑有乙酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、三氟乙酸、甲酸、乙醇等有機溶劑;熱水抽提法，抽提時通過加入鹽酸、醋酸等調(diào)節(jié)p H，提高GSH提取率和減少氧化反應發(fā)生，在此方法上進行改良的高壓蒸汽法也多見報到;高壓均質(zhì)法，通過破壞酵母細胞壁，加速GSH溶出，一般配合低溫操作;微波提取法和超聲波破碎法，多見于理論研究;此外還有聯(lián)用上述多種方法的組合法.

表3 酵母細胞中谷胱甘肽的提取

GSH分子量小且水中溶解度高，可以在不需要完全破碎細胞壁的情況下高效溶出.相比溶劑法和高壓均質(zhì)法，熱水抽提法可以大大降低樣品中大分子肽的含量，在后續(xù)柱層析中有效減少提取液中參與GSH競爭的大分子，同時降低膜過濾等設(shè)備使用損耗.因此，熱水抽提法GSH提取率高，超過90%，且GSH氧化少;加上熱水抽提法效率高、耗時少，經(jīng)濟、無污染，是從酵母中提取GSH的首選方法.

3.2 離子交換樹脂純化法[127-156]

提取的GSH溶液含有大量小分子氨基酸和肽類成分，性質(zhì)與GSH相似，需作進一步分離純化，目前常用的純化方式為樹脂法.針對復雜樣品，提取液中大分子蛋白與GSH競爭吸附，在上柱之前宜采用超濾膜處理去除.

文獻[157]報道，GSH等電點2.83.在低p H值(p H 1～2)下，GSH主要以GSH+形式存在;在等電點附近(p H 3)，主要以GSH±形式存在;在高p H值(p H 7)下，全部以GSH-形式存在，易氧化生成GSSG.因此，GSH分離需在p H＜3的酸性條件下進行.首選陽離子交換樹脂分離純化GSH，而弱酸性陽離子交換樹脂工作p H為5以上，因此優(yōu)選強酸型陽離子交換樹脂.見表4，目前用于GSH分離純化研究的陽離子交換樹脂絕大多數(shù)為強酸型，包括D001，D001×7，001×7，005×7，732，D061，Amberlite IR120，D301和HD-8等，上述樹脂工作p H宜為2～3，過低p H值，可能引起 H+與GSH+發(fā)生競爭吸附.針對酵母發(fā)酵液上樣，上述樹脂的GSH回收率范圍為60%～70%.且上述樹脂中研究最多的為D001，因其為大孔型強酸性陽離子交換樹脂，除吸附性能，還兼具分子篩功能，對溶液中大分子量的物質(zhì)(如GSH降解產(chǎn)生的多聚分子和色素)具有過濾除雜和脫色效果.陽離子樹脂吸附GSH后常用的洗脫液為1%～3%的NaCl溶液，操作中一般采用串聯(lián)諸如SP207的大孔樹脂進行脫鹽.有文獻報道，針對高濃度谷胱甘肽溶液的處理，亦可單獨使用SP207進行脫鹽除雜操作，再進入濃縮結(jié)晶工藝.

表4 樹脂在制備谷胱甘肽中的應用

續(xù)表4 樹脂在制備谷胱甘肽中的應用

續(xù)表4 樹脂在制備谷胱甘肽中的應用

相對陽離子樹脂而言，陰離子交換樹脂用得較少，分離過程中使用陰離子交換樹脂更多是使用其他功能，如脫鹽.仍需注意的是，陰離子交換樹脂在篩選過程中注重在2.0～4.5的工作p H范圍內(nèi)篩選.

近年來，借助與GSH的巰基發(fā)生化學反應，還開發(fā)了一些特異性提純的螯合樹脂，如D840、殼聚糖-銅螯合樹脂、汞樹脂和硫樹脂，正因為與GSH特異性結(jié)合，所以可以直接用于提取液的處理，且GSH回收率高.但這類樹脂僅限于實驗室研究，未見推廣應用.

3.3 其他純化方法

除了交換樹脂法，研究人員還開發(fā)了其他GSH純化方法，如反膠束萃取法[158]、電解法[159]、磁性納米材料吸附層析法[160]、殼聚糖吸附層析法[161]，部分方法具有發(fā)展?jié)摿Γ珉p水相萃取法[162]，具有提取率高的特點，但是目前還處于實驗室研究階段，未見推廣應用.

傳統(tǒng)的酵母制備GSH為銅鹽法和樹脂法結(jié)合分離純化[163]，GSH中的胱氨酸上的巰基與Cu2+形成絡(luò)合物從溶液中沉淀下來，達到富集目的，然后經(jīng)解絡(luò)合和樹脂分離達到純化目的.除了銅離子以外，其他過渡金屬離子(Zn2+、Cd2+)也能與GSH發(fā)生絡(luò)合反應[164]，但絡(luò)合效率低.

