龐玉艷 李建棣 羅嘉嫄 莫偉嘉

肝癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，肝細(xì)胞癌約占肝癌的75%～85%[1]。肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制迄今未明，其危險(xiǎn)因素主要有肝炎病毒、黃曲霉毒素、非酒精性脂肪肝等[2-5]。肝癌治療策略包括藥物治療及非藥物治療[6-7]。由于肝細(xì)胞癌起病隱匿，許多患者錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)[8-9]。因此，迫切需要深入研究肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制，為晚期肝癌患者提供高效治療靶點(diǎn)，改善預(yù)后。

長鏈非編碼RNA異常表達(dá)是癌癥中常見的分子事件[10-11]。由于長鏈非編碼RNA表達(dá)的廣泛性及組織特異性，它極有可能成為癌癥生物標(biāo)志物[12-13]。長鏈非編碼RNA C17orf91為hsa-miR-22-3p、hsa-miR-22-5p前體，可參與抑制肝細(xì)胞癌增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為[14-15]。C17orf91通過miR-10a-5p/NCOR2軸抑制肝細(xì)胞癌生長，且C17orf91下調(diào)預(yù)示肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后[16]。C17orf91衍生的hsa-miR-22-3p可靶向調(diào)控高遷移率族蛋白1，滅活其下游通路；C17orf91還可競(jìng)爭結(jié)合RNA結(jié)合蛋白HuR，使β-連環(huán)蛋白（βcatenin）編碼基因表達(dá)減弱[17]。C17orf91衍生的hsamiR-22-5p可抑制組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2,HDAC2）活性，增加組蛋白乙酰化水平，增強(qiáng)肝細(xì)胞癌放射敏感性[18]。上述研究揭示C17orf91在肝細(xì)胞癌中的抑癌角色，C17orf91及其衍生miRNA有望成為肝細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)。然而，C17orf91在肝細(xì)胞癌中的分子機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在評(píng)估長鏈非編碼RNA C17orf91在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及其臨床意義，進(jìn)而探討C17orf91及其衍生miRNA的靶向機(jī)制，最終為肝細(xì)胞癌患者預(yù)測(cè)治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 肝細(xì)胞癌mRNA表達(dá)譜 本研究所納入的全球肝細(xì)胞癌mRNA與miRNA表達(dá)譜均下載自高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus,GEO）、ArrayExpress、癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和基因組織表達(dá)（Genotype-Tissue Expression,GTEx）數(shù)據(jù)庫。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）物種為人類；（2）明確病理診斷為肝細(xì)胞癌；（3）對(duì)照為健康肝臟組織；（4）表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）樣本中混有肝膽管細(xì)胞癌；（2）患者手術(shù)前經(jīng)過放射或者藥物治療。分別合并同一平臺(tái)的mRNA及miRNA數(shù)據(jù)集，產(chǎn)生的批次效應(yīng)經(jīng)limma程序包移除，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 C17orf91在全球肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)分析及其潛在臨床意義 利用移除批次后的全球肝細(xì)胞癌mRNA表達(dá)矩陣計(jì)算C17orf91在肝細(xì)胞癌組織及非癌肝組織中的表達(dá)總數(shù)、均值、標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算C17orf91表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化平均差（SMD）。通過繪制ROC曲線獲取C17orf91表達(dá)鑒別肝細(xì)胞癌的最佳靈敏度及特異度，計(jì)算真陽性率、假陽性率、假陰性率和真陰性率，經(jīng)Stata 12.0統(tǒng)計(jì)軟件合并得到匯總ROC（summary ROC,sROC）及AUC。最后，利用 Kaplan-Meier Plotter評(píng)估C17orf91對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的潛在影響。

1.3 肝細(xì)胞癌mRNA及miRNA差異表達(dá)分析 分別利用移除批次后的全球肝細(xì)胞癌mRNA及miRNA表達(dá)矩陣計(jì)算表達(dá)值的SMD，鑒定差異表達(dá)mRNA（differentially expressed messenger RNA,DEmRNA）及差異表達(dá)miRNA（differentially expressed micro RNA,DEmiRNA）（|SMD|＞0，P＜0.05）。

