范曉杰，李清靖，谷麗娜，桑梅香，單保恩，*

（1．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北石家莊 050011；2．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050011；3．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊 050011)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，根據(jù)全球癌癥(GLOBOCAN 2020)估計，2020 年，全球約有230 萬新發(fā)乳腺癌病例和65.5 萬例乳腺癌死亡病例，發(fā)病率和死亡率處于較高水平[1]。而在我國，女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率同樣處于高水平，分別占全球發(fā)病病例和死亡病例的18.4%和17.1%，嚴(yán)重危害著我國女性的生命健康[2]。黑素瘤相關(guān)抗原(melanomaassociated antigens， MAGE) 家 族 是 癌/睪 丸 抗 原(cancer testis antigen，CTA)家族的一員[3]。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和組織特異性，MAGE 家族又分為MAGE-I 和MAGE-II 兩類，MAGE-I 類包括MAGE-A、B 和C 亞族，MAGE-As是I類抗原中研究較為廣泛的家族，位于X染色體q28區(qū)，包括12個家族成員，分別命名為MAGE-A1~A12，除睪丸、胎盤組織外，在人體其他正常組織中均不表達(dá)，但在多種人類惡性腫瘤組織內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)，提示MAGE-As 有可能作為特異性腫瘤標(biāo)記物[4]。本研究采用多重巢式PCR(multiplex seminested PCR)和酶切方法檢測106例乳腺癌患者和30例健康人外周血中MAGE-As(MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)mRNA 以及單個基因亞型的表達(dá)情況，同時檢測了對應(yīng)的106例乳腺癌組織中MAGE-As蛋白的表達(dá)情況，分析MAGE-As基因表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，旨在探討外周血中MAGE-As基因的mRNA 是否可能作為特異性腫瘤標(biāo)記物，用于判斷乳腺癌患者的預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 研究對象

標(biāo)本取自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2012 年7 月—2013 年5 月期間的乳腺癌手術(shù)患者106 例，全部患者均為首次發(fā)病，術(shù)前均未接受任何放、化療和內(nèi)分泌治療。術(shù)前收集患者外周血5 mL，每例患者均取乳腺癌原發(fā)灶組織，常規(guī)石蠟包埋，制成厚4 μm 的病理切片，經(jīng)HE 染色，并由兩位病理醫(yī)師共同確定為乳腺癌組織，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)檢測。另選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗科30 例健康志愿者外周血5 mL作為陰性對照；正常睪丸組織作為陽性對照，其標(biāo)本取自前列腺癌去勢治療中收集的正常睪丸組織。平均年齡(48.9±11.8)歲，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測的標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，所有臨床病理指標(biāo)包括病理學(xué)類型、組織學(xué)分級、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)表達(dá)、孕激素受體(PR)表達(dá)和表皮生長因子受體(HER2)表達(dá)情況。上述樣本的獲取均取得受試者或其家屬的知情同意并簽署知情同意書，研究方案已獲得醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)(倫理審查編號2020KY004)。

1.2 主要試劑

血液總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；Go Taq Green Master Mix 購自美國Thermo 公司；瓊脂糖購自英國OXOID公司；PCR引物購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；QIA quick PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自QIAGEN 公司；BclⅠ、EcoRⅠ、SPhⅠ購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；Eco47Ⅲ購自Thermo 公司，AflⅢ購自New England Biolabs公司；鼠抗人MAGE-A(6C1)單克隆抗體購自美國Santa公司。

