張 鈞 宋國智 常 成

低級別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma，LGG）是顱內(nèi)常見的原發(fā)性腫瘤，腫瘤生物學(xué)行為表現(xiàn)出很大的內(nèi)在異質(zhì)性[1]。目前，手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療是LGG 的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[2]，已取得一定的進(jìn)展，但仍存在腫瘤耐藥以及腫瘤復(fù)發(fā)等問題，部分LGG 會發(fā)展為高級別膠質(zhì)瘤[3，4]。靶向治療是目前最有前景的腫瘤治療選擇之一，新型靶向生物標(biāo)記物的是LGG 研究的熱點(diǎn)。溶質(zhì)載體家族（solute carrier，SLC）是目前發(fā)現(xiàn)的最大的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在各種物質(zhì)（包括營養(yǎng)物質(zhì)、離子、代謝物和藥物）跨生物膜的交換中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。溶質(zhì)載體家族12成員5（solute carrier family 12 member 5，SLC12A5）是SLC成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，SLC12A5 促進(jìn)膀胱尿路上皮癌進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[5，6]；還與卵巢癌、結(jié)腸癌進(jìn)展有關(guān)[7～9]。本文探討SLC12A5 在LGG 中的表達(dá)及臨床意義，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫GEPIA數(shù)據(jù)庫含來自TCGA和GTEx 項(xiàng)目的9 736 個(gè)腫瘤和8 587 個(gè)正常樣本的RNA 測序數(shù)據(jù)[10]。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫的“Expression DIY”塊分析SLC12A5在LGG中的表達(dá)。此外，“survival”模塊根據(jù)基因表達(dá)進(jìn)行總生存期（over survival，OS）或無病生存期（disease-free survival，DFS）分析。本文將根據(jù)SLC12A5的表達(dá)中位值分為高表達(dá)和低表達(dá)，應(yīng)用Kaplan-Meier 生存曲線分析SLC12A5表達(dá)與OS、DSS的關(guān)系。另外，GEPIA數(shù)據(jù)庫的“similar Genes”模塊用于獲取與SLC12A5 相關(guān)性最強(qiáng)的50個(gè)基因，用于后續(xù)進(jìn)行功能富集分析。

1.2 相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建GeneMANIA（http://genemania.org）是一個(gè)開放的、用戶友好在線數(shù)據(jù)庫。在該數(shù)據(jù)庫中提交一個(gè)基因，GeneMANIA 會使用大量基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)查找功能相似的基因并生成基因互作網(wǎng)絡(luò)圖[11]。STRING 數(shù)據(jù)庫收集、評分和整合所有公開可用的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息來源，并通過計(jì)算預(yù)測來補(bǔ)充這些信息，目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)一個(gè)全面客觀的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[12]。本文分別利用GEMEMANIA 和STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建SLC12A5 的基因互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。韋恩圖在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）用于獲取兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的交集基因。

1.3 Metascape 數(shù)據(jù)庫 Metascape 數(shù) 據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一個(gè)基于web 的門戶，提供全面的基因列表注釋和分析資源，具有Metascape 功能富集、交互分析、基因注釋和成員搜索等功能[13]。本文利用該數(shù)據(jù)庫對SLC12A5及其前50 個(gè)相關(guān)性最強(qiáng)的基因進(jìn)行功能注釋和通路預(yù)測。具體參數(shù)設(shè)置為：Min Overlap:3；P Value Cutoff:0.01；Min Enrichment:1.5。

1.4 NetworkAnalyst數(shù)據(jù)庫NetworkAnalyst是一個(gè)功能強(qiáng)大且用戶友好的生物信息學(xué)工具，用于基因表達(dá)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、可視化和基于網(wǎng)絡(luò)的元分析。本文應(yīng)用NetworkAnalyst 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）-miRNA-基因的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2 結(jié)果

2.1 SLC12A5 在LGG 中表達(dá)變化GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常對照組相比，SLC12A5在LGG中顯著低表達(dá)（圖1A）。Kaplan-Meier 生存曲線顯示SLC12A5 低表達(dá)組OS 和DFS 較高表達(dá)組均明顯縮短（圖1B、1C）。

圖1 低級別膠質(zhì)瘤SLC12A5的表達(dá)

2.2 SLC12A5 相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基因互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，SLC12A5主要與絲氨酸/蘇氨酸激酶39（serine/threonine kinase 39，STK39）、SLC12A7、SLC12A6、SLC12A4、SLC12A3、SLC12A9、SLC12A1、SLC12A2、 CKB、 SLC12A8、 ATP2B2、 GPM6A、KCNC1、TRIM9、RTN1、KCNIP4、DGUOK、SV2B、CDC14A 以及GABRB2 等具有存在相關(guān)關(guān)系（圖2A）。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示，SLC12A5 主要與BDNF、EGR4、GABRA1、GABRG2、GABRR3、GAD1、GAD2、GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、GLRB、NLGN2、NTRK2、PPIL4、PVALB、SLC32A1、STK39、WNK1以及WNK3等蛋白存在相關(guān)關(guān)系（圖2B）?；蚧プ骶W(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的交集分析顯示，SLC12A5均與STK39存在相互作用（圖2C）。

