胡秉芬，李廣宇*，孟亞雄，劉 薈，陳翠蓮，馬 瑋，張廣忠，張正振

(1.甘肅省林業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070 ；3.平川區(qū)林業(yè)局，甘肅 白銀 730900)

棗(Ziziphusjujuba)是原產(chǎn)我國的特有果樹，栽培歷史悠久，約有 900 多個品種[1-3]。甘肅是棗的原產(chǎn)地之一，棗資源豐富。在長期的栽培與馴化過程中，產(chǎn)生了許多變異類型，近年頻繁引種，導(dǎo)致甘肅黃河沿岸棗區(qū)品種存在來源混淆、同物異名和同名異物的現(xiàn)象，品種間的遺傳關(guān)系混亂，阻礙了實踐生產(chǎn)和品種培育。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定費時費力，易受外界環(huán)境因素的影響，且難以區(qū)分性狀相似的品種。SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記在國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)的BMT分子測試指南中被確定為構(gòu)建 DNA 指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記方法[4]，具有多態(tài)性高、易檢測、重復(fù)性高、數(shù)量豐富、共顯性等優(yōu)點，非常適用于品種遺傳多樣性和親緣關(guān)系的鑒定，已廣泛應(yīng)用于蘋果、梨、桃、柑桔等各種經(jīng)濟樹種的種質(zhì)資源鑒定[5-6]、親緣關(guān)系分析[7-8]、遺傳多樣性分析[9-11]、遺傳圖譜構(gòu)建[12]、基因定位[12-13]和分子標(biāo)記輔助育種[14]等方面。在棗樹研究方面，北京林業(yè)大學(xué)利用SSR文庫和PCR技術(shù)開發(fā)了301個多態(tài)性棗SSR標(biāo)記[15]，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)利用454高通量測序技術(shù)對棗基因組進(jìn)行部分測序，找出15 036個微衛(wèi)星重復(fù)序列，并對其特征進(jìn)行了初步分析[16]，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)利用全基因組數(shù)據(jù)并與近緣物種進(jìn)行比較，全面分析了棗基因組SSR特征，共設(shè)計出30 565個SSR引物，公布了725對多態(tài)性SSR引物[17]；麻麗穎等[18]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了棗指紋圖譜，王斯琪等[19]、孫學(xué)超等[20]利用SSR標(biāo)記進(jìn)行了棗樹親本鑒定，殷曉等[21]用SSR標(biāo)記研究了陜北54個棗品種遺傳結(jié)構(gòu)，劉秀云等[22]對來自全國22個省區(qū)的255個棗品種進(jìn)行了SSR分析，揭示了它們的親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)，喇菲菲等[23]利用SSR分析了84個棗品種的遺傳多樣性，劉琰瑋等[24]用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定了棗樹多倍體種質(zhì)資源。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析甘肅黃河沿岸的39份棗品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為棗種質(zhì)資源的收集、保存和分子輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

39份供試棗樹葉樣于2018年8月采自甘肅省沿黃灌區(qū)的景泰縣、靖遠(yuǎn)縣和平川區(qū)，其中景泰縣五佛鄉(xiāng)棗樹品種園5份，平川區(qū)棗樹示范園5份，靖遠(yuǎn)縣甘肅省林業(yè)科學(xué)研究院棗樹示范研究園27份，2份材料分別來自小口村和敦煌市鳴山村的老棗樹(表1)。

表1 39份棗樹材料Table 1 Materials of 39 jujube cultivars

1.2 試驗方法

1.2.1 棗樹基因組DNA的提取 采集幼嫩、新鮮的棗樹葉片，利用TIANGEN植物基因組DNA試劑盒提取樣本DNA，IMPLEN納米光度計檢測DNA濃度和純度，置-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 SSR引物 20對SSR引物序列信息來源于《棗品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》[25]和公開發(fā)表的棗樹文獻(xiàn)[17,18,20,26]。引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成(表2)。