1.3 引物設(shè)計

引物選自前期課題組的研究[4]。第一輪PCR 引物，MAGE-1，上 游5′-ACTGGCCCTGGCTGCAAC-3′，下游5′-GCCCTGACCAGAGTCATCAT-3′(目的片段長度993 bp)；MAGE-1-1，上游5′-ACTGGCCTTG GCTGCAAC-3′，下 游5′-CCCTGACGAGAGTCATCA TG-3′(目的片段長度965 bp)。第二輪PCR 引物，MAGE-2，上游5′-ACTGGCCCTGGCTGCAAC-3′，下游5′-AGGCCCTGGGCCTGGTG-3′(目的片段長度914 bp)；MAGE-2-2，上游5′-ACTGGCCTTGGCTGCAAC-3′，下游5′-AGGCCCTGGGCTTGGTG-3′(目的片段長度893 bp)。GAPDH 引物，上游5′-ACCTGACCTGCC GTCTAGAA-3′，下游5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。引物由上海生工公司合成與純化。

1.4 RNA完整性鑒定

將提取的總RNA 于1.5%瓊脂糖凝膠中，恒壓80 V(電泳緩沖液1×TBE)電泳30 min 后，將凝膠移至紫外投射儀下進(jìn)行觀察結(jié)果。

1.5 多重巢式PCR檢測乳腺癌患者外周血中MAGEAs mRNA的表達(dá)水平

用血液總RNA提取試劑盒分別從乳腺癌患者和健康人血漿中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。第一輪PCR 反應(yīng)體系為模板cDNA 5 μL，10 μmol/L 的MAGE-1F 和MAGE-1R 各1 μL，10 μmol/L的MAGE-1-1F 和MAGE-1-1R 各0.2 μL，2×Taq Master Mix(含染料)25 μL，去離子水加至總體積為50 μL。第二輪PCR 反應(yīng)體系為首輪PCR 產(chǎn)物5 μL，10 μmol/L 的MAGE-2F 和MAGE-2R 各2 μL，10 μmol/L 的MAGE-1-2F 和MAGE-1-2R 各0.4 μL，2×Taq Master Mix(含染料)50 μL，去離子水加至總體積為100 μL。兩輪反應(yīng)條件均為：95 ℃、5 min，95 ℃、45 s，65 ℃、45 s，72 ℃、90 s，31 個循環(huán)，72 ℃、6 min。取PCR 產(chǎn)物6 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴增結(jié)果。

1.6 限制性內(nèi)切酶處理獲取MAGE-As基因片段

使用QIA quick PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，按照說明書將以上獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化后PCR產(chǎn)物分組，分別用限制性內(nèi)切酶BclⅠ、SPhⅠ、EcoR Ⅰ、Eco47 Ⅲ和AflⅢ進(jìn)行單酶切，得到MAGE-A1、A2、A3、A4和A6的不同基因片段(表1)。酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

表1 限制性內(nèi)切酶處理MAGE-As多重巢式PCR產(chǎn)物后的酶切片段

1.7 免疫組織化學(xué)染色

免疫組化選用Roche Benchmark XT 全自動免疫組化儀染色。一抗MAGE-A(克隆號6C1，1∶200)，以PBS 代替一抗作為陰性對照，用正常睪丸組織切片作為陽性對照。

1.8 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

免疫組化切片均由2 名資深病理科醫(yī)師雙盲獨立觀察評估。由于MAGE-As 在乳腺癌中的陽性閾值尚未明確，本實驗MAGE-As 以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒為陽性顯色。MAGE-As 表達(dá)采用半定量積分法，結(jié)合染色強度和陽性細(xì)胞百分比來評定陽性表達(dá)病例。先在低倍鏡下觀察切片整個視野，分別在腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)隨機選擇5 個高倍視野(×400)。染色強度分級如下：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞密度分級為：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1 分，10%~50%(含)為2分，＞50%為3 分。兩項得分相乘結(jié)果≥3 分為強陽性表達(dá)，＜1分為陰性表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，MAGE-As基因及單個MAGE-A基因表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系采用卡方檢驗或Fisher 檢驗，應(yīng)用Kaplan-Meier方法對乳腺癌患者是否陽性表達(dá)MAGEAs mRNA進(jìn)行生存分析，應(yīng)用Cox回歸模型針對陽性表達(dá)MAGE-As 及相關(guān)的臨床病理資料進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA完整性測定結(jié)果