圖2 GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建SLC12A5相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 SLC12A5 的共表達(dá)分析和功能富集分析 基因共表達(dá)分析顯示，SLC12A5主要與SYN1、TPR、SNCB以及MAPK8IP2 基因存在較強(qiáng)的相關(guān)性（圖3A～D）。功能富集分析，SLC12A5 及其共表達(dá)基因主要參與化學(xué)突觸傳遞、突觸小泡周期、認(rèn)知、細(xì)胞連接組織、突觸小泡回收以及體液水平的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程（圖3E）。

圖3 Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SLC12A5的共表達(dá)分析和功能富集分析

2.4 TF-miRNA-SLC12A5 共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建NetworkAnalyst 數(shù)據(jù)庫分析顯示，XBP1、USF1、TCF3、REST、PPARG、MZF、MEF2A、CREB、CEBPB、ARNT可能是調(diào)控SLC12A5表達(dá)的潛在TF；而SLC12A5的潛在上游miRNA 包括：hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsalet-7d、hsa-let-7e、hsa-miR-124、hsa-miR-1271、hsa-miR-130a、hsa-miR-130b、hsa-miR-137、hsamiR-139-5p、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsamiR-181c、hsa-miR-181d、hsa-miR-185、hsa-miR-191、hsa-miR-224、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsamiR-301a、hsa-miR-301b、hsa-miR-32、hsa-miR-33、hsa-miR-340、hsa-miR-363、hsa-miR-367、hsamiR-423-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-454、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-494、hsa-miR-506、hsa-miR-543、hsa-miR-624、hsa-miR-663、hsa-miR-760、hsamiR-766、hsa-miR-874、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-9、hsa-miR-92、hsa-miR-92b、hsa-miR-937、hsamiR-940、hsa-miR-96以及hsa-miR-98。

圖4 NetworkAnalyst 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子-miRNASLC12A5共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有較高的病死率和復(fù)發(fā)率，其中LGG 可以演變?yōu)楦呒墑e膠質(zhì)瘤并對化療產(chǎn)生耐藥性，這成為多數(shù)膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的重要原因之一[1～4]。靶向治療在多種惡性腫瘤中的治療中顯示出了其獨(dú)特優(yōu)越性。本文結(jié)果顯示SLC12A5 可能是LGG 潛在的靶向生物標(biāo)記物。首先，本文GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SLC12A5 在LGG組織中顯著低表達(dá)；其次，生存分析結(jié)果顯示SLC12A5 低表達(dá)組OS 和DFS 明顯縮短。這表明SLC12A5 在LGG 中可能發(fā)揮抑癌因子的作用，SLC12A5表達(dá)越低，臨床預(yù)后越差。然后，在基因水平和蛋白水平分別構(gòu)建了SLC12A5的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)SLC12A5 與STK39 可能存在功能聯(lián)系。STK39已被證實(shí)在包括腎細(xì)胞癌、骨肉瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌等多種人類惡性腫瘤發(fā)揮重要作用[14～17]。接著，我們篩選了SLC12A5在LGG中的前50個(gè)相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SYN1、TPR、SNCB以及MAPK8IP2與SLC12A5的相關(guān)性最強(qiáng)。Yucebas 等[18]證實(shí)SYN1在人類膠質(zhì)瘤中顯著下調(diào)，且其低表達(dá)模式可能維持癌癥干細(xì)胞樣表型，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。TPR 在維持人膠質(zhì)瘤的惡性表型中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是膠質(zhì)瘤的新型潛在治療藥物靶點(diǎn)[19]。Fung 等[20]發(fā)現(xiàn)SNCB可作為膠質(zhì)瘤的生物標(biāo)記物，參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，我們推測SLC12A5 可能與STK39、SYN1、TPR、SNCB 以及MAPK8IP2 相互作用共同參與LGG的發(fā)生、發(fā)展。本文功能分析顯示，SLC12A5及其共表達(dá)基因主要參與化學(xué)突觸傳遞、突觸小泡周期、認(rèn)知、細(xì)胞連接組織、突觸小泡回收以及體液水平的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。這些機(jī)制可作為理解SLC12A5 調(diào)控LGG 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)。最后，我們構(gòu)建了TF-miRNA-SLC12A5 共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，希望后續(xù)能為研究SLC12A5的上下游分子提供思路。

總之，本文發(fā)現(xiàn)SLC12A5 具有作為LGG 的預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)的潛力。由于缺乏病人的相關(guān)臨床信息，未能充分分析SLC12A5 表達(dá)與病人臨床病理特征的相關(guān)性，所以，本文僅僅基于生物信息學(xué)方法分析的結(jié)果，需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。