陳丁雄，朱依青，史建紅，蔡 巖，郝佳潔，王明榮，梁建偉，張 鈺，*

(1．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京 100021；2．國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，結(jié)直腸外科，北京 100021)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是影響人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位居我國惡性腫瘤的第3位和第5位[1]。早期CRC 患者的5年生存率可達90%，但中晚期患者的5 年生存率不足20%[2]。在我國，約60%的CRC 患者確診時已為中晚期，盡管治療方法和手段不斷改善，但晚期患者的5年生存率仍一直徘徊在10%左右[3-4]。目前CRC的病因尚不明確，亟待進一步研究闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機理，為研發(fā)更多有效的靶向藥物提供理論依據(jù)。

DnaJ 熱休克家族成員B6(DnaJ heat shock protein family member B6，DNAJB6)屬于DnaJ熱休克蛋白家族(Hsp40)B 亞族成員，又稱DnaJ 的哺乳動物親屬(mammalian relative of DnaJ，MRJ)。DNAJB6基因定位于染色體7q36.3，可剪接形成3 個轉(zhuǎn)錄本，編碼產(chǎn)生DNAJB6a、DNAJB6b 和DNAJB6d 共3 種蛋白異構(gòu)體。DNAJB6作為輔助伴侶分子，可參與底物蛋白的正確折疊及轉(zhuǎn)運，阻止蛋白質(zhì)異常聚集，調(diào)控蛋白降解及重塑等過程[5]。既往研究顯示DNAJB6功能失調(diào)不僅與多種疾病相關(guān)，在腫瘤發(fā)生進展過程中也發(fā)揮重要作用[6-9]。值得注意的是，DNAJB6的a和b兩個異構(gòu)體的功能存在明顯差異。有研究提示DNAJB6a可發(fā)揮抑癌作用，而DNAJB6b 發(fā)揮促癌作用[10-14]。而且，上述兩個異構(gòu)體的表達具有明顯的組織特異性，在不同類型的腫瘤中變化趨勢也有所不同[9-10]。目前，在腫瘤中的研究多集中于DNAJB6a，DNAJB6b的作用還鮮有報道。

我們在前期研究中通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)分析發(fā)現(xiàn)，DNAJB6 在CRC 組織中表達上調(diào)，其高表達是CRC患者預(yù)后不良的一個獨立預(yù)測因素。同時，功能研究提示DNAJB6 過表達可以顯著增強CRC 細胞的侵襲遷移能力[9]。由于相關(guān)研究提示DNAJB6的異構(gòu)體a和b在表達和功能上存在較大差異，這兩個異構(gòu)體在CRC中的表達變化和功能作用尚需進行深入研究。

在本研究中，我們首先對CRC 組織中DNAJB6 的異構(gòu)體a 和b 的表達改變進行分析，并根據(jù)分析結(jié)果，使用基因表達敲降、Western blot檢測、Transwell侵襲遷移實驗及挽救實驗，探討了CRC組織中異常表達的DNAJB6 異構(gòu)體對CRC 細胞侵襲運動能力的影響及其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

細胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI 1640 和IMDM 購自北京細工生物，胎牛血清購自Newzerum 公司，SDSPAGE 凝膠配制試劑盒購自碧云天生物，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，BCA蛋白定量試劑盒、Opti-MEM 培養(yǎng)基、嘌呤霉素和ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自Thermo Scientific 公司。AKT 和p-AKT(Ser473)抗體購自CST 公司，HA 標簽抗體購自MBL 公司、DNAJB6 和GAPDH 抗體購自Proteintech公司。DMSO購自Sigma公司，BEZ235購自Selleck 公司，Matrigel 和Transwell 細胞培養(yǎng)小室購自Corning 公司。電泳儀購自Bio-Rad 公司，酶標儀購自BioTek Instrument公司，倒置光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司，低溫臺式高速離心機和二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific 公司，化學(xué)發(fā)光成像儀購自Beckman，數(shù)字切片掃描儀購自Hamamatsu公司。