表2 SSR引物序列與名稱

1.2.3 PCR擴增與電泳檢測 PCR 擴增體系為(10 μL)：模板DNA 2.0 μL(約90ng)；2×Taq PCR MasterMix 5.0 μL；正向Primer和反向Primer各0.5 μL(10 μM)；ddH2O 2.0 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；53～65 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳結(jié)束后用硝酸銀染色觀察結(jié)果，照相保存圖片。DNA marker為pBR322。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 依據(jù)擴增產(chǎn)物在電泳凝膠上的遷移率，分別以“1”和“0”表示同一位置譜帶的有無，建立原始數(shù)據(jù)陣。用NTSYS-pc V2.10軟件計算品種間遺傳距離(GS)，用SAHN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。等位基因比率=(等位基因/n)×100%，n為每個SSR標(biāo)記所測位點的等位基因總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴增結(jié)果

SSR分子標(biāo)記擴增結(jié)果見表3。20對引物共擴增出142個清晰條帶，均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為100%。每對引物擴增的條帶數(shù)為3～13個，平均每對引物擴增的條帶數(shù)為7.10個，擴增片段大小在70～300bp。引物BFU0308擴增的條帶數(shù)最多，為13條，擴增條帶最少的引物為JSSR198和JSSR289，各有3條。20對SSR引物在39份棗種質(zhì)中均能獲得清晰的條帶。圖1和圖2是引物JSSR250和JSSR93擴增的結(jié)果。

表3 SSR引物擴增情況

2.2 遺傳多樣性分析

群體中兩兩個體之間的遺傳距離及平均遺傳距離是度量群體遺傳多樣性指標(biāo)之一[27]。本研究中39份供試棗品種間的遺傳距離(GS)在0.000 0～0.993 8，平均遺傳距離為0.558 7。其中原產(chǎn)山西稷山的板棗[1,2,3]與其他品種的遺傳距離在0.408 9～0.993 8，平均遺傳距離最大為0.729 8，表明板棗與其他供試品種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；原產(chǎn)于北京的冷白玉1[2]次之，與其他品種的遺傳距離在0.014 7～0.970 5，平均遺傳距離為0.714 6；原產(chǎn)于甘肅的臨澤大棗[1,3]與其他品種的遺傳距離在0.054 8～0.814 7，平均遺傳距離最小為0.457 2，表明臨澤大棗與其他供試品種親緣關(guān)系較近。根據(jù)兩兩供試品種之間的平均遺傳距離，可以將每份試材與其他供試品種間的親緣關(guān)系由遠(yuǎn)及近排序為板棗(0.729 8)、冷白玉1(0.714 6)、悠悠棗(0.692 5)、馬牙白棗(0.689 0)、新鄭灰棗(0.675 5)、七月鮮(0.664 1)、磨盤棗(0.640 4)、尜尜棗(0.597 6)、孔府酥脆棗(0.595 0)、新鄭早紅棗(0.594 4)、新星無核(0.587 4)、冬棗(0.585 5)、馬鈴棗(0.581 3)、葫蘆棗(0.575 1)、金芒果棗(0.573 8)、早脆王(0.559 6)、晉棗(0.559 5)、冷白玉2(0.552 1)、靈武長棗(0.551 0)、小梨棗(0.549 9)、蜂蜜罐(0.543 7)、茶壺棗(0.539 7)、贊皇大棗(0.531 9)、胎里紅(0.523 9)、晉贊大棗(0.517 4)、金谷大棗(0.517 4)、金昌1號(0.517 3)、駿棗(0.517 3)、壺瓶棗(0.514 4)、不落酥(0.504 0)、六月鮮(0.498 2)、敦煌大棗、小口棗、開口酥(0.494 2、0.494 2、0.494 2)、鳴山大棗(0.491 6)、晉矮3號(0.466 7)、大王棗(0.461 0)、晉矮4號(0.459 1)、臨澤大棗(0.457 2)。遺傳距離(GS)研究結(jié)果表明，黃河沿岸39份棗品種間的遺傳差異性較大，遺傳多樣性豐富。