完整的RNA 瓊脂糖凝膠電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶，且28S的亮度和寬度是18S的兩倍。本研究通過凝膠成像儀觀察顯示(圖1)，可明顯地觀察到28S的亮度和寬度是18S的兩倍，提示睪丸組織、乳腺癌外周血及健康對照外周血所提取的總RNA具有良好的完整性。

圖1 瓊脂糖電泳檢測睪丸組織、乳腺癌及健康人外周血總RNA 的完整性

2.2 MAGE-As 基因(包括MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)在乳腺癌外周血中的表達(dá)

多重巢式PCR檢測MAGE-As基因在睪丸正常組織(陽性對照)、乳腺癌患者外周血標(biāo)本和正常健康人外周血(陰性對照)中的表達(dá)情況見圖2A，結(jié)果顯示，MAGE-As mRNA 在睪丸組織和乳腺癌患者外周血中表達(dá)，在健康人外周血中未見表達(dá)。MAGE-As mRNA在乳腺癌外周血中的部分表達(dá)情況見圖2B，結(jié)果顯示，MAGE-As mRNA 在乳腺癌患者外周血中表達(dá)率為40%(43/106)，健康人外周血中無表達(dá)(0/30)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示(表2)，在乳腺癌患者外周血中，MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6 表達(dá)率分別為10.3%(11/106)、19.8%(21/106)、15.1%(16/106)、13.2%(14/106)和5.7%(6/106)；MAGE-As基因表達(dá)率的順序為A2＞A3＞A4＞A1＞A6。

圖2 乳腺癌患者外周血中MAGE-As的表達(dá)

表2 106名乳腺癌患者外周血中MAGE-As基因的表達(dá)率

以乳腺癌患者Q 為例，其外周血MAGE-As mRNA表達(dá)的檢測見圖3A，MAGE-A2和A6的片段未被檢測到，依據(jù)所用內(nèi)切酶SPhI，判定片段542 和375 bp 是MAGE-A4。MAGE-A1 和A3 片段大小略有不同，應(yīng)用BclI 和Eco47 III 兩種內(nèi)切酶，可以分別進(jìn)行鑒定?；颊逨的外周血檢測結(jié)果見圖3B，MAGEA1、A3 和A4 片段未被檢測到，根據(jù)所用內(nèi)切酶的不同，判定282 和438 bp 片段為MAGE-A6，151 和720 bp 片段為MAGE-A2?；颊逩 同時表達(dá)MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6 共5 種基因(圖3C)，結(jié)果與BclI、SPhI、EcoR I、Eco47 III、和AflIII限制性內(nèi)切酶切的片段一致。

圖3 部分乳腺癌患者外周血中MAGE-As經(jīng)5種限制性內(nèi)切酶處理后其家族成員的表達(dá)

2.3 MAGE-As mRNA 表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

MAGE-As mRNA 表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理指標(biāo)之間的統(tǒng)計學(xué)分析見表3。結(jié)果顯示，MAGE-As在外周血的表達(dá)與病理學(xué)類型(χ2=2.818，P=0.244)、臨床分期(χ2=4.101，P=0.129)、腫瘤大小(χ2=0.482，P=0.786)、ER(χ2=0.133，P=0.715)、HER2(χ2=0.357，P=0.550)、PR(χ2=0.439，P=0.507)均無明顯相關(guān)性，但與年 齡(χ2=26.102，P=0.000)、組 織 學(xué) 分 級(χ2=60.115，P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=9.929，P=0.002)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=15.402，P=0.000)相關(guān)。MAGE-A1 在外周血的表達(dá)僅與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=12.981，P=0.000)相關(guān)；MAGEA2在外周血的表達(dá)臨床分期(χ2=12.218，P=0.001)和腫瘤大小(χ2=11.753，P=0.003)相關(guān)；MAGE-A4 僅與年齡(χ2=6.456，P=0.04)相關(guān)。