1.4 C17orf91來源hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p靶基因預(yù)測(cè) 鑒于C17orf91作為hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p宿主基因，其功能依賴于miRNA對(duì)下游mRNA靶點(diǎn)的調(diào)控。本研究全面探討hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p的靶基因，利用的11個(gè)數(shù)據(jù)庫包括 miRecords、DIANA-microT-CDS、ElMMo、Micro-Cosm、miRanda、miRDB、miRTarBase、PicTar、PITA、TarBase和 TargetScan。hsa-miR-22-3p、hsa-miR-22-5p與靶基因的相互作用均經(jīng)過研究驗(yàn)證（如熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、降解組測(cè)序、紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測(cè)序等）。

1.5 肝細(xì)胞癌C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA競(jìng)爭性內(nèi)源RNA機(jī)制 C17orf91還有可能通過其他miRNA發(fā)揮功能，本研究進(jìn)一步查詢了C17orf91相關(guān)的miRNA及經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證的mRNA靶基因。兩者分別與DEmiRNA、DEmRNA交集，用于構(gòu)建C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA競(jìng)爭性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 17orf91相關(guān)靶基因功能注釋 利用Metascape對(duì)hsa-miR-22-3p、hsa-miR-22-5p及C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA靶基因的潛在分子生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.7 計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測(cè)潛在抗肝細(xì)胞癌治療藥物 通過靶向肝細(xì)胞癌中的C17orf91調(diào)控分子通路，對(duì)FDA批準(zhǔn)或臨床試驗(yàn)研究抗癌藥物進(jìn)行重新利用，初步篩選可能具有較高敏感性的抗肝細(xì)胞癌藥物及其潛在作用靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織及非癌肝組織C17orf91表達(dá)水平比較 本研究共納入24個(gè)基因芯片及高通量測(cè)序合并數(shù)據(jù)集，其肝細(xì)胞癌組織及非癌肝組織對(duì)照樣本分別達(dá)1 381、1 052例，見表1。肝細(xì)胞癌組織中C17orf91表達(dá)水平明顯下調(diào)，其SMD低至-0.96（-1.25～-0.67）（圖1a）。發(fā)表偏倚檢測(cè)、敏感性分析結(jié)果提示未見明顯發(fā)表偏倚、未發(fā)現(xiàn)明顯的異質(zhì)性來源，故整合分析結(jié)果可靠（圖1b-c）。

表1 全球肝細(xì)胞癌表達(dá)矩陣中的C17orf91表達(dá)水平

2.2 C17orf91表達(dá)水平對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響為評(píng)估C17orf91在肝細(xì)胞癌中的潛在臨床價(jià)值，本研究首先利用C17orf91表達(dá)水平對(duì)肝細(xì)胞癌組織、非癌肝組織進(jìn)行診斷試驗(yàn)，見表2。結(jié)果表明，C17orf91有能力甄別肝細(xì)胞癌組織及非癌肝組織，其sROC AUC為0.84（0.80～0.87），靈敏度及特異度分別為0.72（0.63，0.80）、0.82（0.72～0.89）（圖1d），皆提示C17orf91對(duì)肝細(xì)胞癌具有中等區(qū)分能力。陽性似然比、陰性似然比森林圖結(jié)果亦揭示了C17orf91用于區(qū)分肝細(xì)胞癌的準(zhǔn)確性（圖1e-f）。本研究進(jìn)一步評(píng)估C17orf91的預(yù)后能力，發(fā)現(xiàn)C17orf91高表達(dá)可預(yù)示肝細(xì)胞癌患者較低的生存風(fēng)險(xiǎn)（圖2a-b）。由此得知，低表達(dá)C17orf91預(yù)示肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良。

表2 C17orf91對(duì)肝細(xì)胞癌組織與非癌肝組織的區(qū)分能力（例）

圖1 C17orf91在全球肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)下調(diào)及其對(duì)肝癌患者的潛在鑒別意義（a：與非癌肝組織相比，肝細(xì)胞癌組織中C17orf91呈低表達(dá)；b：未檢測(cè)到明顯發(fā)表偏倚；c：敏感性分析未鑒別出明顯異質(zhì)性來源；d：C17orf91對(duì)肝細(xì)胞癌組織與非癌肝組織有中等區(qū)分能力；e：陽性似然比森林圖；f：陰性似然比森林圖）

2.3 C17orf91的潛在分子功能 本研究共獲取肝細(xì)胞癌hsa-miR-22-3p差異表達(dá)靶點(diǎn)1 395個(gè)、hsa-miR-22-5p差異表達(dá)靶點(diǎn)798個(gè)，其中分別包含hsa-miR-22-3p上調(diào)靶點(diǎn)1 018個(gè)、下調(diào)靶點(diǎn)377個(gè)以及hsamiR-22-5p上調(diào)靶點(diǎn)554個(gè)、下調(diào)靶點(diǎn)244個(gè)。hsamiR-22-3p和hsa-miR-22-5p下調(diào)靶基因在肝細(xì)胞癌差異表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中分別參與細(xì)胞遷移正性調(diào)控和血管發(fā)育（圖2c）。