3.4 檢測方法

目前用于GSH檢測的方法主要包括:熒光分光光度法[165]、毛細管電泳法[166]、電化學法[167]、高效液相色譜法[168]和DTNB法[169].其中DTNB與巰基的反應作為一種巰基蛋白(肽)含量測定方法被廣泛應用，但應用該方法測定谷胱甘肽含量時易受測定溶液中其他游離巰基蛋白質(zhì)、肽或者氨基酸的干擾，同時測定對象中的色蛋白存在也影響方法靈敏性.高效液相色譜法(HPLC)是一種快速、高效、高靈敏度的有機成分檢測方法.針對以往HPLC法測定谷胱甘肽存在保留時間過短、易干擾等問題，研究人員探索了緩沖鹽體系p H值對谷胱甘肽保留時間的影響，通過調(diào)節(jié)流動相p H值和二元相配比的方法，優(yōu)化了酵母細胞中GSH和GSSG色譜檢測方法，建立了一種改良的酵母細胞中谷胱甘肽高效液相色譜分析方法[170]，該方法被納入《GB/T 35882—2018富營養(yǎng)素酵母》國家標準.

4 谷胱甘肽產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及展望

據(jù)不完全統(tǒng)計，GSH的全球銷售量超過300噸/年，市場價值超過50億元人民幣，過去10年復合年增長率超過8%.近年來GSH市場增長率有所放緩，預計到2025年全球市場價值將超過55億元人民幣.美國、歐洲、中國和日本是主要的消費國家和地區(qū)，總消費量占全球90%以上.中國作為最大的消費國，消費市場占全球35%以上.

目前，GSH全球產(chǎn)能主要集中在日本和中國，包括日本協(xié)和發(fā)酵株式會社和中國山東金城醫(yī)藥.市售的GSH生產(chǎn)多采用酵母發(fā)酵提取法，日本協(xié)和最先開展微生物工業(yè)制備GSH，始于20世紀90年代，以低廉的發(fā)酵成本(上游原料糖蜜獲取、高密度發(fā)酵技術(shù))、高產(chǎn)菌種和高效提取技術(shù)形成了技術(shù)壁壘，而化學合成制備GSH成本高昂，生物合成法(或工程菌)制備GSH面臨生物安全問題，上述種種原因致使我國企業(yè)很難通過降低成本和革新技術(shù)參與國際市場競爭.因此，我國生產(chǎn)企業(yè)和研究人員需要在豐富GSH產(chǎn)業(yè)鏈上的產(chǎn)品類型(加大產(chǎn)業(yè)鏈上副產(chǎn)物如GSSG、丁二酸、麥角甾醇等的二次開發(fā))，以及降低生產(chǎn)成本(開發(fā)糖蜜來源、提高發(fā)酵技術(shù)和節(jié)能減排)上提升競爭力.

雖然當前GSH全球需求容量偏小(50億人民幣)且GSH原料藥可能存在產(chǎn)能過剩和價格走低等問題，但是GSH能廣泛應用于保健品(護肝)、醫(yī)藥(護眼)、化妝品(排毒美白)和食品(抗氧化和提高免疫力)等行業(yè)，涵蓋的終端消費規(guī)模超過百億元.此外，國內(nèi)市場則剛起步，如國產(chǎn)品牌花青肽美系列、谷胱甘肽面膜肽谷幽蘭、谷胱甘肽茶多酚片、甘酵亮等，并且谷胱甘肽的應用未來還可能拓展到生物肥和飼料添加劑領(lǐng)域，包括提高動物生長性能、繁育能力以及促進植物光合作用，起到增產(chǎn)和提高品質(zhì)等作用，谷胱甘肽產(chǎn)業(yè)必將迎來更加廣闊的市場前景.

5 小 結(jié)

1)酵母發(fā)酵法工業(yè)化制備GSH是全球主要生產(chǎn)工藝，未來進一步圍繞菌種選育，如擴大菌種篩選來源、創(chuàng)新育種方法和提高育種效率;在代謝調(diào)控與高密度發(fā)酵技術(shù)(如生長分化調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)、生物合成調(diào)節(jié)、發(fā)酵過程控制)和節(jié)能減排等領(lǐng)域加強研發(fā)投入，降低生產(chǎn)成本，提高市場競爭力.

2)GSH在純化過程中易氧化變質(zhì)，進一步圍繞高效分離介質(zhì)(特別是特異性結(jié)合樹脂)和創(chuàng)新抗氧化劑(或GSSG還原劑)篩選與發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域進行深度研究.

3)圍繞GSH產(chǎn)業(yè)鏈構(gòu)建串聯(lián)產(chǎn)品開發(fā)網(wǎng)絡(luò)，形成“GSH+”的系列產(chǎn)品鏈;進一步拓展GSH在保健品、化妝品、生物肥料和動物飼料領(lǐng)域中的應用.