郭君萍 張珂 季夏薇 玉環(huán) 吳芳全 施迪邦 張嘉珉 王方巖

宮頸癌是全球女性的第四大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，嚴(yán)重威脅女性的健康[1]。在中國，宮頸癌患者早期診斷率低，臨床上現(xiàn)行的手術(shù)、放療、化療等治療手段效果也不理想。目前，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍未完全闡明，深入探索其內(nèi)在機(jī)制可能提供新的診療思路。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)自噬在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的重要作用[2-3]。自噬是指細(xì)胞通過溶酶體的作用對自身多余的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器進(jìn)行清除，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[4]。然而，過度的自噬會導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡[5]。誘導(dǎo)過度自噬已成為部分宮頸癌治療藥物的作用靶點(diǎn)，例如二甲雙胍聯(lián)合奈非那韋的抗腫瘤作用與誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞中的自噬體形成有關(guān)[6]，一些合成的抗腫瘤肽如UM-6通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬在體外抑制宮頸癌細(xì)胞[7]。丁酸是腸道微生物發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的具有生物活性的短鏈脂肪酸，不僅能提供腸上皮細(xì)胞70%的能量，還能抑制宮頸癌、肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-11]。有研究表明，丁酸可通過誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累，抑制Akt/mTOR途徑，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)和自噬體形成[12]。有關(guān)宮頸癌的一些研究發(fā)現(xiàn)，丁酸能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但是否通過自噬以及其確切的機(jī)制還有待闡明。基于此，本研究利用離體培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞系，通過檢測自噬相關(guān)蛋白，探討丁酸抑制宮頸癌的具體作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 丁酸鈉（純度＞98%）購自中國Aladdin公司，溶于DMEM培養(yǎng)基（中國Gibco公司）中配制成100 mmol/L原液，并用0.22 μm過濾膜過濾，保存在-20℃環(huán)境中。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）購自美國MCE公司。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（型號：C0009S）購自中國Beyotime公司。細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting Kit-8,CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）抗體購買于美國CST公司，p62抗體購買于中國Affinity公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體、山羊二抗購自中國HUABIO公司，所有抗體均以1∶1 000比例稀釋，保存在4℃環(huán)境中。

1.1.2 細(xì)胞 人類宮頸癌Hela細(xì)胞購于美國ATCC公司，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱（德國Eppendorf AG公司，型號：6731KN019434）中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況換液，細(xì)胞生長密度為70%～80%時進(jìn)行傳代。

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖能力 將處于生長對數(shù)期的Hela細(xì)胞按2 000個/孔加入96孔板，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，加入5 mmol/L的丁酸鈉培養(yǎng)12、24、48 h（丁酸處理組），對照組不作處理。MTT粉末溶于稀釋液中配成5 mg/ml的工作液，-20℃避光保存。每孔加入10 μl的MTT工作液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，再加入100 μl的Formazan溶解液，混合均勻，37℃孵育3 h至紫色結(jié)晶全部溶解，使用多功能酶標(biāo)儀（美國ThermoScientific公司，型號：VarioskanLUX）在570 nm測定吸光度。

1.2.2 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 將培養(yǎng)48 h的丁酸處理組細(xì)胞與對照組細(xì)胞分別收集到1.5 ml EP管中，2.5%戊二醛固定24 h以上，再使用四氧化鋨固定細(xì)胞30 min，梯度乙醇溶液脫水，包埋，半薄切片，超薄切片。最后，在透射電子顯微鏡（日本HITACHI公司，型號：H7500）下觀察自噬囊泡、自噬溶酶體的形成，并進(jìn)行拍照。

1.2.3 mGFP-RFP-LC3雙熒光實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞自噬流將Hela細(xì)胞接種在12孔板的細(xì)胞爬片上，24 h完全貼壁后，每孔加入脂質(zhì)體Lip2000（美國Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染mGFP-RFP-LC3質(zhì)粒（中國麟美生物公司科技有限公司）1 μg，培養(yǎng)8 h后，5 mmol/L丁酸鈉分別處理12、24、48 h，對照組不作處理。棄培養(yǎng)液，PBS清洗，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，重復(fù)PBS清洗過程，0.1%Triton X-100處理5 min后再次PBS清洗，1%FBS室溫固定30 min，含DAPI抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡（日本尼康公司，型號：CI-L）下觀察細(xì)胞自噬流。