圖2 C17orf91衍生miRNA在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中的潛在機(jī)制（a：C17orf91低表達(dá)預(yù)示肝細(xì)胞癌患者總體生存期高風(fēng)險(xiǎn)；b：C17orf91低表達(dá)預(yù)示肝細(xì)胞癌患者無進(jìn)展生存期高風(fēng)險(xiǎn)；c：C17orf91系hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p宿主基因，其靶基因在肝細(xì)胞癌差異表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中分別參與細(xì)胞遷移正性調(diào)控和血管發(fā)育）

2.4 肝細(xì)胞癌C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA調(diào)控機(jī)制 本研究首先反向預(yù)測(cè)調(diào)控C17orf91的69個(gè)miRNA，其中僅有16個(gè)顯著高表達(dá)miRNA及2個(gè)顯著低表達(dá)miRNA。利用這18個(gè)差異表達(dá)miRNA，預(yù)測(cè)得差異表達(dá)靶基因42個(gè)（下調(diào)15個(gè)、上調(diào)27個(gè)）。功能注釋結(jié)果表明，上調(diào)靶基因主要參與癌癥通路（圖3a），而下調(diào)靶基因主要參與細(xì)胞遷移正性調(diào)控、細(xì)胞群增殖負(fù)性調(diào)控及PID CMYB信號(hào)通路（圖3b）。圖4展示了C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與癌癥通路及細(xì)胞遷移正性調(diào)控的相互作用關(guān)系。

圖3 C17orf91上游相關(guān)miRNA靶基因功能注釋（a：C17orf91上游相關(guān)miRNA的上調(diào)靶基因主要參與癌癥通路；b：C17orf91上游相關(guān)miRNA的下調(diào)靶基因主要參與細(xì)胞遷移正性調(diào)控）

2.5 潛在抗肝細(xì)胞癌藥物及其治療靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 相關(guān)分析結(jié)果提示，C17orf91衍生hsa-miR-22-3p靶基因具有血小板反應(yīng)蛋白1型基序1的ADAM金屬肽酶（ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1,ADAMTS1）表達(dá)水平與多種抗癌藥物敏感性顯著相關(guān)：ADAMTS1在肝細(xì)胞癌組織中顯著低表達(dá)，且與雷帕霉素、Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV-939、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物的半抑制濃度（IC50）呈正相關(guān)，但與他莫昔芬、伏拉塞替等多種抗癌藥物的IC50呈負(fù)相關(guān)（圖5）。且ADAMTS1低表達(dá)提示雷帕霉素、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物IC50水平較低（圖6）。因此，ADAMTS1可能作為肝癌治療靶點(diǎn)，且ADAMTS1低表達(dá)肝細(xì)胞癌患者對(duì)雷帕霉素、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物敏感性可能較好。

圖5 靶向C17orf91-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選潛在抗肝細(xì)胞癌藥物（C17orf91衍生的hsa-miR-22-3p在肝細(xì)胞癌中被下調(diào)，其調(diào)控靶標(biāo)ADAMTS1亦在肝細(xì)胞癌中呈低表達(dá)，與雷帕霉素、XAV-939、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物的IC50呈正相關(guān)，但與他莫昔芬、伏拉塞替等多種抗癌藥物的IC50呈負(fù)相關(guān)）

圖6 ADAMTS1通過靶向C17orf91-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為肝細(xì)胞癌患者的潛在治療靶標(biāo)

3 討論

長鏈非編碼RNA C17orf91可抑制肝細(xì)胞癌的生長發(fā)育，然而C17orf91在肝細(xì)胞癌中的相關(guān)研究依舊十分有限。利用全球基因芯片、測(cè)序數(shù)據(jù)來研究C17orf91的表達(dá)意義，探索C17orf91衍生miRNA、C17orf91相關(guān)miRNA的靶向調(diào)控關(guān)系，有助于深入剖析C17orf91抗肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制，并對(duì)肝細(xì)胞癌患者靶向治療藥物的開發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。

