楊武斌，唐金鳳，米本中

(1．重慶市高新區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學(xué)辦公室，重慶 400039；2．重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院/國家衛(wèi)生健康委出生缺陷與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400020；3．重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動物研究所，重慶 400065)

肝纖維化是一種慢性肝損傷疾病，是指在病毒、酒精、藥物等刺激因素下所致的肝細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)過度沉積，是各種慢性肝病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。由于持續(xù)的慢性肝損傷，肝纖維化會進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。早期肝纖維化是一個動態(tài)的病變過程，在適當(dāng)干預(yù)條件下是可以逆轉(zhuǎn)的[2]。目前，如何逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化的病理過程已成為臨床工作和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路是一條重要的炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，能參與細(xì)胞的增殖、分化、炎癥及凋亡等病理生理過程[3]。研究已證實(shí)，JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展有著極其密切的聯(lián)系，抑制JAK/STAT 信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活可延緩肝纖維化的進(jìn)展[4-5]。根據(jù)肝纖維化的臨床癥狀及體征表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“脅痛”、“積聚”等范疇。柴胡疏肝散(Chaihushugan powder，CSGS)載于明代醫(yī)家張景岳之《景岳全書》，是疏肝理氣法的代表方，具有疏肝理氣、和血止痛之功效，主治肝氣郁滯證[6]。本研究模擬肝纖維化的中醫(yī)肝郁血瘀病機(jī)，應(yīng)用CCl4建立大鼠早期肝纖維化模型，初步探討CSGS 對模型大鼠肝功能指標(biāo)、纖維化指標(biāo)和肝臟病理學(xué)改變的影響，并檢測CSGS 對肝組織中JAK2/STAT3 信號通路的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討CSGS對早期肝纖維化防治作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD大鼠50只，體質(zhì)量200~250 g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2017-0003。在重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動物研究所常規(guī)條件喂養(yǎng)(12 h光/暗循環(huán)，室溫22 ℃，濕度30%~40%)。

1.2 柴胡疏肝散水煎劑的制備

柴胡疏肝散(CSGS)包含的所有中藥材均購自重慶市高新區(qū)人民醫(yī)院門診中藥房。柴胡10 g，陳皮10 g，川芎10 g，醋香附10 g，枳殼6 g，白芍6 g，炙甘草2 g。稱20倍處方量，將中藥材充分浸泡30 min后，用10倍體積水煎1 h，取上清液，再用10倍體積水煎濃縮至含生藥2 g/mL(約540 mL)。4 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和儀器

FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有 限 公 司)； SYBR Green master mix(KAPA Biosystems)；TRIzol Reagent(美國Life Technologies 公司)；透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、Ⅲ型前膠原(procollagen type III，PCⅢ)、Ⅳ型膠原(collage typeⅣ，Ⅳ-C)ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；β-actin 兔多克隆抗體(Abmart 公司)；JAK2兔多克隆抗體、STAT3 鼠單克隆抗體(美國Abcam 公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體和羊抗鼠IgG抗體(CST公司)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國Bio-Rad 公司)；DM 4000B 顯微鏡(德國Leica 公司)；Vortex 混合儀(上海啟前XH-D)；超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；凝膠成像系統(tǒng)Tanon 1600(上海天能科技有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 動物分組及造模SD大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組，模型組，CSGS 低(3.5 g/kg)、中(6.3 g/kg)、高(12.6 g/kg)劑量治療組，每組10 只。除正常組外，各組大鼠腹腔注射40% CCl4橄欖油溶液(1 mL/kg)，每周2次，連續(xù)10周誘導(dǎo)肝纖維化模型[7]；正常組以等容量橄欖油腹腔注射代替。CSGS給藥組于造模同時(shí)灌胃給藥，正常組和模型組給予等量蒸餾水，每天1 次。造模第5 周時(shí)，隨機(jī)抽取正常組和模型組各2 只大鼠，雌雄各半，若大鼠出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、毛色干燥粗糙，病理結(jié)果顯示肝組織損傷、炎癥細(xì)胞浸潤、膠原纖維形成、肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，則判定早期肝纖維化模型成功建立。第10周結(jié)束實(shí)驗(yàn)，將全部大鼠隔夜禁食(禁食不禁水16 h)，次日腹主動脈采血，取肝組織，一部分用10%的甲醛固定后制備石蠟切片，另一部分于-80 ℃冰箱中保存。