2.3 SSR聚類結(jié)果與分析

使用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，得到39份供試棗品種的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖 3)。在遺傳相似系數(shù)0.660 0處，所有供試材料分為兩大類群Ⅰ和Ⅱ。第Ⅰ類群只包括板棗，獨立于其他供試材料，說明產(chǎn)于山西稷山的板棗[1,2,3]與其他供試品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是獨立起源的品種，與其他棗品種基因交流較少所致。

第Ⅱ類群在遺傳相似系數(shù)0.696 0處分為4個亞群。

第1亞群包括悠悠棗、馬牙白棗和磨盤棗。悠悠棗和馬牙白棗的遺傳相似系數(shù)為0.985 3，親緣關(guān)系很近，這與它們的形態(tài)學(xué)觀察一致，但兩者原產(chǎn)地不同，悠悠棗原產(chǎn)于河北涿鹿[2]，馬牙白棗原產(chǎn)于北京[1,3]。

第2亞群只有贊皇大棗。贊皇大棗是河北省著名的土特產(chǎn)品，為自然三倍體[28]。圖1和圖2顯示贊皇大棗為異源三倍體。

第3亞群包括靈武長棗(寧夏)、臨澤大棗(甘肅)、晉矮4號(山西)、晉矮3號(山西)、鳴山大棗(甘肅)、六月鮮(山東)、敦煌大棗(甘肅)、小口棗(甘肅)、開口酥(甘肅)、不落酥(山西)、蜂蜜罐(陜西)、七月鮮(陜西)、金谷大棗(山西)、金昌1號(山西)、壺瓶棗(山西)、駿棗(山西)、晉棗(陜西、甘肅)等棗種質(zhì)，原產(chǎn)于山西、陜西和甘肅的棗品種聚在了一起。

其中，晉矮4號和晉矮3號，鳴山大棗、敦煌大棗、小口棗和開口酥棗，駿棗、金谷大棗、金昌1號和壺瓶棗這3組試材分別在遺傳相似系數(shù)0.993 0、0.995 5、0.953 0處各自相聚，其中金谷大棗和金昌1號的遺傳相似系數(shù)是0.996 0，說明每組試材有極近的親緣關(guān)系。鳴山大棗為敦煌大棗的變異單株[1]，開口酥棗又名‘銀棗 2 號’，是從甘肅小口棗中選育出的鮮食新品種[29]；“金谷大棗”是從山西省太谷縣優(yōu)良種質(zhì)資源中選育出的干鮮兼用新品種[30]，金昌1號為山西省太谷縣壺瓶棗的變異單株[2]。

第4亞群包括小梨棗(山東)、早脆王(山東)、新鄭早紅棗(河南)、金芒果棗(山東)、胎里紅(河南)、孔府酥脆棗(山東)、葫蘆棗(河南山西)、冷白玉1(北京)、尜尜棗(北京天津)、馬鈴棗(山東)、冬棗(山東河北)、新鄭灰棗(河南)和新星無核(河北山東)等棗種質(zhì)，原產(chǎn)于山東、河南和河北的棗品種聚在了一起。

其中，小梨棗和早脆王(0.988 0)聚在一起，兩者親緣關(guān)系很近。小梨棗是山東慶云[1,2]的早熟鮮食品種，棗果較小，早脆王是從山東慶云縣引入山西的品種中選出的鮮食品種[2]，兩者果形棗核相似，果皮鮮紅，完熟棗風(fēng)味濃甜相同，是同一起源品種。馬鈴棗和尜尜棗在0.994 5處聚在一起，兩者親緣關(guān)系極近，表明它們起源相同。馬鈴棗產(chǎn)于山東陵縣[1]，而尜尜棗有原產(chǎn)北京的尜尜棗和天津尜尜棗之別[1,2]。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，來自林科院棗樹示范園的“尜尜棗” 果形特征與天津尜尜棗相似，非北京的尜尜棗。