1.2 方法

1.2.1 CRC 腫瘤組織和正常組織mRNA 表達數(shù)據(jù)的獲取在NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE32323的表達矩陣數(shù)據(jù)和探針平臺矩陣數(shù)據(jù)，從中選取17對配對的CRC 腫瘤和癌旁正常組織的mRNA 表達數(shù)據(jù)。利用探針平臺矩陣，獲取DNAJB6a、DNAJB6b對應(yīng)的探針209015_s_at 和208810_at。結(jié)合探針矩陣和表達矩陣，得到DNAJB6 的兩個轉(zhuǎn)錄本DNAJB6a 和DNAJB6b mRNA的表達數(shù)據(jù)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)人胚胎腎細胞293FT、CRC 細胞系DLD-1 和HCT116 購自南京科佰生物，分別使用添加10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(0.1 mg/mL)的DMEM、RPMI 1640和IMDM培養(yǎng)基，于CO2體積分數(shù)為5%的37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。所有細胞系均經(jīng)短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定無誤。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染DNAJB6b特異性的siRNA的靶序列 為：siDNAJB6b-T1，5′-GCACGCACTTAACAGAA AT-3′；siDNAJB6b-T2，5′-GCTCATCGGAGCCTCTA TT-3′。陰性對照siRNA 的靶序列為：5′-TTCTCCGA ACGTGTCACGT- 3′ 。 使 用Opti- MEM 培 養(yǎng) 基 和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染siRNA至CRC細胞，按產(chǎn)品說明書進行操作。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收獲細胞沉淀進行Western blot檢測。

1.2.4 構(gòu)建穩(wěn)定敲降DNAJB6b 表達的CRC 細胞株pLKO.1-shDNAJB6b-puro 和pLKO.1-陰性對照shRNA質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存。shDNAJB6b的靶序列與siDNAJB6b-T1 一致，陰性對照shRNA 的靶序列與陰性對照siRNA一致。在293FT細胞中，使用Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染可表達DNAJB6b shRNA(簡稱shDNAJB6b)或陰性對照shRNA 的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和病毒包裝質(zhì)粒，收集病毒上清感染DLD-1 和HCT116 細胞，使用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細胞株，用于后續(xù)的Western blot分析和挽救實驗。

1.2.5 抑制劑處理在CRC 細胞系DLD-1和HCT116中，使用20 nmol/L的PI3K-mTOR雙重抑制劑BEZ235處理細胞，以溶劑DMSO 處理細胞作為對照。處理24 h后，將各組細胞接種至Transwell上室進行侵襲遷移實驗，上室中的培養(yǎng)基仍含有相應(yīng)的藥物。

1.2.6 挽救實驗在穩(wěn)定敲降DNAJB6b 的DLD-1 和HCT116 細胞中，分別轉(zhuǎn)染組成型活化的myr-AKT 質(zhì)粒和空載質(zhì)粒(方法同siRNA 轉(zhuǎn)染)，陰性對照shRNA組僅轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒，收集各組細胞進行Western blot檢測和Transwell實驗。

1.2.7 Western blot檢測使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液提取分離經(jīng)上述各種實驗處理細胞的總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，按常規(guī)方法進行PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，與AKT、p-AKT(Ser473)、DNAJB6及HA-tag抗體進行雜交并使用ECL 檢測試劑顯示雜交信號，以GAPDH 作為內(nèi)參對照。

1.2.8 Transwell 實驗分為侵襲實驗和遷移實驗。侵襲實驗：將Matrigel 基質(zhì)膠稀釋后鋪于Transwell 小室上室，下室加入含20%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。在上室中接種1.5×105個細胞，培養(yǎng)48 h 后固定染色，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)量。遷移實驗：無需提前在Transwell上室鋪Matrigel 基質(zhì)膠，細胞培養(yǎng)時間為36 h，其余步驟與侵襲實驗一致。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS Statistics 21軟件進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 7 軟件進行圖表制作。使用配對樣本t檢驗分析CRC 腫瘤組織和癌旁正常組織中DNAJB6 不同轉(zhuǎn)錄本mRNA 表達水平的差異；使用獨立樣本t檢驗分析BEZ235 處理組和DMSO對照組CRC細胞侵襲遷移能力的差異；使用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析挽救實驗中各組細胞間侵襲遷移能力的差異，在方差齊性的前提下，使用Turkey-HSD 法進行組間比較。當P＜0.05 時，為組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNAJB6 不同轉(zhuǎn)錄本在結(jié)直腸癌組織中的mRNA表達水平存在差異