1.4.2 大鼠血清中肝損傷指標(biāo)檢測腹主動脈采血后靜置，以3 000 r/min 離心(離心半徑16 cm)10 min，分離血清。全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)的含量，評價(jià)肝功能。

1.4.3 大鼠血清中肝纖維化指標(biāo)測定取“1.4.2”項(xiàng)下大鼠血清樣品，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)，評價(jià)肝纖維化程度。

1.4.4 肝臟外觀形態(tài)觀察及肝系數(shù)測定取大鼠肝臟，用高倍相機(jī)在同背景同視野下拍外觀形態(tài)。生理鹽水洗血，濾紙吸干，稱取肝質(zhì)量，計(jì)算肝系數(shù)。

1.4.5 肝組織病理學(xué)檢查取肝組織置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟切片，HE 染色后置于倒置顯微鏡下觀察肝組織的病理改變。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測肝組織中JAK2 和STAT3 mRNA的表達(dá)

按TRIzol 試劑盒說明書提取大鼠肝組織總RNA，測定RNA 的濃度及純度。按照FastKing cDNA 試劑盒說明合成cDNA 第一條鏈。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative，qPCR)擴(kuò)增目的基因，β-actin 作為內(nèi)參，結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析，應(yīng)用Beacon designer 7.90設(shè)計(jì)引物，由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。目的基因引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列、擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.4.7 Western blot 法檢測JAK2 和STAT3 蛋白的表達(dá)水平將保存于-80 ℃的各組肝組織各取100 mg，提取組織蛋白并測定濃度。每孔上樣30 μL，采用12%的SDS-PAGE 進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，經(jīng)TBST洗滌后分別加JAK2一抗(稀釋度為1∶1 000)，STAT3 一抗(稀釋度為1∶5 000)，內(nèi)參β-actin一抗(稀釋度為1∶2 000)，在4 ℃下孵育過夜，TBST再次洗滌后，加入山羊抗兔或山羊抗鼠辣根酶標(biāo)記二抗(稀釋度均為1∶2 000)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑對其曝光顯影及拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的評價(jià)

造模第5 周時(shí)，觀察正常組和模型組大鼠的一般情況，并隨機(jī)抽取正常組和模型組各2 只大鼠，肝組織病理切片HE 染色結(jié)果見圖1。正常組大鼠皮毛光滑，反應(yīng)敏捷，性情溫和，食欲正常；HE 染色結(jié)果顯示肝組織的肝細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠皮毛蓬亂、無光澤，動作遲緩，易暴躁、恐慌；HE染色結(jié)果顯示肝組織中可見肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有圓形空泡，可見增生性膠原纖維，同時(shí)有大量炎性細(xì)胞浸潤。以上結(jié)果提示造模成功。

圖1 早期肝纖維化大鼠肝組織病理改變(HE染色)

2.2 柴胡疏肝散對早期肝纖維化大鼠血清中ALT 和AST活性的影響

大鼠血清中肝損傷指標(biāo)檢測結(jié)果見圖2。與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT和AST水平顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，柴胡疏肝散低、中、高劑量組血清ALT、AST水平均降低(P＜0.05或P＜0.01)。

圖2 柴胡疏肝散對早期肝纖維化大鼠血清ALT和AST含量的影響

2.3 柴胡疏肝散對大鼠血清中早期肝纖維化指標(biāo)的影響

見表2。與正常組相比，模型組大鼠血清透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)含量顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，柴胡疏肝散低、中、高劑量組的血清HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 柴胡疏肝散(CSGS)對各組大鼠血清中纖維化指標(biāo)的影響(ng/mL)

2.4 大鼠肝系數(shù)

圖3顯示，肝系數(shù)一定程度上反映肝臟腫脹程度。與正常組比較，模型組大鼠肝臟系數(shù)升高(P＜0.01)；與模型組比較，柴胡疏肝散低、中、高劑量組顯著降低肝系數(shù)(P＜0.05)。