表3 乳腺癌患者外周血MAGE-As基因表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性[百分率/%(例數(shù))]

2.4 MAGE-As在乳腺癌患者外周血與組織中表達(dá)的相關(guān)性

免疫組織化學(xué)結(jié)果(圖4A和B)顯示，MAGE-As在人正常睪丸組織(陽性對照)細(xì)胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有表達(dá)。MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6 在外周血呈陽性表達(dá)對應(yīng)的部分乳腺癌組織中的MAGE-As 蛋白陽性表達(dá)情況見圖4C~F。106 例乳腺癌組織中MAGE-As蛋白陽性表達(dá)率為45.3%(48/106)，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，MAGE-As 蛋白表達(dá)與mRNA 表達(dá)具有較高的一致性，呈正相關(guān)(r=0.368，P＜0.01)。

圖4 免疫組化法檢測MAGE-A4在正常睪丸組織和乳腺組織中的表達(dá)

2.5 MAGE-As表達(dá)與生存的關(guān)系

對MAGE-As 和單個基因亞型MAGE-A1~A4 和A6 mRNA 表達(dá)陽性及陰性的患者生存曲線分別進(jìn)行Log-Rank 檢驗，結(jié)果顯示，MAGE-As mRNA 陽性表達(dá)患者的5 年生存率顯著低于陰性表達(dá)的患者(P＜0.01)，見圖5A；單個基因亞型mRNA表達(dá)陽性患者的生存期顯著低于陰性的患者(P＜0.01)，見圖5B~E。采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，MAGEAs mRNA 表達(dá)(HR=3.425，P=0.005)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.487，P=0.036)情況是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨立因素，見表4。

表4 乳腺癌患者總體生存預(yù)后的Cox回歸分析

圖5 K-M曲線分析乳腺癌患者5年總體生存率與MAGE-As基因表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是從原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性病灶脫落到血液中的癌細(xì)胞，盡管某些原發(fā)性腫瘤中每天有數(shù)百萬癌細(xì)胞脫落，但只有一小部分CTC可能具有形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，CTC 的數(shù)量和特征可以提供有關(guān)腫瘤進(jìn)展和治療的關(guān)鍵信息[7-8]。在腫瘤發(fā)生的早期，CTC可以反映腫瘤的特征，判斷是否為惡性腫瘤，預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險；在腫瘤的晚期，CTC 可以幫助建立疾病的治療方法及評估預(yù)后。

對乳腺癌患者CTC的研究具有重要意義[9-10]。CTC已成為乳腺癌研究的熱點。目前，在乳腺癌中分離CTC 的計數(shù)平臺[11]是基于上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)標(biāo)記蛋白的表達(dá)來富集CTC。研究表明，在乳腺癌中最具侵襲性的腫瘤細(xì)胞是那些經(jīng)歷了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，該過程與EpCAM 以及其他黏附分子的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[12-13]。因此，只關(guān)注表達(dá)EpCAM 的細(xì)胞可能會給研究帶來嚴(yán)重的限制，導(dǎo)致CTC未被檢測到，研究者們目前尚未找到一個非常可靠的乳腺癌腫瘤特異性標(biāo)志物。

多項研究發(fā)現(xiàn)[14-16]，MAGE-As基因在乳腺癌中是一種腫瘤特異性基因。故而提示MAGE-As基因的mRNA 有可能作為特異性腫瘤標(biāo)記物，用于檢測乳腺癌外周血中的CTCs，從而預(yù)測乳腺癌的預(yù)后。由于MAGE-As基因的高度同源性，很難設(shè)計針對單個MAGE-As基因序列的引物。因此本研究利用多重巢式PCR 和酶切的方法檢測了106例乳腺癌患者和30例健康人外周血中MAGE-As mRNA 及單個基因亞型(MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。同時采用免疫組化的方法進(jìn)一步檢測外周血對應(yīng)的乳腺癌組織中MAGE-As 蛋白的表達(dá)的情況，分析外周血中MAGEAs mRNA表達(dá)與其相應(yīng)腫瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性。盡管研究MAGE-As基因在乳腺癌中的作用已有較多報道，但目前尚無相關(guān)研究表明MAGE-As基因可作為檢測乳腺癌外周血CTC的標(biāo)志物。