從NCBI 的GEO 公共數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE32323的表達矩陣數(shù)據(jù)和探針平臺矩陣數(shù)據(jù)，選取17例手術(shù)切除的配對正常及腫瘤組織，提取DNAJB6a(209015_s_at探針)和DNAJB6b(208810_at探針)的mRNA表達數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，DNAJB6a在CRC組織中的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.458，圖1A)，而DNAJB6b在CRC 組織中的mRNA表達顯著上調(diào)(P＜0.05，圖1B)。

圖1 CRC組織中DNAJB6不同轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達變化情況

2.2 DNAJB6b正向調(diào)控AKT的活性

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，敲降DNAJB6 表達可以顯著降低CRC 細胞的侵襲遷移能力[9]。由于有研究顯示AKT通路異?；罨贑RC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[15-16]，而且我們也發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT-mTOR信號通路在CRC組織中過度活化并與患者的不良預(yù)后顯著正相關(guān)[17]，因此在本研究中我們探討了AKT 異?；罨贒NAJB6b介導(dǎo)的CRC細胞侵襲遷移表型中的作用。首先，我們檢測了DNAJB6b表達水平對AKT活性的影響。我們在DNAJB6b 高表達的兩個CRC 細胞系DLD-1 和HCT116 中，使用兩個獨立的siRNA 特異性敲降DNAJB6b 的表達，發(fā)現(xiàn)瞬時敲降DNAJB6b 的表達可使細胞中p-AKT(Ser473)的水平明顯降低(圖2A、B)。類似地，我們使用慢病毒感染DLD-1 和HCT116細胞，通過病毒載體表達的shRNA穩(wěn)定敲降DNAJB6b的表達，同樣可以觀察到細胞中p-AKT(Ser473)水平的明顯下調(diào)(圖2C、D)。

圖2 敲降DNAJB6b表達后下調(diào)p-AKT的蛋白表達水平

2.3 AKT 通路活化增強結(jié)直腸癌細胞的侵襲遷移能力

為證實AKT 信號通路活化在CRC 細胞系DLD-1和HCT116中對侵襲遷移能力的影響，我們使用PI3KmTOR 雙重抑制劑BEZ235 處理這兩個細胞并進行Transwell 侵襲和遷移實驗。分析結(jié)果顯示，使用BEZ235 處理抑制AKT 通路的活性可導(dǎo)致細胞侵襲遷移能力顯著降低(均為P＜0.01，圖3)。

圖3 抑制AKT通路活性可降低CRC細胞的侵襲遷移能力

2.4 DNAJB6b 可通過激活A(yù)KT 通路增強CRC 細胞的侵襲遷移能力

為進一步證實AKT通路過度活化是否在DNAJB6b介導(dǎo)的侵襲遷移表型中發(fā)揮重要作用，我們進行了挽救實驗。分析結(jié)果顯示，在穩(wěn)定敲降DNAJB6b 的DLD-1 和HCT116 細胞中，通過外源過表達組成型活化的AKT(myr-AKT)上調(diào)p-AKT(Ser473)的水平(圖4)，可以顯著回復(fù)由于敲降DNAJB6b表達所致的細胞侵襲遷移能力降低(圖5)。