1.2.4 Western blot法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、p62表達(dá) 將Hela細(xì)胞接種到6孔板，5 mmol/L丁酸鈉處理48 h后收集（丁酸處理組），對照組不作處理，加入RAPI裂解液和蛋白酶抑制劑提取蛋白。使用二甲胺基丙酸蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（BIO-RAD）中，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，含吐溫的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween,TBST）清洗3次，敷一抗4℃搖床過夜。第2天回收一抗，TBST清洗3次，室溫孵育二抗2 h。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國GE公司）掃描，Image J軟件通過密度測定法對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.5 CCK-8法檢測自噬抑制劑3-MA對細(xì)胞的半抑制濃度（IC50） 將處于生長對數(shù)期的Hela細(xì)胞按3 000個/孔接種到96孔板中，完全貼壁后加入含有不同濃度3-MA的培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μl含10%CCK-8的混合液，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測吸光度，計算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白）/（A對照組-A空白）。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）法檢測細(xì)胞LC3、p62 mRNA表達(dá) 用5 mmol/L丁酸鈉處理Hela細(xì)胞12、24、48 h后收集細(xì)胞（丁酸處理組），對照組不作處理。Trizol試劑提取總RNA，使用基因擴(kuò)增核糖核酸聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入特異性引物（生工生物工程股份有限公司）、SYBR聚合酶（翌圣生物科技股份有限公司），在高通量熒光定量PCR儀（新加坡ABI公司）上進(jìn)行RT-qPCR。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體ROS水平 使用線粒體超氧化物熒光探針檢測細(xì)胞線粒體中的ROS相對表達(dá)水平。將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，分為對照組、丁酸組（加入5 mmol/L丁酸鈉處理48 h）、3-MA+丁酸組（3-MA加5 mmol/L丁酸鈉作用48 h）。加入PBS配制的5 μmol/L ROS工作液，于37℃避光孵育10 min，收集細(xì)胞線粒體ROS水平檢測細(xì)胞線粒體ROS水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁酸處理組與對照組細(xì)胞增殖能力比較 細(xì)胞培養(yǎng)12、24 h時，兩組細(xì)胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；培養(yǎng)48 h后，與對照組相比，丁酸處理組細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05），即丁酸抑制Hela細(xì)胞增殖，在48 h時最顯著，見圖1。

圖1 丁酸處理組與對照組細(xì)胞增殖能力比較

2.2 丁酸處理組與對照組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察所見對照組細(xì)胞中可觀察到正常的細(xì)胞核和核膜，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，無水腫、空泡樣改變，見圖2a、b。丁酸處理組細(xì)胞中可觀察到大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，囊泡內(nèi)包含受損的線粒體等細(xì)胞器，呈典型的自噬改變，見圖2c、d。即丁酸可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞自噬。

圖2 丁酸處理組與對照組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察所見（a、b：對照組；c、d：丁酸處理組；a、c：×15 000；b、d：×30 000）

2.3 丁酸處理組與對照組細(xì)胞自噬流觀察 LC3被紅色熒光和綠色熒光標(biāo)記，當(dāng)自噬小體與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體時，綠色熒光在酸性環(huán)境下發(fā)生淬滅，只能檢測到紅色熒光。隨著丁酸處理時間增加，綠色熒光逐漸減弱，紅色熒光逐漸增強(qiáng)，即丁酸促進(jìn)自噬體向自噬溶酶體的轉(zhuǎn)化增多，自噬流水平升高，見圖3（插頁）。

圖3 丁酸處理組與對照組細(xì)胞自噬流觀察所見

2.4 丁酸處理組與對照組細(xì)胞LC3、p62蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 不管是蛋白水平還是mRNA水平，與對照組相比，丁酸處理組隨著丁酸處理時間增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化增多，p62的表達(dá)則隨著處理時間增加而減少，見圖4。即丁酸誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬。

圖4 丁酸處理組與對照組細(xì)胞LC3、p62蛋白和mRNA表達(dá)水平比較（a：LC3、p62蛋白表達(dá)水平比較電泳圖；b：LC3 mRNA表達(dá)水平比較；c：p62 mRNA表達(dá)水平比較）

2.5 3-MA對細(xì)胞的IC50檢測及對細(xì)胞自噬的影響隨著3-MA濃度增加，3-MA對細(xì)胞的抑制作用也增強(qiáng)。本研究選擇5 mmol/L作為3-MA的工作濃度，它抑制作用較強(qiáng)，毒性較小。Western blot結(jié)果表明，丁酸誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ活化可被3-MA抑制，即丁酸對宮頸癌細(xì)胞自噬起促進(jìn)作用，見圖5。

圖5 3-MA對細(xì)胞的IC50檢測及對細(xì)胞自噬的影響（a：不同濃度3-MA作用于細(xì)胞的IC50檢測；b：LC3蛋白表達(dá)電泳圖）

2.6 對照組、丁酸組、3-MA+丁酸組細(xì)胞線粒體ROS水平比較 流式細(xì)胞術(shù)顯示，與對照組相比，丁酸組ROS水平升高（P＜0.05），3-MA+丁酸組ROS水平低于丁酸組但高于對照組（均P＜0.05），見圖6。即丁酸誘導(dǎo)自噬可能通過線粒體途徑，而ROS在其中發(fā)揮重要作用。