在本研究中，MAGE-As基因在106 例乳腺癌患者外周血中有43 例(40%)表達(dá)，30 例健康對照者外周血中未見MAGE-As 表達(dá)。采用限制性內(nèi)切酶處理檢測MAGE-As 各成員的表達(dá)情況，結(jié)果MAGE-A1、A2、A3、A4 及A6 mRNA 陽性表達(dá)率分別是10%(11/106)、21% (22/106)、 15% (16/106)、 13% (14/106) 和6% (6/106)。28 例乳腺癌患者外周血只表達(dá)一種MAGE-As基因，10 例乳腺癌患者外周血表達(dá)兩種MAGE-As基因，2 例乳腺癌患者外周血表達(dá)3 種MAGE-As基因，其中3 例乳腺癌患者外周血中同時表達(dá)5 種MAGE-As基因，以上結(jié)果提示檢測多個MAGE-As 家族成員可以克服單個MAGE-As基因亞型的異質(zhì)性和低表達(dá)水平，與普通的單標(biāo)志物檢測比較，多種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用更易于檢測出外周血中隱匿性腫瘤細(xì)胞。

本研究采用免疫組化的方法進(jìn)一步檢測了相應(yīng)的乳腺癌組織中MAGE-As 蛋白的表達(dá)的情況，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，MAGE-As(包括MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)蛋白在外周血對應(yīng)的106例乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為45.3%，MAGE-As mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)具有較高的一致性，呈正相關(guān)(r=0.368，P=0.001)，進(jìn)一步提示，MAGE-As 可以作為檢測乳腺癌患者CTC 的特異性生物標(biāo)志物。

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，隨著年齡的增長，MAGE-As基因的表達(dá)率也增加，這可能與基因甲基化有關(guān)，增加了機體的遺傳不穩(wěn)定性，基因甲基化誘導(dǎo)沉默基因表達(dá)[17]。隨著組織學(xué)分級的增加，MAGE-As基因的表達(dá)率也增加。MAGE-A2基因表達(dá)率隨著腫瘤大小的增加而增加，這與Otte等[18]的結(jié)果一致。Hamza等[19]的研究證明，腫瘤大小對于準(zhǔn)確的分期至關(guān)重要。腫瘤大小決定乳房腫瘤切除術(shù)術(shù)式和是否需要新輔助治療[20]。因此，推測MAGE-A2有可能是促進(jìn)腫瘤生長的基因。遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移乳腺癌患者M(jìn)AGE-As基因表達(dá)率顯著高于無遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移乳腺癌患者。腫瘤的組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均與較差預(yù)后有明顯的相關(guān)性。因此，MAGE-As基因的表達(dá)可能是檢測乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一。隨后本研究對MAGE-As基因和其家族各成員(MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6)的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示與MAGEAs 表達(dá)陰性的患者相比，MAGE-As mRNA 表達(dá)陽性乳腺癌患者的5年生存率較低。將MAGE-As及單基因型表達(dá)相關(guān)因素納入Cox 回歸模型，分析結(jié)果提示MAGE-As基因表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可作為乳腺癌患者5年生存率的獨立危險因素。

綜上所述，外周血中MAGE-As基因的表達(dá)有可能提示循環(huán)血中存在腫瘤細(xì)胞，可能與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，可作為監(jiān)測乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的一個重要標(biāo)記。以上研究只是一個初步的探索性研究，下一步我們將進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行更深入研究。