圖4 在DNAJB6b 穩(wěn)定敲降及外源myr-AKT 過表達的Western blot檢測結(jié)果

圖5 過表達myr-AKT可逆轉(zhuǎn)DNAJB6b敲降導(dǎo)致的CRC細胞侵襲遷移能力降低

3 討 論

CRC 中DNAJB6 異構(gòu)體的作用尚未見文獻報道。在本研究中，我們分析發(fā)現(xiàn)，與正常癌旁組織相比，CRC組織中DNAJB6的異構(gòu)體DNAJB6b mRNA的表達水平顯著上調(diào)，而DNAJB6a mRNA 的表達無顯著改變。而且，我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，DNAJB6b高表達可通過激活A(yù)KT通路的活性增強CRC細胞的侵襲遷移能力，提示DNAJB6b異常過表達可能在CRC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

以往的研究顯示，DNAJB6 在不同類型的腫瘤組織中表達變化趨勢不同。例如免疫組織化學(xué)(IHC)分析結(jié)果顯示在食管癌、乳腺癌組織中DNAJB6 表達下降，而在肺癌和結(jié)直腸癌中的表達水平升高[9，14，18-21]。然而由于現(xiàn)有商售抗體不能對DNAJB6 的不同異構(gòu)體加以區(qū)分，IHC 分析實際上無法反映單個異構(gòu)體的表達改變。近期，有研究報道，在食管鱗癌中DNAJB6a mRNA 表達水平顯著下調(diào)并發(fā)揮抑癌作用，而DNAJB6b mRNA的表達水平無顯著變化[10]。盡管我們的IHC 分析結(jié)果顯示DNAJB6 在CRC 組織中表達上調(diào)，但Western blot 分析結(jié)果顯示DNAJB6 的異構(gòu)體a和b 在CRC 組織中的表達豐度存在明顯差異[9]。不僅癌組織中DNAJB6b的表達水平明顯高于正常組織，而且DNAJB6b 的表達豐度也遠高于DNAJB6a，提示DNAJB6b可能是在CRC細胞中發(fā)揮功能作用的優(yōu)勢異構(gòu)體。為驗證這一發(fā)現(xiàn)，在本研究中我們對GEO數(shù)據(jù)庫中的mRNA 表達數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)DNAJB6b mRNA 在CRC 組織中表達顯著上調(diào)，而DNAJB6a mRNA 的表達并無明顯改變。而且，使用siRNA 和shRNA特異性地敲降CRC細胞中DNAJB6b的表達，可以顯著抑制CRC 細胞的侵襲遷移能力。上述結(jié)果表明，DNAJB6b 而非DNAJB6a 在CRC 組織中表達上調(diào)，同時提示DNAJB6b過表達在CRC細胞中發(fā)揮促癌作用。

為進一步分析DNAJB6b過表達促進CRC細胞侵襲遷移的分子機制，我們分析了相關(guān)信號通路的表達變化，發(fā)現(xiàn)p-AKT(Ser437)的表達水平在DNAJB6b 敲降細胞中明顯降低。PI3K/AKT信號通路異?；罨诙喾N惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。既往有大量文獻報道，PI3K/AKT 信號通路的活化與CRC 細胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-16]。在本研究中，我們使用PI3K/mTOR 通路雙重抑制劑BEZ235 處理DLD-1 和HCT116細胞，證實AKT通路的活化確實可以增強這兩個CRC細胞系的侵襲遷移能力。進而，我們通過挽救實驗證實，AKT的激活在DNAJB6b過表達介導(dǎo)的CRC細胞侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示DNAJB6b異常過表達在CRC細胞中發(fā)揮促癌作用，而且DNAJB6b可通過正向調(diào)控AKT的活性增強CRC細胞的侵襲遷移能力。同時，本研究結(jié)果提示，DNAJB6b可能作為潛在的分子靶點，用于CRC，特別是轉(zhuǎn)移性CRC 的治療。目前，DNAJB6b調(diào)控AKT活性的具體分子機制還未闡明，也未見到有關(guān)DNAJB6b特異性抑制劑的報道。后續(xù)的研究一方面將深入探索揭示DNAJB6b促癌作用的分子機制，同時需要篩選鑒定DNAJB6b的靶向抑制劑并探索聯(lián)合靶向治療策略。