袁德麗,周 清，傅曉冬

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，四川 瀘州 646000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes，GDM)是妊娠期常見疾病，血糖升高不僅會(huì)導(dǎo)致圍生期母嬰不良結(jié)局，還會(huì)導(dǎo)致子代成年后代謝紊亂，給孕婦及子代造成嚴(yán)重影響[1-2]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是GDM主要的發(fā)病機(jī)制，尋找IR相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)改善母嬰結(jié)局和子代成年后代謝紊亂具有重要意義[3]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的非編碼RNA。近年研究表明，miRNAs在胰島素合成、分泌、信號(hào)傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用[4]。李偉等[5]通過分析GDM患者與健康孕婦胎盤組織中差異性表達(dá)miRNAs發(fā)現(xiàn)，miR-372-3p在GDM患者胎盤組織中呈高表達(dá)。但miR-372-3p是否參與GDM患者IR尚不明確。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)為協(xié)助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白質(zhì)，其表達(dá)下調(diào)可降低胰島素敏感性，導(dǎo)致IR[6]。為進(jìn)一步明確miR-372-3p、GLUT4在GDM發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究分析了GDM患者血清中miR-372-3p和GLUT4水平的變化及二者與IR的關(guān)系，以期為GDM發(fā)病機(jī)制的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年8月至2021年1月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的42例GDM患者為GDM組，另選擇同期42名健康妊娠婦女為對(duì)照組。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《妊娠合并糖尿病診治指南(2014)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)單胎、頭位；(3)孕24～28周；(4)臨床資料完整者；(5)近期未接受降糖治療者；(6)孕婦及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并妊娠期高血壓等其他妊娠并發(fā)癥者；(2)自身免疫性疾病者；(3)急性炎癥期者；(4)惡性腫瘤者；(5)繼發(fā)性糖尿病者；(6)重要器官功能損傷者。對(duì)照組：年齡24～38(30.54±4.65)歲，孕前體質(zhì)量指數(shù)18～26(22.44±1.47) kg·m-2，孕24～28(26.11±1.18)周；孕次： 1次13例，≥2次29例；產(chǎn)次： 0次17例，≥1次25例。GDM組：年齡24～38(29.51±4.25)歲，孕前體質(zhì)量指數(shù)18～26(22.51±1.56) kg·m-2，孕24～28(26.14±1.20)周；孕次： 1次11例，≥2次31例；產(chǎn)次： 0次16例，≥1次26例。2組孕婦年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)、孕周、孕次及產(chǎn)次比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 2組受試者代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)采集GDM組患者入院后次日和對(duì)照組受試者體檢時(shí)靜脈血6 mL，3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液，置于-80 ℃環(huán)境中保存。使用 BS-450 全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司)檢測(cè)2組受試者血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)水平。采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)2組受試者空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平，放射免疫法檢測(cè)2組受試者空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，葡萄糖耐量試驗(yàn)檢測(cè)2組受試者餐后2 h血糖(2 h blood glucose，2 h BG)水平。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistance index,HOMA-IR)和HOMA胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA beta-cell function index,HOMA-β)；HOMA-IR=FBG(mmol·L-1)×FING(mIU·L-1)/22.5，HOMA-β=20×FING(mIU·L-1)/[FBG(mmol·L-1)-3.5][8]。

1.2.2 2組受試者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量及GLUT4水平檢測(cè)應(yīng)用TRIzol總RNA抽提試劑盒(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司)提取血清總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證完整性。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海研卉生物科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃ 冰箱中保存。參照實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(上海易匯生物科技有限公司)說明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)體系:10.0 μL SYBR Premix Ex Taq、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、0.4 μL ROX Reference Dye、2.0 μL cDNA模板、6.8 μL RNase-free雙蒸水；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)40次。miR-372-3p上游引物序列為 5′-AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGUGC-3′，下游引物序列為5′-UCAAAUGUCGCAGCACUUUUU-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量。采用酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒購自上海梵態(tài)生物科技有限公司)檢測(cè)血清中GLUT4水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量及GLUT4水平比較結(jié)果見表1。GDM組患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，GLUT4水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組受試者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量及GLUT4水平比較

2.2 2組受試者代謝相關(guān)指標(biāo)比較結(jié)果見表2。GDM組患者FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR顯著高于對(duì)照組，HOMA-β顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 2組受試者代謝相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 GDM組患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量及GLUT4水平與代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性結(jié)果見表3。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，GDM組患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量與FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR 呈正相關(guān)，與GLUT4水平及HOMA-β 呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；GLUT4水平與FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，與HOMA-β呈正相關(guān)(P<0.05)。

表3 GDM組患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量及GLUT4水平與代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 GDM組患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量及GLUT4水平與HOMA-IR的關(guān)系多元線性回歸分析結(jié)果見表4。以血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量、GLUT4水平為自變量，HOMA-IR為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，未校正其他因素時(shí)，血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量與HOMA-IR呈獨(dú)立正相關(guān)，GLUT4水平與HOMA-IR呈獨(dú)立負(fù)相關(guān)(P<0.05)；校正年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)、孕周、孕次、產(chǎn)次等指標(biāo)后，血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量與HOMA-IR 呈獨(dú)立正相關(guān)，GLUT4水平與HOMA-IR呈獨(dú)立負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表4 GDM組患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量及GLUT4水平與HOMA-IR相關(guān)性多元線性回歸分析結(jié)果