圖6 對照組、丁酸組、3-MA+丁酸組細(xì)胞線粒體ROS水平比較流式細(xì)胞圖（a：對照組;b：丁酸處理組；c：3-MA+丁酸組）

3 討論

丁酸是生物活性最活躍的短鏈脂肪酸，可以通過多種機(jī)制發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。作為組蛋白乙?；种苿∷嵩黾咏M蛋白乙?；?，調(diào)控增殖、凋亡、代謝等基因表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用[13-14]。此外，丁酸還能結(jié)合GPR41、43、109a抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。本研究結(jié)果顯示，丁酸顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用與細(xì)胞自噬有關(guān)。

細(xì)胞自噬可以通過消除受損的細(xì)胞器，回收代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)內(nèi)平衡，促進(jìn)癌細(xì)胞存活。研究表明，抑制自噬可以緩解卵巢癌[17-18]、結(jié)直腸癌[19]、肺癌[20]等的化療藥物耐藥性。在胰腺癌細(xì)胞中，SMAD4基因敲除引發(fā)的放射治療抵抗力與ROS積累、輻射誘導(dǎo)的自噬水平升高有關(guān)[21]。自噬也被證明在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受放射治療引起的細(xì)胞損傷[22]。此外，自噬阻斷劑氯喹被報道可增強(qiáng)IL-2免疫治療的抗腫瘤作用[23-24]。然而過度的自噬會誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡，自噬性死亡已成為抑制癌癥的重要手段[25]。在乳腺癌細(xì)胞中，氟苯達(dá)唑通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡抑制細(xì)胞增殖和遷移[26]。自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡也被發(fā)現(xiàn)與前列腺凋亡反應(yīng)4蛋白抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞有關(guān)[27]。丁酸作為不同腫瘤治療的潛力藥物，其抗腫瘤作用也被報道與細(xì)胞自噬有關(guān)。小劑量的丁酸和槲皮素聯(lián)合應(yīng)用可通過抑制保護(hù)性自噬增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的凋亡[28]。大劑量的丁酸則通過促進(jìn)自噬性死亡抑制腎細(xì)胞瘤增殖[29]。

本研究結(jié)果表明，丁酸能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步通過透射電子顯微鏡觀察到丁酸處理后的宮頸癌細(xì)胞中出現(xiàn)大量吞噬了破損的線粒體等細(xì)胞器的自噬體，呈典型的自噬變化。因此，筆者推測細(xì)胞自噬是丁酸抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制。自噬作為真核細(xì)胞內(nèi)保守的一種進(jìn)化形式，首先是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者其他細(xì)胞膜上形成吞噬泡以響應(yīng)應(yīng)激信號通路，接著抗胸腺細(xì)胞球蛋白5（antithymocyte globulin,ATG5）和ATG12耦聯(lián)形成復(fù)合體，LC3被半胱氨酸蛋白酶ATG4切割生成LC3-Ⅰ，后者被ATG7激活后，在ATG3的作用下與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，促進(jìn)自噬體膜擴(kuò)增[30]。不斷增長的吞噬膜通過膜上的LC3-Ⅱ與細(xì)胞器、蛋白質(zhì)上的分子相互作用促進(jìn)其選擇性攝取與降解，而p62是其中重要的銜接蛋白[31]。最后自噬泡與溶酶體結(jié)合并被溶酶體酶降解。在本研究中，mRFP-GFP-LC3雙熒光實(shí)驗(yàn)顯示綠色熒光減弱，紅色熒光增強(qiáng)，提示自噬流增加，RT-qPCR和蛋白印記分析結(jié)果均表明LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ增多，p62表達(dá)減少，以上結(jié)果均提示丁酸激活自噬。使用自噬抑制劑3-MA可以抑制丁酸誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ活化，進(jìn)一步證明丁酸確實(shí)促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞自噬。

自噬過程常常伴隨ROS水平的升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ROS作為信號分子，能觸發(fā)細(xì)胞自噬過程的發(fā)生。甘草酸被報道通過ROS-線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬與死亡，在抑制癌細(xì)胞生長中起重要作用[32]。異黃酮產(chǎn)生ROS破壞線粒體，導(dǎo)致自噬并誘導(dǎo)凋亡，顯著抑制腫瘤細(xì)胞[33]。在骨肉瘤細(xì)胞中，芬太尼誘導(dǎo)ROS生成，磷酸化c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK），從而觸發(fā)自噬性死亡發(fā)揮抗腫瘤作用[34]。本研究也觀察到自噬體吞噬了受損的線粒體。因此，本研究檢測了宮頸癌細(xì)胞中線粒體的ROS水平，發(fā)現(xiàn)丁酸促進(jìn)ROS在線粒體內(nèi)的積累，并且這種ROS的表達(dá)增多能夠被3-MA抑制，提示丁酸可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自噬。

綜上所述，丁酸通過誘導(dǎo)自噬抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，而線粒體ROS可能是其重要的觸發(fā)機(jī)制。