本研究立足于全球1 381例肝細(xì)胞癌及1 052例非癌肝組織樣本，從轉(zhuǎn)錄層面印證了C17orf91的低表達(dá)水平。本研究中，筆者采集了來自德國、韓國、美國、日本、瑞士、西班牙、意大利和中國這8個(gè)國家的總共32個(gè)單一的肝細(xì)胞癌基因芯片、基因高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集，不僅證實(shí)了C17orf91在肝細(xì)胞癌組織中的低表達(dá)，還進(jìn)一步闡明了C17orf91對(duì)肝細(xì)胞癌的中等區(qū)分能力。本研究納入的肝癌樣本量更大、面更廣，對(duì)研究C17orf91表達(dá)的臨床意義有極大的補(bǔ)充。

C17orf91作為miRNA宿主基因，與hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p有著密切聯(lián)系。在肝癌細(xì)胞系中，C17orf91來源的hsa-miR-22-3p可顯著抑制C17orf91敲除對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲的促進(jìn)作用[17]。此外，C17orf91衍生的hsa-miR-22-5p在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)，且在經(jīng)受放射治療后hsa-miR-22-5p表達(dá)水平升高[18]。這些研究表明hsa-miR-22-3p與hsa-miR-22-5p在肝細(xì)胞癌中可能發(fā)揮抑癌效果，其中hsamiR-22-5p還可能與肝癌的放療敏感性有關(guān)。本研究中，hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p的下調(diào)靶基因在肝細(xì)胞癌差異表達(dá)調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)中分別參與細(xì)胞遷移和血管發(fā)育。無獨(dú)有偶，hsa-miR-22-3p曾多次被報(bào)道可通過靶向組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 6,HDAC6）、PLAG1樣鋅指蛋白2（PLAG1 like zinc finger 2,PLAGL2）和OC1/血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）分別抑制晶狀體上皮、乳腺癌以及內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力[19-21]。不僅如此，研究人員證實(shí)了hsa-miR-22-3p還可通過靶向下調(diào)Sp1轉(zhuǎn)錄因子[22]、靶向調(diào)控Snail1表達(dá)[23]、調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因（E-鈣黏蛋白、β-catenin、N-鈣黏蛋白和波形蛋白）[24]等多種機(jī)制抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的遷移能力。因此，hsa-miR-22-3p在肝細(xì)胞癌中的抑癌作用也極有可能是通過其5'端非翻譯區(qū)與靶基因的3'端非翻譯區(qū)進(jìn)行不完全互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制其靶基因介導(dǎo)的促細(xì)胞遷移機(jī)制。雖然目前尚無研究闡明hsa-miR-22-5p與血管發(fā)育有直接關(guān)聯(lián)，但不可否認(rèn)的是，miR-22可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的合成并通過靶向血管內(nèi)皮-鈣黏蛋白誘發(fā)血管生成[25]。綜上所述，C17orf91對(duì)抗肝細(xì)胞癌的部分原因可能是hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p對(duì)下游靶基因的抑制作用。

本研究還進(jìn)一步探索了hsa-miR-22-3p靶基因ADAMTS1作為肝癌治療靶點(diǎn)的潛能。ADAMTS1作為ADAMTS蛋白家族的一員，它所編碼的蛋白質(zhì)含有2個(gè)去整合素環(huán)和3個(gè)C末端TS基序，并具有抗血管生成活性[26]。ADAMTS1可能是維持正常生長、生育能力以及器官形態(tài)和功能所必需，且其表達(dá)可能與各種炎癥過程以及癌癥惡病質(zhì)的發(fā)展均有關(guān)。研究表明，ADAMTS1可抑制卵巢癌及纖維肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[27-28]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)ADAMTS1在肝細(xì)胞癌中呈顯著低表達(dá)，且其低表達(dá)可能還提示癌癥細(xì)胞對(duì)雷帕霉素、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物具有更高敏感性。綜上，ADAMTS1有可能用于預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌對(duì)抗癌藥物的敏感程度。

然而，本研究尚存些許不足。C17orf91來源的hsa-miR-22-5p參與抑制血管發(fā)育的機(jī)制還未得到佐證。因此，在未來的研究中，還需要開展更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以證實(shí)本文提出的假說。

綜上所述，C17orf91在肝細(xì)胞癌組織中被顯著下調(diào)，且低表達(dá)C17orf91預(yù)示肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良。C17orf91來源的hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p可能參與抑制細(xì)胞遷移正性調(diào)控及血管發(fā)育。hsamiR-22-3p靶基因ADAMTS1可能作為肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)。