另外，寧夏靈武的靈武長棗[2,3]，山西平遙等地的不落酥[1,3]，陜西大荔等地的蜂蜜罐[1,2,3]，陜西合陽的七月鮮[2]，山東夏津等地的茶壺棗[1,2,3]，陜西和甘肅的晉棗[1,2,3]，河南新鄭的新鄭早紅棗，河南鎮(zhèn)平的胎里紅[1,2,3]，山東曲阜的孔府酥脆棗[1,2,3]，北京的冷白玉1[2]，山西河南各地的葫蘆棗[1,3]，河北和山東各地的冬棗[1,2]，這12份試材在不同遺傳相似系數(shù)(0.782 0、0.922 0、0.860、0.755 0、0.819 0、0.762 0、0.806 0、0.827 0、0.752 0、0.767 0、0.792 0、0.748 0)處各自獨立為一支，說明它們彼此之間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

利用20對SSR引物分析了39份棗品種的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，甘肅黃河沿岸棗品種間遺傳差異較大，遺傳多樣性豐富。通過UPGMA聚類分析將39份棗品種分為兩大類群Ⅰ和Ⅱ，第Ⅱ類群又分為4個亞群，聚類結(jié)果反映的品種間親緣關(guān)系與其原產(chǎn)地有一定相關(guān)性。地理相鄰的山西、陜西、寧夏和甘肅4省的棗類在0.735 0處聚在了一起，地理相鄰的山東、河北和河南3省的棗類在0.724 0處聚在了一起(圖3)，這與前人研究結(jié)果基本一致,相同地理區(qū)域內(nèi)親緣關(guān)系近的棗品種被聚為一類[21,23]。本研究中，山西的晉矮4號和晉矮3號、山東慶云的小梨棗和早脆王等，均被聚到各自相同的類別。劉秀云等[22]用SSR分子標(biāo)記分析255個棗品種親緣關(guān)系，聚類和群體結(jié)構(gòu)2種分析結(jié)果均表明，大部分棗品種的親緣關(guān)系與來源區(qū)域基本相符。但棗親緣關(guān)系與地理分布并非完全相同。六月鮮原產(chǎn)于山東寧陽[2,3]，本研究中與甘肅的鳴山大棗(0.998 0)聚在一起。六月鮮與鳴山大棗表型差異較大，但遺傳關(guān)系極近。新星無核是從河北滄州金絲小棗資源中選育出來的變異優(yōu)良新品種[31]，但是與河南新鄭灰棗在0.927 0處聚在一起，說明它們有較近的親緣關(guān)系。

通過SSR遺傳分析，揭示了供試材料間的遺傳多樣性和復(fù)雜的親緣關(guān)系，從分子水平厘清品種命名混亂的情況。本研究中，“大王棗”與晉矮4號、晉矮3號被聚為一類，說明“大王棗”與晉矮4號、晉矮3號起源相同，而不可能源于河南大王棗，應(yīng)該是引種錯誤。“晉贊大棗”與壺瓶棗被聚為一類，圖1和圖2又顯示贊皇大棗是三倍體，“晉贊大棗”是二倍體。而文獻(xiàn)報道稱晉贊大棗是從贊皇大棗變異優(yōu)株中選育出的新品種[32]，劉琰瑋等[24]用16個位點的SSR標(biāo)記分析晉贊大棗和贊皇大棗的親緣關(guān)系，結(jié)果兩者具有相同的基因型。這就說明本研究中的“晉贊大棗”與贊皇大棗非近親品種，而是與壺瓶棗有極近親緣關(guān)系的同源大果型品種。再如，本研究中的“冷白玉2”，果形特征與平川區(qū)棗樹示范園的金芒果棗相似，兩者的遺傳相似系數(shù)是0.964 1。說明“冷白玉2” 和冷白玉1(北京)非近親品種，而是與金芒果棗親緣關(guān)系較近的冬棗品種。

本研究基于SSR標(biāo)記技術(shù)從分子水平上揭示了甘肅黃河沿岸棗品種豐富的遺傳多樣性和復(fù)雜的親緣關(guān)系，為有效解決棗品種命名混亂問題提供了依據(jù)，也為進(jìn)一步研究和利用這些棗種質(zhì)資源提供了依據(jù)。