圖3 柴胡疏肝散對早期肝纖維化大鼠肝系數(shù)的影響

2.5 柴胡疏肝散對早期肝纖維化模型大鼠肝組織病理學(xué)的影響

組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖4。正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞未見腫脹及其他異常；模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫，體積變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有圓形空泡，肝中央靜脈充血擴(kuò)張，肝細(xì)胞索呈不規(guī)則排列，有炎性細(xì)胞浸潤；柴胡疏肝散低、中、高劑量組肝組織的炎性病變及壞死程度均較模型組明顯減輕，其肝組織損傷程度處于正常組與模型組之間。

圖4 HE染色觀察各組大鼠肝組織病理改變

2.6 柴胡疏肝散對肝組織JAK2 和STAT3 mRNA 表達(dá)的影響

qPCR檢測結(jié)果見圖5，可見與正常組比較，模型組大鼠肝組織中JAK2 與STAT3 mRNA 表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較，柴胡疏肝散各劑量組不同程度均下調(diào)JAK2和STAT3 mRNA的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。

圖5 柴胡疏肝散對大鼠肝組織JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)的影響

2.7 肝組織中JAK2和STAT3的蛋白表達(dá)

Western blot 檢測結(jié)果見圖6。與正常組比較，模型組JAK2 和STAT3 蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較，柴胡疏肝散中、高劑量組明顯降低JAK2、STAT3 蛋 白 表 達(dá)(P＜0.05 或P＜0.01)，低 劑 量 組 的STAT3蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

圖6 各組大鼠肝組織JAK2和STAT3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

肝臟是人體解毒器官，有害物質(zhì)沉積于肝臟或免疫反應(yīng)均可造成肝細(xì)胞損傷、肝組織變性，引起肝內(nèi)結(jié)締組織增生等一系列代償反應(yīng)而形成肝纖維化。肝纖維化的病理過程十分復(fù)雜，以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化為病理特征。肝纖維化進(jìn)展至后期即形成肝硬化甚至肝癌。因此早期治療肝纖維化具有重要意義。

肝纖維化是由于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累造成的。CCl4是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，在肝臟中可引起毒性三氯甲基(CCl3)自由基，引起炎癥反應(yīng)，能激活肝星狀細(xì)胞，產(chǎn)生肝細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)，最終導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷[8]。去除致病因素是最佳治療策略，但許多慢性肝病中，致病因素和相關(guān)因素往往難以消除，這表明開發(fā)抗肝纖維化藥物的重要性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)CCl4誘導(dǎo)后，大鼠的肝結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織不同程度增生，說明大鼠肝纖維化模型建立成功。經(jīng)柴胡疏肝散干預(yù)后，大鼠肝細(xì)胞壞死和膠原纖維增生程度均減輕。本實(shí)驗(yàn)柴胡疏肝散降低肝系數(shù)，降低血清ALT、AST、HA、PCⅢ、Ⅳ-C 水平，提示柴胡疏肝散能降低肝臟損傷并抑制纖維化進(jìn)程。

JAK2/STAT3通路是一條由眾多細(xì)胞因子組成的信號通路，在人體肝臟中表達(dá)，并參與肝再生、免疫等過程。在促炎因子的作用下，能夠誘導(dǎo)肝內(nèi)炎性細(xì)胞聚集，刺激HSCs 增殖，合成膠原增加，ECM 大量沉積[9-10]。眾所周知，HSCs 的持續(xù)性活化，合成過量的膠原蛋白為主的ECM并在肝內(nèi)沉積，促進(jìn)纖維結(jié)締組織增生。本研究發(fā)現(xiàn)，CCL4誘導(dǎo)的肝早期纖維化大鼠經(jīng)柴胡疏肝散干預(yù)10周后能夠顯著改善肝纖維化大鼠的肝功能，緩解肝臟病理學(xué)改變，并能顯著降低肝組織中JAK2 和STAT3 的mRNA 以及蛋白的表達(dá)。表明柴胡疏肝散影響JAK2/STAT3 信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，且具有緩解肝纖維化的作用，其可能的機(jī)制是通過抑制JAK2/STAT3 通路的激活等多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)來發(fā)揮作用，但柴胡疏肝散是如何調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號通路緩解早期肝纖維化，是否還有其他的作用機(jī)制，這些仍然不是十分明確，還需要更深入的研究加以證實(shí)。