3 討論

GDM為危害孕婦和圍生兒生命健康的常見妊娠期合并癥，高血糖狀態(tài)下可對(duì)孕婦和新生兒產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響，包括死胎、胎兒畸形、早產(chǎn)兒、巨大兒、新生兒高膽紅素血癥等，威脅孕婦和新生兒生命健康，因此，了解GDM發(fā)生發(fā)展病理機(jī)制具有重要意義。目前研究認(rèn)為，IR、胰島分泌功能障礙、遺傳易感性等均可能參與GDM的發(fā)生，其中IR為GDM的主要病理基礎(chǔ)，妊娠狀態(tài)下為確保以葡萄糖為主要形式的能量滿足胎兒生長發(fā)育所需，母體會(huì)出現(xiàn)生理性IR，同時(shí)胰島β細(xì)胞也會(huì)代償性增加胰島素分泌，但若IR過重和(或)胰島β細(xì)胞代償不足，則會(huì)引起GDM[3,9]。

miRNAs是一類由19～24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，在生物體中廣泛存在，主要通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)的堿基互補(bǔ)結(jié)合，來抑制靶基因mRNA翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的功能[10]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，miRNAs在婦產(chǎn)科領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，已有研究證實(shí)其可通過IR、脂肪因子、胰島素分泌異常等途徑參與GDM的發(fā)生和發(fā)展[11]。miR-372-3p位于人染色體19q13.42，既往有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血清中miR-372-3p表達(dá)顯著上調(diào)，為2型糖尿病發(fā)病獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。李偉等[5]研究證實(shí)，miR-372-3p參與GDM的發(fā)生，但其在GDM中的作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，GDM組患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，與既往報(bào)道[5]一致；GDM組患者FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR 顯著高于對(duì)照組，HOMA-β顯著低于對(duì)照組，說明GDM患者存在明顯IR，胰島β細(xì)胞功能受損，血糖血脂代謝紊亂。GDM患者因IR導(dǎo)致葡萄糖攝取和利用率降低，機(jī)體代謝紊亂也會(huì)影響血糖代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，與非GDM孕婦相比，GDM患者患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)可增加1.98倍(95%可信區(qū)間為1.57～2.50)，即使未發(fā)展為2型糖尿病，未來發(fā)生心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加1.56倍[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，GDM組患者血清中 miR-372-3p 相對(duì)表達(dá)量與FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR呈正相關(guān)，與HOMA-β呈負(fù)相關(guān)，說明血清中miR-372-3p水平不僅與GDM患者IR相關(guān)，還與血糖、血脂代謝紊亂相關(guān)，提示miR-372-3p可能參與了GDM患者IR過程。本研究多元線性回歸分析結(jié)果表明，IR隨著血清miR-372-3p水平升高而加重，但關(guān)于miR-372-3p在IR中的機(jī)制尚不明確。

研究表明，骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙為IR的主要原因[14]。GLUT4是協(xié)助骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白質(zhì)。有研究表明，進(jìn)食或運(yùn)動(dòng)后，GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖效率可提升1 040倍，以滿足餐后血液中糖轉(zhuǎn)運(yùn)或向骨骼肌細(xì)胞提供能量[15-16]。曲曉潔等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠敲除GLUT4基因后出現(xiàn)明顯葡萄糖耐量減退和IR。STANIROWSKI等[18]研究也顯示，GDM患者胎盤組織中GLUT4表達(dá)和活性明顯降低。本研究中，GDM組患者血清中GLUT4水平顯著低于對(duì)照組，且其與FBG、FINS、2 h BG、TC、TG水平及HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，與HOMA-β呈正相關(guān)，說明GLUT4參與了GDM患者的IR過程；多元線性回歸分析在校正其他因素后發(fā)現(xiàn)，GLUT4水平仍與HOMA-IR呈獨(dú)立負(fù)相關(guān)，說明IR隨著GLUT4水平降低而加重。原因可能為GDM患者發(fā)生IR后抑制了GLUT4的轉(zhuǎn)位功能，不能較好地協(xié)助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致IR進(jìn)一步加重。本研究結(jié)果還顯示，GDM患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量與GLUT4水平呈負(fù)相關(guān)。有研究通過Mireap軟件預(yù)測(cè)miR-372-3p靶基因發(fā)現(xiàn)，GLUT4與miR-372-3p存在靶向關(guān)系，雙熒光素酶基因報(bào)告證實(shí)二者為負(fù)向調(diào)控關(guān)系，抑制miR-372-3p可增強(qiáng)GLUT4表達(dá)，促進(jìn)IR細(xì)胞糖代謝[19-20]。

綜上所述，GDM患者血清中miR-372-3p相對(duì)表達(dá)量顯著升高，GLUT4水平顯著降低，且二者與IR獨(dú)立相關(guān)，可作為GDM重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。但本研究樣本量較小，尚需多中心大樣本研究證實(shí)。